Method Article

استخدام الموائع الدقيقة والمجهر الفلوري لدراسة ديناميكيات تجميع خيوط وحزم الأكتين المفردة

DOI:

10.3791/63891

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم بروتوكولات لفحوصات الموائع الدقيقة البسيطة لخيوط الأكتين ، بالاشتراك مع الفحص المجهري الفلوري ، والتي تسمح للمرء بمراقبة خيوط الأكتين الفردية بدقة في الوقت الفعلي مع تعريضها بالتتابع لحلول البروتين المختلفة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل فك رموز الآليات الجزيئية المعقدة التي تنظم تجميع وتفكيك خيوط الأكتين ، يعد من الأصول العظيمة مراقبة التفاعلات الفردية التي تعيش في ظروف يتم التحكم فيها بشكل جيد. للقيام بذلك ، ظهرت تجارب حية أحادية الخيط على مدى السنوات ال 20 الماضية ، معظمها باستخدام المجهر الفلوري الداخلي الكلي للانعكاس (TIRF) ، وقدمت مجموعة من النتائج الرئيسية. في عام 2011 ، من أجل توسيع إمكانيات هذه التجارب وتجنب القطع الأثرية الإشكالية المتكررة ، أدخلنا الموائع الدقيقة البسيطة في هذه المقاييس. تفصل هذه الدراسة بروتوكولنا الأساسي ، حيث يتم تثبيت خيوط الأكتين الفردية بواسطة طرف واحد على سطح الغطاء المخمل ، وتتماشى مع التدفق ، ويمكن أن تتعرض على التوالي لمحاليل البروتين المختلفة. كما نقدم بروتوكولات لتطبيقات محددة ونشرح كيف يمكن تطبيق القوى الميكانيكية التي يتم التحكم فيها ، وذلك بفضل السحب اللزج للمحلول المتدفق. نسلط الضوء على المحاذير التقنية لهذه التجارب ونقدم بإيجاز التطورات المحتملة بناء على هذه التقنية. هذه البروتوكولات والتفسيرات، جنبا إلى جنب مع توافر اليوم من معدات الموائع الدقيقة سهلة الاستخدام، ينبغي أن تسمح لغير المتخصصين بتنفيذ هذا الفحص في مختبراتهم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التحكم في تجميع وتفكيك خيوط الأكتين وشبكات خيوط الأكتين بواسطة العديد من التفاعلات الكيميائية الحيوية وتعتمد على السياق الميكانيكي. من أجل اكتساب نظرة ثاقبة على هذه الآليات المعقدة ، من غير القيم أن تكون قادرا على مراقبة ردود الفعل الفردية على الخيوط الفردية (بأعداد كبيرة بما فيه الكفاية). على مدى العقود الماضية ، ظهرت مراقبة خيوط الأكتين الديناميكية في الوقت الفعلي ، ومعظمها باستخدام الفحص المجهري الكلي للتألق الداخلي للانعكاس (TIRF) ، كتقنية رئيسية وقدمت قائمة رائعة من النتائج التي لم يكن من الممكن الحصول عليها باستخدام المقايسات الكيميائية الحيوية للمحلول السائب1.

لتحقيق ذلك ، يحتاج المرء إلى الحفاظ على خيوط ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد غرفة الموائع الدقيقة

  1. حدد قالب رئيسي SU-8 مع العديد من أنماط الغرفة. الغرف النموذجية متقاطعة الشكل مع ثلاثة مداخل ومنفذ واحد ، بارتفاع 20 ميكرومتر وعرض 800 ميكرومتر (الشكل 1). يمكن شراء هذه القوالب الرئيسية من شركات خارجية أو صنعها في مختبرات أكاديمية (على سبيل المثال ، Gicquel ، Y. et al.5).
  2. ضع الشريط حول حافة القالب.
    1. ضع شريطا مكتبيا شفافا قياسيا بطول 50 سم وعرضه 19 مم (انظر جدول المواد) على مقعد ، جانب لزج لأعلى. ضع القالب عموديا في أحد طرفيه وعلى طول خط الوسط للشريط.
    2. لف القالب إلى الطرف الآخر من الشريط لإنشاء حد 1 سم حول القالب. قم ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة لجميع التجارب الموصوفة أعلاه ، يجب أن تكون خيوط الأكتين المصنفة بالفلورسنت مرئية بوضوح ، مع تباين جيد ، مما يدل على التألق المنخفض للخلفية من السطح (الشكل 4 ، انظر الملف التكميلي 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للمشكلات الشائعة). يجب ألا تلتصق خيوط الأكتين أيضا بالسطح: عندما يكون معدل التدفق السائد منخفضا ، يجب أن تكون التقلبات الجانبية لخيوط الأكتين محسوسة عند مراقبتها حية والسماح للمرء بتحديد بوضوح أنها مثبتة بأحد نهاياتها فقط. وبالمثل ، عند استخدام تصوير TIRF ، يجب أن.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالمقارنة مع الطرق القياسية أحادية الخيط حيث يتم تثبيت خيوط الأكتين على السطح بواسطة نقاط متعددة على طولها أو الحفاظ عليها بالقرب منه بواسطة عامل ازدحام مثل ميثيل السليلوز ، توفر الموائع الدقيقة عددا من المزايا. نظرا لأن التفاعلات مع السطح ضئيلة ، فإن التوقفات الاصطناعية التي يمكن أن تحدثها هذه التفاعلات أثناء كل من الاستطالة وإزالة البلمرة يتم تجنبها. يتم محاذاة الخيوط بواسطة التدفق ، بالتوازي مع بعضها البعض ، مما يسهل مراقبتها وقياس أطوالها. يتم تجديد المحلول حول الخيوط باستمرار ، مما يعرضها لتركيزات البروتين الثابتة. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون ل B. Ladoux و R.-M. مختبر Mège لاستخدام معدات التنظيف بالأشعة فوق البنفسجية الخاصة بهم ، و J. Heuvingh و 0. دو روور للتدريب الأولي الذي تلقيناه على إعداد القوالب على رقائق السيليكون وتقديم نصائح حول الموائع الدقيقة. نحن نقر بالتمويل المقدم من منحة مجلس البحوث الأوروبي StG-679116 (إلى A.J.) والوكالة الوطنية للبحث العلمي Muscactin و Conformin (إلى G.R.-L).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
>-CaseinMerckC6905يستخدم عند 8 مجم / مل
لكمة خزعة (مع مكبس)تيد بيلا15115-2معرف 0.75 مم ، OD 1.07 مم
بيوتين-BSAMerckA8549مستخدم عند 1 مجم / مل
BSAMerckA8022يستخدم في 50 مجم / مل
صغير رف
حامل تفلون		InvitrogenC14784ل 8 أغطية
أغطية 22x40mm
سمك # 1.5		Menzel Gl & auml; ser631-1370
DABCOMerckD27802في مكون f-buffer
DTTEuromedexEU0006-Dفي f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488InvitrogenA20000Fluorophore لوضع العلامات على الأكتين على Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo Scientific21338لبيوتينيلات الأكتين على Lys328
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507منظف تنظيف الزجاج
ImageJNIHN / Aبرنامج مفتوح المصدر
LaboportKNF811kn.18مضخة تفريغ (الفراغ النهائي: 240 ملي بار)
الشريط السحري غير المرئيسكوتش7100024666شريط مكتب شفاف قياسي
MicrewtubeSimportT341-6T2 مل أنابيب خزان الموائع الدقيقة جهاز
Microfluidic الجزء 1: وحدة التدفق SFluigentFLU-S-D-PCKB
جهاز Microfluidic الجزء 2: Fluiwell-4C-2 ملFluigent14002001PCKحامل الخزان
جهاز Microfluidic الجزء 3: MFCS-EZFluigentEZ-11000001
EZ-00345001		وحدة التحكم في الضغط
موديل 42 - UVO-CleanerJelight Inc.42-220منظف الأشعة فوق البنفسجية
N6- (6-Aminohexyl) -ATP-ATTO-488Jena BioscienceNU-805-488ATP-ATTO يستخدم لتسمية الأكتين
نيوترافيدينThermo Scientific31000
PLL-PEGSuSoSPLL (20) -g [3.5] - PEG (2)استخدم عند 1 مجم / مل في PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon ElastomerDow Corning1673921يحتوي على قاعدة PDMS وعامل معالجة
أنابيب Polyetheretherketone (PEEK)MerckZ226661" أزرق" معرف = 0.25 مم
مسدس نفخ أمانCoilhose Pneumatics700-Sأنابيب سيليكون الهواء المصفى
VWR228-0701Pقم بتوصيل نظرة خاطفة بمقرنة مقرنة
قسطرة من الفولاذ المقاوم للصدأPrime BioscienceSC22 / 15يتم إدخالها في مداخل ومخرج PDMS للاتصال بأنابيب PEEK
فيلم لدن بالحرارةSigma AldrichPM996قياسي "بارافيلم"
الإيثانول فائق النقاءVWR 64-17-5
حمام التنظيف بالموجات فوق الصوتيةVWRUSC200THلاستيعاب أكواب 1 لتر
مجفف الفراغSP Bel-ArtF42022-0000لإزالة PDMS أو الحلول
غطاء مكون

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Filament AssemblyMicrofluidics AssayFluorescence MicroscopyTIRF MicroscopyActin BundlesFilament PolymerizationFilament DepolymerizationSurface PassivationActin Binding ProteinsMechanical Forces

Related Articles