الطحن الدقيق للتحكم العددي بالكمبيوتر لجهاز أكريليك الموائع الدقيقة مع تقييد متداخل للمقايسات المناعية المغناطيسية القائمة على الجسيمات النانوية

José A. Hernández-Ortiz; Pablo E. Guevara-Pantoja; Mariana Andrade-Medina; Mauricio Carrillo-Tripp; Gabriel  A. Caballero-Robledo

doi:10.3791/63899

Method Article

الطحن الدقيق للتحكم العددي بالكمبيوتر لجهاز أكريليك الموائع الدقيقة مع تقييد متداخل للمقايسات المناعية المغناطيسية القائمة على الجسيمات النانوية

DOI:

10.3791/63899

⸱

June 23rd, 2022

José A. Hernández-Ortiz¹ , Pablo E. Guevara-Pantoja¹ , Mariana Andrade-Medina¹^,² , Mauricio Carrillo-Tripp¹^,² , Gabriel A. Caballero-Robledo¹

¹Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (Cinvestav), ²Biomolecular Diversity Laboratory, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (Cinvestav)

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الموائع الدقيقة هي أداة قوية لتطوير الاختبارات التشخيصية. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى معدات ومواد باهظة الثمن ، بالإضافة إلى تقنيات التصنيع والمناولة الشاقة. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول تصنيع جهاز الموائع الدقيقة الأكريليك للمقايسات المناعية المغناطيسية الدقيقة والجسيمات النانوية في بيئة منخفضة التكلفة وسهلة الاستخدام.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حسنت أنظمة الموائع الدقيقة تقنيات المقايسة المناعية بشكل كبير. ومع ذلك ، تتطلب العديد من تقنيات التصنيع الدقيق معدات متخصصة أو باهظة الثمن أو معقدة ، مما يجعل التصنيع مكلفا وغير متوافق مع الإنتاج الضخم ، وهو أحد أهم الشروط المسبقة لاختبارات نقطة الرعاية (POCT) التي يجب اعتمادها في البيئات منخفضة الموارد. يصف هذا العمل عملية تصنيع جهاز أكريليك (بولي ميثيل ميثاكريلات، PMMA) لاختبار المقايسة المناعية الأنزيمية المترافقة بالجسيمات النانوية باستخدام تقنية الطحن الدقيق للتحكم العددي بالحاسوب (CNC). يظهر عمل جهاز الموائع الدقيقة من خلال إجراء اختبار مناعي للكشف عن جسم مضاد تجاري باستخدام الليزوزيم كمستضد نموذجي مترافق مع جسيمات نانوية مغناطيسية 100 نانومتر. يدمج هذا الجهاز قيدا ماديا متداخلا يبلغ ارتفاعه 5 ميكرومتر فقط ، ويستخدم لالتقاط الجسيمات الدقيقة المغناطيسية التي تشكل مصيدة مغناطيسية عن طريق وضع مغناطيس خارجي. وبهذه الطريقة ، تكون القوة المغناطيسية على الدعم المناعي للجسيمات النانوية المترافقة كافية لالتقاطها ومقاومة سحب التدفق. جهاز الموائع الدقيقة هذا مناسب بشكل خاص للإنتاج الضخم منخفض التكلفة دون فقدان الدقة لأداء المقايسة المناعية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة ، لعبت الموائع الدقيقة دورا مهما في تقنيات المقايسة المناعية¹. تتميز تقنية التصغير بالعديد من المزايا البارزة مقارنة بالمقايسات المناعية التقليدية ، مثل تقليل استهلاك العينات والكواشف ، وأوقات الحضانة الأقصر ، وتبادل الحلول بكفاءة ، والتكامل العالي والأتمتة².

علاوة على ذلك ، فإن أنظمة الموائع الدقيقة في المقايسات المناعية ، بالاشتراك مع الجسيمات النانوية المغناطيسية كدعم مناعي ، تقلل بشكل كبير من أوقات الحضانة ، مما يحقق حساسية عالية للكشف بسبب زيادة نسبة السطح إلى الحجم³. تعمل الحركة البراونية للجزيئات على تحسين حركية التفاعل أثناء تكوين مجمع الأجسام المضادة^{للمستضد} ^4,5. علاوة على ذلك ، توفر الخصائص المغناطيسية للجسيمات النانوية تنوعا ليتم دمجها في تكوينات مختلفة لأجهزة الموائع الدقيقة ، مما يجعلها مرشحا مثاليا للإشارة والتقاط الجزيئات في أنظمة الاستشعار الحيوي المصغرة على الرقاقة⁵. ومع ذلك ، فإن القوى المغناطيسية أضعف بكثير من قوى السحب على مقياس النانومتر بسبب ارتفاع نسبة السطح إلى الحجم⁶. لذلك ، قد يكون التقاط الجسيمات النانوية لخطوات المقايسة المناعية الحاسمة مثل الغسيل والكشف أمرا صعبا ، والمغناطيس التقليدي غير كاف⁴.

طريقة فعالة لمعالجة الجسيمات النانوية هي استخدام مصيدة مغناطيسية موائع دقيقة تتكون من جزيئات الحديد الدقيقة ، والتي يتم تعبئتها في بنية الموائع الدقيقة³. لذلك ، عندما يقترب مغناطيس خارجي ، يتم إنشاء تفاعل معقد داخل الوسط المسامي الممغنط بين القوى المغناطيسية وقوى التدفق. القوة المغناطيسية المؤثرة على الجسيمات النانوية قوية بما يكفي لالتقاطها ومقاومة سحب التدفق³،⁴^،⁷. يتطلب هذا النهج تقنيات التصنيع الدقيق التي تحقق قرارات في حدود بضعة ميكرومترات لتوليد هياكل ميكرومترية تحتفظ بالجسيمات الدقيقة.

تسمح تقنيات التصنيع الدقيق الحالية بتصنيع الهياكل عالية الدقة من بضعة ميكرونات إلى مئات النانومتر⁸. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه التقنيات تتطلب معدات متخصصة أو باهظة الثمن أو معقدة. تتمثل إحدى الصعوبات الرئيسية في الحاجة إلى غرفة أبحاث لتصنيع القوالب ، والتي لا تزال مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ^8,9. في الآونة الأخيرة ، تغلب مهندسو الموائع الدقيقة على هذا العيب من خلال تطوير مجموعة متنوعة من طرق التصنيع البديلة ، مع مزايا مختلفة مثل انخفاض التكاليف ، وأوقات التسليم الأسرع ، والمواد والأدوات الأرخص ، وزيادة الوظائف⁸. وبهذه الطريقة ، أدى تطوير تقنيات التصنيع الدقيق الجديدة إلى جلب طرق منخفضة التكلفة وغير غرف الأبحاث تحقق دقة منخفضة تصل إلى 10 ميكرومتر⁸. يمكن استخدام الزخرفة مباشرة على الركيزة دون إنشاء نمط صب باهظ الثمن ، وبالتالي تجنب عملية تستغرق وقتا طويلا. تشمل طرق التصنيع المباشر الطحن باستخدام الحاسب الآلي والاجتثاث بالليزر والطباعة الحجرية المباشرة⁸. كل هذه الطرق مناسبة لإنتاج قنوات ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية في مجموعة واسعة من المواد ، بغض النظر عن صلابتها⁹ ، مما يتيح هندسة وسلوكيات فيزيائية وصفات جديدة ومفيدة في أجهزة الموائع الدقيقة⁸.

يقوم الطحن الدقيق CNC بإنشاء هياكل مجهرية باستخدام أدوات القطع التي تزيل المواد السائبة من الركيزة وهي طريقة تصنيع فعالة لأجهزة الموائع الدقيقة^10,11. يمكن أن تكون تقنية micromilling مفيدة في تطبيقات الموائع الدقيقة لإنشاء قنوات وميزات دقيقة مباشرة على سطح العمل ، مما يوفر ميزة رئيسية: يمكن تصنيع قطعة العمل في وقت قصير (أقل من 30 دقيقة) ، مما يقلل بشكل كبير من وقت الاستجابة من التصميم إلى النموذج الأولي¹². بالإضافة إلى ذلك ، فإن التوافر الواسع لملحقات القطع من مختلف المواد والأحجام والأشكال يجعل آلات الطحن CNC أداة مناسبة سمحت بتصنيع ميزات مختلفة في العديد من أنواع المواد منخفضة التكلفة التي تستخدم لمرة واحدة¹³.

من بين جميع المواد المستخدمة بشكل شائع في الطحن الدقيق ، تظل اللدائن الحرارية خيارا رائدا نظرا لخصائصها المواتية العديدة وتوافقها مع التطبيقات البيولوجية^10,14. تعتبر اللدائن الحرارية ركيزة جذابة لأنظمة الموائع الدقيقة نظرا لمزاياها الكبيرة لتطوير أنظمة تحليلية منخفضة التكلفة يمكن التخلص منها⁹. بالإضافة إلى ذلك ، هذه المواد قابلة للغاية لعمليات التصنيع ذات الحجم الكبير ، مما يجعلها مناسبة للتسويق والإنتاج الضخم. لهذه الأسباب ، تم اعتبار اللدائن الحرارية مثل PMMA مواد موثوقة وقوية منذ السنوات الأولى من الموائع الدقيقة¹⁰. تم وصف بروتوكولات مختلفة لتصنيع القنوات المغلقة في اللدائن الحرارية ، مثل الترابط بالمذيبات¹⁵ ، والترابط الحراري 16 ، والأشعة فوق البنفسجية (UV) / رابطة المعالجة السطحية للأوزون¹⁷.

في كثير من الحالات ، لا تكون دقة تحديد المواقع التي تم تحقيقها باستخدام آلات الطحن الدقيقة التقليدية كافية لبعض تطبيقات الموائع الدقيقة التي تتطلب هياكل أصغر من 10 ميكرومتر. الطحن الدقيق المتطور لديه دقة كافية. لسوء الحظ ، نظرا لارتفاع الأسعار ، يقتصر استخدامه على حفنة من المستخدمين¹². في السابق ، أبلغت مجموعتنا البحثية عن تصنيع ومعالجة أداة منخفضة التكلفة تسمح بهياكل تصنيع أقل من 10 ميكرومتر ، والتغلب على دقة آلات الطحن التقليدية¹². لاعبا اساسيا عبارة عن منصة تم تصنيعها بواسطة طباعة 3D مع إلكترونيات بسيطة ، تحتوي على ثلاثة مشغلات كهرضغطية. يحتوي السطح على مفاصل على شكل مفصلي تسمح برفعه عندما تعمل العناصر الكهرضغطية في وقت واحد. يمكن التحكم في إزاحة المحور Z بدقة 500 نانومتر ودقة ±1.5 ميكرومتر¹².

يعرض هذا البحث خطوات عملية تصنيع جهاز الأكريليك (PMMA) من خلال تقنية الطحن الدقيق. يتكون تصميم الرقاقة من قناة رئيسية بعرض 200 ميكرومتر وارتفاع 200 ميكرومتر وقناة جانبية بنفس الأبعاد لتطهير تدفق الكواشف. في المنطقة الوسطى ، تتم مقاطعة القناة من خلال تقييد مادي يبلغ ارتفاعه 5 ميكرومتر فقط ، ملفقة بمنصة كهرضغطية مطبوعة ثلاثية الأبعاد صنعتها هذه المجموعة¹² ، لالتقاط الجسيمات الدقيقة المغناطيسية التي تشكل مصيدة مغناطيسية للجسيمات النانوية عن طريق وضع مغناطيس خارجي. نعرض تشغيل جهاز الموائع الدقيقة عن طريق إجراء اختبار مناعي للكشف عن جسم مضاد تجاري باستخدام الليزوزيم كمستضد نموذجي مترافق مع جسيمات نانوية مغناطيسية 100 نانومتر. يجمع هذا الجهاز بين ميزات مختلفة تجعله فريدا⁴: استخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية كدعم مناعي يقلل من إجمالي وقت الاختبار من ساعات إلى دقائق. يسمح استخدام إنزيم فلوري للكشف بحدود للكشف يمكن مقارنتها بحدود مقايسات الممتز المناعي القياسية المرتبطة بالإنزيم (ELISAs) ؛ واستخدام اللدائن الحرارية كمواد تصنيع يجعلها متوافقة مع الإنتاج الضخم ، وهو ما لم يكن عليه الحال بالنسبة للمصائد المغناطيسية^{السابقة لجسيمات} الموائع الدقيقة النانوية 3 ، ويجعلها مرشحا ممتازا لتطوير POCT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الطحن الدقيق

طحن السطح
1. قم بتشغيل آلة الطحن الدقيقة ووحدة التحكم الكهرضغطية. ابدأ برنامج التحكم الخاص بهم¹².
2. حدد لقم المطحنة النهائية المطلوبة (أقطار 200 ميكرومتر و 800 ميكرومتر). ضعها في المقصورة المناسبة لآلة الطحن (الشكل 1).
3. قطع مستطيلات 9 مم × 25 مم بسمك 1.3 مم PMMA باستخدام لقمة مطحنة نهاية 800 ميكرومتر. قم بتوصيل أحد هذه المستطيلات بعناية بشريط لاصق على الوجهين بالمنصة الكهرضغطية (الشكل 2).
  ملاحظة: تأكد دائما من وضع مستطيل الأكريليك في نفس الموضع بحيث يتزامن أحد الزوايا مع إحداثيات الأصل على المحورين x و y للمعالجة.
4. قم بتوصيل ووضع مستشعر z على سطح مستطيل PMMA. حدد دبوس الكشف وحركه فوق سطح المستشعر. اخفض الدبوس يدويا دون الاتصال بالمستشعر. قم بتنشيط وضع استشعار Z0 (الشكل 3).
5. حدد بت مطحنة النهاية 200 ميكرومتر وانقله إلى الأصل x ، y. قم بإزالة مستشعر z. اخفض البت بعناية دون ملامسة سطح الأكريليك.
6. قم بتدوير بت المطحنة الطرفية 200 ميكرومتر عند 14500 دورة في الدقيقة. قم بخفضه ببطء إلى إحداثيات الأصل على المحور z (z = 0). أعد ضبط المحور z 30 ميكرومتر أسفل الأصل. قم بتعيين هذا الإحداثي على أنه أصل z الجديد.
  ملاحظة: لا تخفض البت أبدا إذا لم تكن تدور. خلاف ذلك ، فإنه يخاطر الانهيار.
7. انقر فوق الزر Cut في برنامج آلة الطحن الدقيقة لتنشيط لوحة Cut . انقر فوق الزر " إضافة" وحدد ملف .txt (ملف الترميز التكميلي 1) برمز تم إنشاؤه مسبقا لطحن سطح الأكريليك. انقر فوق الزر " إخراج" لبدء العملية.
8. أحضر لقمة مطحنة النهاية إلى الإحداثيات حيث سيتم تشكيل القيد. امنع لقمة المطحنة الطرفية من الرفع عن سطح الأرض بمجرد الوصول إلى هذا الإحداثي بالنقر فوق الزر إيقاف مؤقت . خلاف ذلك ، قم بتغيير موضع بت المطحنة الطرفية يدويا إلى هذا الإحداثي (الشكل 4 أ).
طحن تقييد 5 ميكرومتر
1. اضبط سرعة دوران بت المطحنة الطرفية على 11000 دورة في الدقيقة. ارفع المنصة 6.5 ميكرومتر بواجهة المنصة الكهرضغطية (الشكل التكميلي S1). حرك بت المطحنة الطرفية على طول المحور ص بمقدار 500 ميكرومتر. أعد المنصة الكهرضغطية إلى قيمتها الأولية على المحور z باستخدام واجهة التحكم.
طحن القنوات الصغيرة
1. افتح ملف التصميم الذي تم إنشاؤه مسبقا من برنامج التصميم (ملف التصميم التكميلي 1). انقر فوق الزر طباعة . قم بالوصول إلى قائمة الخصائص وانقر على نافذة الألوان المقابلة للطبقة التي تحتوي على التصميم المراد تشكيله. اضبط معلمات التصنيع في لوحة الأدوات كما هو محدد في الشكل التكميلي S2.
2. قم بإلغاء تنشيط الطبقات غير المرغوب فيها عن طريق تحديد خيار لا شيء في القائمة المنسدلة أدوات .
طحن الثقوب
1. قم بالتبديل إلى بت مطحنة النهاية 800 ميكرومتر. قم بتنشيط طبقة التصميم للثقوب التي يبلغ قطرها 1.2 مم بالنقر فوق نافذة الألوان المقابلة.
2. كرر الخطوة 1.3.2 ، ولكن في هذه الحالة ، قم بتعيين معلمات التصنيع المقابلة كما هو موضح في الشكل التكميلي S3A للثقوب.
  ملاحظة: عمق الثقوب المشكلة هو نصف سمك الأكريليك.
3. قم بتشكيل فتحتين إضافيتين في الزوايا المقابلة للمستطيل لمحاذاة الأكريليك بطريقة مقلوبة على منصة جديدة (الشكل 4 ب). انزع مستطيل الأكريليك من المنصة الكهرضغطية. اقلب الأكريليك وألصقه بشريط لاصق على الوجهين فوق المحول باستخدام الأعمدة المشكلة (الشكل 4C ، D).
4. افتح الملف بتصميم الثقوب للوجه المقابل من برنامج التصميم (ملف التصميم التكميلي 2). قم بتعيين معلمات التصنيع المقابلة كما هو موضح في الشكل التكميلي S3B. قم بطحن النصف المتبقي من فتحات مدخل ومخرج الكاشف بقطر 1.5 مم وعمق 0.7 مم (الشكل التكميلي S3C).

figure-protocol-1
الشكل 1: وضع بت مطحنة النهاية . (أ) يتم وضع لقم المطحنة الطرفية 200 ميكرومتر و 800 ميكرومتر وتثبيتها من خلال برغي للدعم الفولاذي. (ب) يتم وضع كل لقمة مطحنة طرفية في المقصورة المحددة لآلة الطحن الدقيقة للاختيار التلقائي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-2
الشكل 2: منصة كهرضغطية. يتم تصنيع المنصة عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد وتتكون من قاعدتين سداسيتين متصلتين بمفصلات تسمح بإزاحة دقيقة في المحور z يتم التحكم فيها بواسطة ثلاثة مشغلات كهرضغطية. لوحظ أيضا محول أكريليك ، يتم إرفاق مستطيل PMMA به ، والذي يسمح بإعداد زاوية محاذاة الإحداثيات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-3
الشكل 3: معايرة المحور Z. خطوات معايرة المحور z مفصلة. (أ) يشتمل مستشعر z على كابل يتم توصيله بآلة الطحن الدقيقة. (ب) يتم وضع المستشعر مباشرة على السطح المراد تشكيله. (ج) يتكون دبوس الكشف من قضيب معدني يوضع في حجرة خاصة بجوار لقم المطحنة الطرفية. (د) عندما يتلامس كلا الملحقين ، تقوم آلة الطحن الدقيقة تلقائيا بحساب إحداثيات الأصل على المحور z. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-4
الشكل 4: سطح أكريليك مصحح . (أ) تقوم لقمة المطحنة الطرفية التي يبلغ قطرها 200 ميكرومتر بمسح كامل سطح مستطيل الأكريليك ، وإزالة طبقة يبلغ ارتفاعها حوالي 30 ميكرومتر. (ب) توضح الصورة التراكيب المختلفة المطحونة على وجه الأكريليك المعدل سابقا. لوحظت قنوات وثقوب لمدخل ومخرج الكاشف. لا يمكن رؤية تقييد 5 ميكرومتر بالعين المجردة. (ج) سطح دقيق مع فتحات محاذاة ومحول مع أعمدة محاذاة في زوايا متقابلة. (د) يتم محاذاة الأكريليك رأسا على عقب على المحول مع أعمدة ، حيث تتناسب فتحات المحاذاة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. ختم القناة

تنظيف الاكريليك
1. قم بإزالة مستطيل الأكريليك من منصة محول العمود. خذ مستطيل أكريليك آخر غير مشكل. اغسل كلا من صفائح الأكريليك بكحول الأيزوبروبيل (IPA) واشطفه بالماء المقطر. ارتداء القفازات وتجنب الاتصال مع IPA.
2. اغمر الأكريليك في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق (الشكل 5 أ ، ب).
التعرض للكلوروفورم الغازي
1. تجفيف كل من صفائح الاكريليك تماما. قم بلصقها داخل غطاء طبق بتري الزجاجي بشريط على الوجهين. تأكد من وضع جانب القناة الآلية مكشوفا (الشكل 5C). ارتد القفازات وتجنب لمس سطح الأكريليك مباشرة.
2. ضع قاعدة طبق بتري الزجاجي داخل طبق بتري زجاجي أكبر (الشكل 5 د). صب 1 مل من الكلوروفورم في قاعدة طبق بتري. ضع الغطاء بسرعة مع ألواح الأكريليك المرفقة بالجانب الداخلي.
3. أضف الماء المقطر على الفور إلى قاعدة طبق بتري الأكبر حتى مستوى غطاء طبق بتري. السماح بتعريض الأكريليك لغاز الكلوروفورم لمدة 1 دقيقة (الشكل 5E).
  ملاحظة: ضع في اعتبارك أن وقت التعرض الأطول للكلوروفورم سيهاجم سطح الأكريليك ، وسوف يذوب تقييد 5 ميكرومتر ، أو يعدل ارتفاعه ، أو يختفي تماما.
4. قم بإمالة طبق بتري لكسر ختم الماء الذي تم إنشاؤه. قم بإزالة الأكريليك على الفور من الكلوروفورم عن طريق الكشف عن طبق بتري. احرص على عدم انسكاب الماء.
  تنبيه: قم بهذه العملية في غطاء الدخان واستخدم القفازات لأن الكلوروفورم شديد السمية.
الترابط عن طريق الضغط والتدفئة
1. قشر كل من لوحات الاكريليك من الشريط على الوجهين.
2. قم بمحاذاة كل من الأكريليك مع الجوانب التي تعرضت للكلوروفورم الغازي وجها لوجه ، لتشكيل شطيرة. ضع الأكريليك في المكبس عند 18 كجم / سم² ودرجة حرارة 90 درجة مئوية (الشكل 5F ، G).
  ملاحظة: يوصى بوضع الأكريليك محاذيا طوليا وتغيير محاذاته بعد 2 دقيقة للحصول على ختم أفضل. إذا كان الختم غير كاف بعد هذا الوقت ، فضعه مرة أخرى في الصحافة لفترات لا تزيد عن 1 دقيقة. باستخدام المجسم ، تحقق من حالة القنوات والتقييد. ضع في اعتبارك أنه في حالة تجاوز وقت الضغط ، هناك خطر من إزالة القيد.
مرفق خرطوم
1. قطع 2-3 سم أطوال خرطوم. جعل قطع مستقيم تماما. قم بتوصيل كل خرطوم بفتحات الجهاز بمادة لاصقة سائلة فورية التجفيف (الشكل 6 أ). منع المادة اللاصقة من الدخول إلى داخل الشريحة.

figure-protocol-5
الشكل 5: عملية ختم الجهاز. (أ) توضع كل ورقة من صفائح الأكريليك في كيس قابل للإغلاق بالماء المقطر وتغمر في الحمام بالموجات فوق الصوتية. (ب) توضح الصورة الموجودة على اليسار القنوات بعد التصنيع مباشرة ، وتوضح الصورة الموجودة على اليمين نفس الجهاز بعد الغسيل باستخدام IPA والحمام بالموجات فوق الصوتية ، الذي يزيل جميع الشوائب وبقايا الأكريليك من القناة الدقيقة. لوحظت حواف التقييد الذي يقطع القناة المركزية البالغة 200 ميكرومتر ، مما يؤكد نجاح عملية الطحن. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر. (ج) يتم تجفيف كل من الأكريليك والالتصاق بالمنصة الزجاجية على الغطاء. (د) توضع قاعدة طبق بتري داخل طبق آخر بقطر أكبر. (ه) عند إغلاق طبق بتري، يمنع مانع تسرب الماء الكلوروفورم الغازي من الهروب. (و) وصف عناصر الرافعة التي يبلغ وزنها 5 كجم. (G) صورة للذراع المفتوحة ، تظهر باللون الأحمر المنطقة التي يوضع فيها الأكريليك. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. إعداد الجهاز

املأ القنوات بالماء المقطر باستخدام حقنة. تأكد من عدم وجود تسرب أو مقاومة للتدفق. اغمر الجهاز في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق لإزالة أي مواد أكريليك أو لاصقة أو غير مرغوب فيها متبقية داخل القنوات.
أفرغ الماء داخل قنوات الجهاز. استخدم حقنة لإدخال محلول مانع محضر بنسبة 5٪ (وزن / حجم) من ألبومين مصل البقر (BSA) المخفف في محلول ملحي 1x Tris (TBS) وتم ترشيحه مسبقا من خلال مرشح حقنة بولي إيثر سلفون (PES) 0.2 ميكرومتر.
تحضير تعليق من الجسيمات الدقيقة الحديد من قطر 7.5 ميكرومتر في 5 ٪ BSA.
ملاحظة: تعمل الجسيمات الدقيقة مسبقا بطبقة من السيليكا والبولي إيثيلين جلايكول (PEG) التي تمنح مقاومة لامتصاص البروتين⁴.
احتضان الرقاقة وتعليق الجسيمات الدقيقة بمحلول الحجب لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. إذا أمكن ، اترك الحجب طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

4. تشكيل فخ الجسيمات الدقيقة

أدخل الجسيمات الدقيقة في الشريحة بإبرة حقنة من خلال خرطوم مخرج القناة الجانبية. ضع الشريحة عموديا واترك الجسيمات الدقيقة تتدفق تحت تأثير الجاذبية عبر القناة الجانبية. قم بتدوير الشريحة 180 درجة في خطوتين بزاوية 90 درجة واسمح للجسيمات الدقيقة بالاستهداف والضغط عند تقييد 5 ميكرومتر.
قم بإزالة الجسيمات الدقيقة الزائدة عن طريق تدوير الجاذبية 45 درجة باتجاه القناة الجانبية.
حافظ على الجهاز في وضع مستقيم لتجنب التراجع عن مصيدة الجسيمات الدقيقة. انظر الشكل 6 ب للحصول على ملخص لعملية تكوين مصيدة الجسيمات الدقيقة.

5. المقايسة المناعية

تحضير الجسيمات النانوية
1. خذ 2 ميكرولتر من تعليق الجسيمات النانوية 100 نانومتر المترافقة سابقا مع الليزوزيم (نموذج المستضد). أضفه إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من محلول الحظر. احتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
2. أضف 150 ميكرولتر من محلول الغسيل (1x TBS ، 0.05٪ توين 20).
3. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل في فاصل مغناطيسي. احتفظ بها لمدة 15 دقيقة للسماح بفصل الجسيمات النانوية (الشكل التكميلي S4).
  ملاحظة: الحد الأدنى لحجم الفاصل المغناطيسي هو 200 ميكرولتر. تجنب استخدام حجم أصغر.
4. أخرج السائل من الأنبوب باستخدام ماصة صغيرة. تجنب ملامسة جدار الأنبوب حيث تشكلت حبيبات الجسيمات النانوية.
5. أضف 250 ميكرولتر من محلول الغسيل الطازج. حافظ على الأنبوب تحت التحريك لمدة 15 دقيقة.
6. كرر الخطوات 5.1.3.-5.1.5. 2x أكثر ، يهتز فقط لمدة 5 دقائق.
7. أضف التركيز المطلوب من الجسم المضاد الأساسي المضاد للليزوزيم (انظر جدول المواد). اضبط الحجم النهائي 100 ميكرولتر في مخفف الأجسام المضادة (1x TBS ، 1٪ BSA ، 0.05٪ Tween 20).
8. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استمر في الرج لمدة 15 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة.
9. كرر خطوات الغسيل 5.1.2.-5.1.6.
10. أضف 100 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة. أضف الجسم المضاد الثانوي المقترن ببيروكسيديز الفجل (HRP-AbII) (انظر جدول المواد) بتخفيف 1: 500.
11. كرر خطوات الغسيل 5.1.2.-5.1.6.
12. احتفظ بالجسيمات النانوية في حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة.

6. التركيب التجريبي

املأ الحقاقتين الزجاجيتين سعة 100 ميكرولتر بالماء ، وقم بتوصيل خرطوم بطول 6.5 سم بكل حقنة ، وأدخل دبوسا معدنيا في نهاية الخرطوم ، وضع كلتا الحقابتين على مضخة المحقنة التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر.
ختم جميع خراطيم جهاز الاكريليك بالحرارة.
قطع خرطوم مدخل والحفاظ على بضعة ملليمترات فقط. املأ إبرة التوزيع بمخزن الغسيل وأدخله في خرطوم القطع. اترك المحلول بالتنقيط قبل توصيل الإبرة بالجهاز لمنع وصول الهواء إلى الجهاز.
قطع خرطوم المخرج من القناة الجانبية. قم بتوصيله بمضخة المحقنة. بعد ذلك ، قم بنفس الإجراء لخرطوم مخرج القناة الرئيسية.
ملاحظة: من الضروري تنفيذ الخطوات 6.3.-6.4. من أجل تجنب تفريغ مصيدة الجسيمات الدقيقة. إذا أمكن ، تحقق من حالة الملائمة أثناء هذه الخطوات بمساعدة عدسة مكبرة.
ضع شريحة زجاجية على مسرح المجهر. قم بتوصيل المغناطيس بالشريحة بشريط على الوجهين وضع قطعة صغيرة من الشريط على كل جانب لتثبيت حواف الشريحة على الزجاج.
اضبط معدل تدفق يبلغ 50 ميكرولتر / ساعة من خلال علامتي التبويب معدل التدفق والوحدات في وحدة التحكم في مضخة المحقنة. حدد وضع السحب وانقر فوق الزر " ابدأ" لتنشيط تدفق المخزن المؤقت للغسيل.
بحذر ، اقترب من الجهاز باتجاه الشريحة مع المغناطيس بطريقة أفقية بحيث تلامس منطقة الشريحة التي تحتوي على المصيدة المغناطيس.
قم بلصق حواف الجهاز على الزجاج بشريط على الوجهين لمنع الحركة. تجنب عرقلة المسار البصري للفحص المجهري (الشكل 6C).

figure-protocol-6
الشكل 6: التكوين النهائي للجهاز . (أ) جهاز أكريليك مع الخراطيم المرفقة بالمدخلات والمخرجات المقابلة. يوضح المقياس أبعاد الجهاز بالسنتيمتر. (ب) بروتوكول لتشكيل مصيدة الجسيمات الدقيقة. تتدفق الجسيمات الدقيقة عبر القناة عن طريق الجاذبية عندما يتم وضع الجهاز في وضع رأسي. تتركز الجسيمات الدقيقة عند تقييد 5 ميكرومتر. تتم إزالة الجسيمات الدقيقة الزائدة بسهولة عن طريق تدوير الشريحة عبر القناة الجانبية. يتم الاحتفاظ بالشريحة عمودية للحفاظ على المصيدة قبل المقايسة المناعية. (ج) جهاز الموائع الدقيقة المثبت على شريحة زجاجية تحتوي على المغناطيس ، على مرحلة المجهر الفلوري المقلوب. تتم ملاحظة إبرة الاستغناء التي يتم من خلالها إضافة الكواشف ، وكذلك خراطيم المخرج التي تتصل بمضخة حقنة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

7. الكشف المناعي

حافظ على تدفق مخزن الغسيل المؤقت لمدة 10 دقائق عند 50 ميكرولتر / ساعة لإزالة BSA الزائد.
قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي للغسيل من إبرة الاستغناء باستخدام ماصة دقيقة. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الجسيمات النانوية.
تدفق تعليق الجسيمات النانوية لمدة 7 دقائق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة. بعد ذلك ، قم بتغيير معدل التدفق إلى 50 ميكرولتر / ساعة والتدفق لمدة 15 دقيقة أخرى.
تغيير إبرة الاستغناء. تدفق المخزن المؤقت للغسيل لمدة 10 دقائق عند 50 ميكرولتر / ساعة. تحضير الركيزة الفلوروجينية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة أثناء خطوة الغسيل.
قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي للغسيل من إبرة الاستغناء باستخدام ماصة دقيقة. أضف 100 ميكرولتر من الركيزة الفلوروجينية (انظر جدول المواد). تدفق الركيزة الفلوروجينية لمدة 6 دقائق عند 50 ميكرولتر / ساعة.
اضبط معدل التدفق (1 ميكرولتر / ساعة ، 3 ميكرولتر / ساعة ، 5 ميكرولتر / ساعة ، و 10 ميكرولتر / ساعة) والوقت (6 دقائق) في علامتي التبويب معدل التدفق وضبط المؤقت المقابلة للواجهة التي تتحكم في مضخة المحقنة. تأكد من تحديد وضع السحب لكل من القياسات التي سيتم إجراؤها.
اضبط علامة تبويب معدل التدفق الإضافية على 50 ميكرولتر / ساعة واضبط المؤقت على 3 دقائق لخطوة الغسيل.
قم بتشغيل مضان المجهر 15 ثانية قبل توقف الركيزة عند 50 ميكرولتر / ساعة. ابدأ التقاط الصورة باستخدام برنامج كاميرا المجهر قبل 10 ثوان من توقف الركيزة بوقت تعريض يبلغ 1000 مللي ثانية. قم بإجراء التصوير لمدة 6 دقائق بمعدل 1 إطار / ثانية (FPS).
انقر فوق الزر " ابدأ" لمعلمة معدل التدفق المطلوبة مباشرة بعد توقف معدل تدفق غسل الركيزة عند 50 ميكرولتر / ساعة. انقر فوق الزر "ابدأ" لتدفق الغسيل (50 ميكرولتر / ساعة) فور توقف تدفق القياس المحدد.
أوقف التقاط الصور وأوقف مضان المجهر لتجنب التبييض الضوئي للركيزة.
كرر الخطوات 7.8.-7.10. لكل معدل تدفق القياس المستخدم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان من الممكن إنشاء بروتوكول تصنيع قابل للتكرار بدرجة عالية يحسن دقة تقنية الطحن الدقيقة التقليدية. باستخدام هذا البروتوكول ، يتم تصنيع قناة صغيرة يصل ارتفاعها إلى 5 ميكرومتر تعمل كقيد متداخل في قناة بارتفاع 200 ميكرومتر. يلتقط التصميم البسيط للتقييد المتدرج جزيئات الحديد الدقيقة التي يبلغ قطرها 7.5 ميكرومتر والتي ، عند ضغطها في القناة الدقيقة ، تسمح بإنشاء مصيدة مغناطيسية عندما يقترب مغناطيس خارجي من الجهاز. يسمح هذا الجهاز بإجراء المقايسات المناعية باستخدام الجسيمات النانوية المترافقة مع المادة المراد تحليلها كدعم مناع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصنيع جهاز الموائع الدقيقة الأكريليك للمقايسات المناعية باستخدام الجسيمات النانوية كدعم مناعي باستخدام تقنية الطحن الدقيق. تتميز طريقة التصنيع المباشر على الركيزة بميزة تجنب استخدام القالب الرئيسي والوقت والتكاليف التي ينطوي عليها ذلك. ومع ذلك ، فإنه يقتصر على النماذج الأولية السريعة وتصنيع الأجهزة ذات الحجم الكبير.

هنا ، استخدمنا منصة كهرضغطية ملحقة تم الإبلاغ عنها مسبقا لآلة الطحن¹². تم تصنيع المنصة بواسطة الطباعة ثلاثية الأبعاد لإنشاء قنوات متغيرة العمق بدقة رأسية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل Conacyt، المكسيك بموجب منحة 312231 من "برنامج Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación"، ومن AMEXCID ووزارة العلاقات الخارجية المكسيكية (SRE) بموجب منحة "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO تشكر Conacyt Mexico على منحة الدكتوراه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 Endmill	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008x1 / 8x0.12x1-1 / 12
0.032 Endmill	KYOCERA SGS ;	2228	2FL 0.032x1 / 8x0.48x1-1 / 12
جزيئات الكربونيل والحديد الدقيقة	سيجما ألدريتش	44890	7 & m
الكلوروفورم	فيرمونت	6201	المخاطر الصحية: معتدل القابلية للاشتعال: لا شيء التفاعل: لا شيء خطر الاتصال: معتدل ؛
كاميرا CMOS لحظة	Teledyne Photometrics		تقنية الاستشعار: CMOS الكفاءة الكمومية: 73٪ بكسل الحجم: 4.5 & micro; م × 4.5 وميكرو ؛ m الواجهات المدعومة: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		برنامج النقش لتصميم وإنشاء مسار النقش على
السطح غطاء الاستخراج	غير معروف	معروف
أنابيب بلاستيكية مرنة	Tygon	معرف AAD04103	= 0.020 ، OD = 0.060
ميكروسوبي مضان ؛	ZEISS	Axio Vert.A1
عالية الدقة الاستغناء عن إبرة	Loctite	98612
تطبيق وحدة تحكم كهرضغطية محلية الصنع	LabView		انظر المرجع 12 لمزيد من التفاصيل.
Loctite 495 لاصق فوري	Henkel	49503	يوضع بطرف ماصة دقيقة أو إبرة الاستغناء عنها ؛
رف فصل MagJET	علمي		12 × 1.5 مل
مكبس ميكانيكي	آلة طحن محلية
	Roland	MDX-50
منصة كهرضغطية ؛	محلي الصنع		انظر المرجع 12
Polymethylmethacrylate - ورقة - PMMA ، أكريليك	Goodfellow	ME303018/1	السماكة: 1.3 مم ، الشفافية: برنامج PVCamTest واضح / شفاف
	Teledyne Photometrics	الإصدار 3.10.107	برنامج الحصول على الصور
مجهر ستيريو	نيكون	SMZ 7457
SuperMag كربوكسيل الخرز	المحيط NanoTech	KSC0100	100 نانومتر
مضخة حقنة	دينار كويتي علمية	KDS200	يمكن أن تستوعب ما يصل إلى حقنتين حمام
Utrasonic	Branson	2800
VPanel software	Windows	OS الإصدار 1.0.3.0	للتحكم في آلة الطحن الدقيق

غير حراري الصنعبرنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R. Immunoassays in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 991-1007 (2010).
Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111(2020).
Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , Royal Society of Chemistry. Cambridge, UK. 1-24 (2017).
Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603(2021).
Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60(2018).
Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017(2016).
Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

الطحن الدقيق للتحكم العددي بالكمبيوتر لجهاز أكريليك الموائع الدقيقة مع تقييد متداخل للمقايسات المناعية المغناطيسية القائمة على الجسيمات النانوية

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles