يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج الفئران ذي الصلة سريريا للتليف البريتوني بواسطة غسيل الكلى والقسطرة

1.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63901

⸱

يونيو 10, 2022

 , 
1Department of Integrated Diagnostics & Therapeutics, National Taiwan University Hospital, 2Renal Division, Department of Internal Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Graduate Institute of Physiology, National Taiwan University College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

المرضى الذين يعانون من التليف البريتوني الشديد لديهم ارتفاع معدلات المراضة والوفيات. آلية التليف البريتوني غير واضحة. في هذه الدراسة ، نصف نموذجا تجريبيا بسيطا للفئران البريتوني الناجم عن حقن سائل غسيل الكلى البريتوني.

الملخص

يمكن أن يحدث التليف البريتوني في المرضى الذين يخضعون لغسيل الكلى البريتوني (PD) ، والمرضى الذين يعانون من التليف البريتوني الشديد يعانون من ارتفاع معدلات المراضة والوفيات. التهاب الصفاق ، سائل غسيل الكلى البريتوني عالي الجلوكوز ، وفترة طويلة من مرض باركنسون يعجل بظهور التليف البريتوني. هناك حاجة إلى دراسة حيوانية للتليف البريتوني بسبب قيود الدراسات البشرية وفي المختبر . ومع ذلك ، فإن معظم النماذج الحيوانية لا تحاكي الحالات السريرية. لدراسة التليف البريتوني ، قمنا بتطوير نموذج الفئران ذي الصلة سريريا عن طريق زرع قسطرة بريتونية وحقن 2.5٪ سائل باركنسون عالي الجلوكوز بالإضافة إلى 20 ملي مولار ميثيل جليوكسال (MGO) في التجويف البريتوني يوميا لمدة 21 يوما. زرع القسطرة البريتونية يتجنب إصابة الصفاق بالإبر ويحاكي مرضى باركنسون السريريين. أظهر تلطيخ التألق المناعي أن الخلايا الليفية العضلية تتراكم في الصفاق الليفي. كان لدى المجموعة التجريبية حجم ترشيح فائق أقل ووظيفة نقل الغشاء البريتوني (اختبار التوازن البريتوني). في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا مفصلا للنموذج.

المقدمة

غسيل الكلى البريتوني (PD) هو نوع واحد من العلاج باستبدال الكلى يتلقاه حوالي 11٪ من مرضى مرض الكلى في المرحلة النهائية (ESRD)1. أفادت الدراسات أن التليف البريتوني يتطور لدى المرضى الذين يتلقون مرض باركنسون2. يؤدي تغليف التصلب البريتوني (EPS) ، وهو شكل حاد من التليف البريتوني ، إلى ارتفاع معدلات المراضة والوفيات3. تشمل عوامل خطر الإصابة بالتليف البريتوني التهاب الصفاق ، والسائل الغسيل الكلوي البريتوني عالي الجلوكوز ، وفترة طويلة من مرض باركنسون ، والعوامل الوراثية4. تتضمن آلية التليف البريتوني تغيرات معقدة في البيئة المكروية البريتونية والحديث المتبادل بين أنواع الخلايا المختلفة. تقتصر التجارب في المختبر والملاحظات السريرية على تقديم رؤى ميكانيكية للتليف البريتوني ، وهناك حاجة إلى نماذج حيوانية. عادة ما تستخدم التجارب مثل والأرانب والخنازير والجرذان والفئران في أبحاث الأمراض البشرية5 ، والتي تعد الفئران هي الأكثر استخداما نظرا لمزايا صغر حجمها وتكلفتها المنخفضة وسهولة التجريب. علاوة على ذلك ، يمكن دراسة خلايا معينة في نماذج أمراض الفئران باستخدام تقنيات تتبع النسب.

سيكون إنشاء نموذج حيواني مناسب مفيدا في فهم الفيزيولوجيا المرضية للتليف البريتوني. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون هذا النموذج غير مكلف ، وأن يكون سهل التكاثر ، ويوفر أساس العلاج السريري للتليف البريتوني.

يتم إنشاء النماذج الحيوانية المتاحة حاليا للتليف البريتوني بالحقن داخل الصفاق لسائل باركنسون عالي الجلوكوز يوميا لمدة 28 يوما ، أو غلوكونات الكلورهيكسيدين (CG) ثلاث مرات أسبوعيا لمدة 3 أسابيع ، أو جرعة واحدة من هيبوكلوريت هيبوكلوريتالصوديوم 6 ، 7 ، 8. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج لها قيود. على الرغم من أن حقن سائل باركنسون عالي الجلوكوز ، على الرغم من ارتباطه الوثيق بالممارسة السريرية ، فإنه يحفز التليف البريتوني الخفيف فقط ويفشل في تلخيص الحالات السريرية للتليف البريتوني الشديد ، مثل EPS. يمكن أن يؤدي CG أو هيبوكلوريت إلى حدوث تليف بريتوني شديد يحاكي EPS من خلال الإصابة الكيميائية9. ومع ذلك ، قد يؤدي CG والهيبوكلوريت إلى إصابة بريتوني وتليف من خلال آليات مختلفة من سائل PD عالي الجلوكوز.

تصف هذه الدراسة بروتوكول تطوير نموذج الفئران للتليف البريتوني. في هذا النموذج ، يتم إدخال قسطرة PD أولا ، ثم يتم إجراء الحقن اليومي لسائل PD عالي الجلوكوز بالإضافة إلى ميثيل جليوكسال (MGO) لمدة 21 يوما. MGO هو منتج تحلل الجلوكوز السام في سائل PD ، ويعزز تكوين المنتجات النهائية المتقدمة للجليكوز ، والتي تحفز الالتهاب وتكوين الأوعية10،11. تؤدي إضافة MGO إلى سائل PD عالي الجلوكوز إلى تراكم الخلايا الليفية العضلية ويعزز التليف البريتوني. وبالتالي ، فإن هذا النموذج يحاكي الحالات السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على التجارب وإجراؤها وفقا لكلية الطب بجامعة تايوان الوطنية ولجنة رعاية المؤسسي واستخدامه بكلية الصحة العامة (IACUC). تم إيواء جميع الفئران تحت رعاية قياسية.

1. تجربة على

  1. استخدم ذكور وإناث الفئران من النوع البري C57BL / 6 (WT) التي يزيد عمرها عن 11 أسبوعا.
  2. تحضير المواد الجراحية ، بما في ذلك منفذ سيليكون 4 فأر فرنسي ، وقفازات ، ستائر ، قسطرة ، خيوط ، وإبر.
  3. ازرع منفذ الماوس على النحو التالي:
    1. تخدير الفئران بالكيتامين / الزيلازين (100/10 مجم / كجم من وزن الجسم) عن طريق الحقن تحت الجلد.
      1. تحقق من معدل التنفس وعمق تخدير الفئران أثناء الجراحة للتأكد من ظروف التخدير.
        ملاحظة: إذا أصبح معدل التنفس للفئران سريعا وقصيرا ، أضف 20٪ من الجرعة السابقة.
    2. ضع الفئران في وضع الانبطاح أثناء التخدير. حلق وتنظيف منطقة بحجم 2 سم × 3 سم على الظهر الأيسر لإجراء الجراحة وتطهير الجلد بالبوفيدون اليود.
    3. قم بعمل شق 1.5 سم في الجلد على الظهر الأيسر.
    4. قم بالتشريح بعناية بين الجلد والعضلات الموجودة في الظهر الأيسر لإنشاء مسافة 1 سم × 2 سم لزرع منفذ الماوس.
    5. ثقب ثقب صغير فوق عضلة الظهر الأيسر.
    6. أدخل الجزء البعيد الكلي 4 فرنسي من منفذ الماوس في التجويف البريتوني
    7. خياطة (4-0 نايلون) جذر منفذ الماوس إلى عضلة الظهر.
    8. ضع رأس منفذ الماوس بين الجلد وعضلة الظهر.
    9. أغلق الجلد بمشابك انعكاسية (7 مم).
      ملاحظة: المشابك الانعكاسية أفضل من الغرز لأن الفئران غالبا ما تعض الجرح.
    10. ابدأ التجربة بعد 7 أيام من زرع منفذ الماوس. قسم الفئران بشكل عشوائي إلى مجموعات تجريبية وضابطة.
    11. تطهير الجلد في موقع الوصول ببوفيدون اليود قبل حقن السوائل.
    12. حقن مجموعة سائل باركنسون (PDF) مع 2.5٪ سائل باركنسون و 20 ملي MGO بإجمالي 2 مل داخل الصفاق يوميا لمدة 21 يوما. حقن المجموعة الضابطة بالمحلول الملحي العادي (NS).

2. اختبار وظيفة الصفاق (اختبار توازن الصفاق)

  1. تحضير 2.5٪ سائل باركنسون (2 مل) وقياس تركيز الجلوكوز في سائل باركنسون ، والذي يعرف بأنه تركيز الجلوكوز الأولي (D0).
  2. حقن سائل PD في منفذ الماوس.
  3. بعد 30 دقيقة ، ضحي بالفئران عن طريق جرعة زائدة من الأيزوفلوران (100٪).
  4. اجمع السائل داخل البطن باستخدام حقنة ، ثم قم بقياس حجم السائل ، والذي يعرف بأنه حجم الترشيح الفائق.
  5. قياس تركيز الجلوكوز في السائل داخل البطن ، والذي يعرف بأنه تركيز الجلوكوز النهائي (D).
  6. احسب التوازن البريتوني أو الدالة البريتونية12.
    ملاحظة: اختبار التوازن البريتوني12 = تركيز الجلوكوز السائل النهائي لمرض باركنسون (D) / تركيز الجلوكوز الأولي للسائل PD (D0). يتم الكشف عن تركيز الجلوكوز بطريقة الهيكسوكيناز باستخدام محلل كيميائي حيوي13.

3. تحضير الأنسجة والتحليل النسيجي

  1. اجمع الأنسجة الصفاقية: جدار البطن العلوي الأيمن (1 سم × 1 سم) والكبد. إصلاح الأنسجة البريتونية مع 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 2 ساعة, ثم بين عشية وضحاها في 18٪ محلول السكروز7.
  2. قم بإعداد أقسام مجمدة بسمك 4 ميكرومتر من الأنسجة البريتونية وإجراء التحليل النسيجي كما تم نشرهسابقا 7.
  3. أداء تلطيخ التألق المناعي.
    1. استخدم الأجسام المضادة الأولية ضد البروتينات التالية لوضع العلامات المناعية: أكتين العضلات الملساء α (SMA ؛ 2 ساعة ، 1: 200) للكشف عن الخلايا الليفية العضلية ، السيتوكيراتين (2 ساعة ، 1: 200) للكشف عن خلايا الظهارة المتوسطة ، و 4 ، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) (5 دقائق ، 1: 1000) للكشف عن نوى الخلية.
  4. التعبير عن البيانات التي تم الحصول عليها بتنسيق مناسب.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج التحليل الإحصائي المناسب (جدول المواد) ، وتم تقييم الدلالة الإحصائية عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه أو اختبار t.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم فحص أنسجة الأنسجة البريتونية ، والتي أظهرت أن التليف البريتوني قد تم إحداثه بنجاح في مجموعة سائل PD بالإضافة إلى MGO (PDF). أظهر تلطيخ التألق المناعي للصفاق الحشوي لسطح الكبد تراكما أكثر للأرومات الليفية العضلية في الصفاق المصاب لمجموعة PDF مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 1). كما هو موضح في الشكل 2 أ ، كان لمجموعة PDF حجم ترشيح فائق أقل من المجموعة الضابطة. كما هو موضح في الشكل 2 ب ، كان هناك اختبار توازن بريتوني...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يحتوي الصفاق على صفاق حشوي وجداري يغطي أعضاء البطن وجدران البطن. يتكون من طبقة أحادية من الخلايا المتوسطة ، وطبقة تحت الظهارة ، ومصل ، والخلايا الليفية ، والخلايا الليمفاوية ، والبروتينات المفرزة14. التليف البريتوني هو فقدان وتعرية الخلايا المتوسطة ، وسماكة تحت الظهارة ، وتراكم العديد من الخلايا الالتهابية ، مثل الخلايا الليفية العضلية والضامة4،14.

تستخدم النماذج الحيوانية للتلي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مستشفى جامعة تايوان الوطنية (NTUH) 111-UN0026.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأجسام المضادة للسيتوكيراتين المضادةabcamab9377
Beckman CoulterBeckman CoulterAU5800محلل الكيمياء الحيوية
DAPI ، 4 & prime ؛ ، 6-diamidino-2-phenylindole الجسم المضادSigma-Aldrich98718-90-3
ستائرأي
ماعز FITC مضاد للأرانبجاكسون ImmunoResearch الثانوية الأجسام المضادة111-095-144
قفازاتأي
GraphPad PrizmGraphPad SoftwareGraphPad 9.0
Kellysأي
Methylglyoxal (MGO)Sigma-Aldrich
Mini-UTE MousePort Access TechnologiesMMP-4S 061108BMouse 4-French السيليكون
أحادي النسيلة المضاد للأكتين ، & ألفا ؛ العضلات الملساء - الجسم المضاد Cy3سيجما - ألدريتشC6198
الإبرأي
مقاطع انعكاسية 7 ممأي
خياطة 4-0 نايلونأي
المضادة

المراجع

  1. Jain, A. K., Blake, P., Cordy, P., Garg, A. X. Global trends in rates of peritoneal dialysis. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 533-544 (2012).
  2. Zhou, Q., Bajo, M. A., Del Peso, G., Yu, X., Selgas, R. Preventing peritoneal membrane fibrosis in peritoneal dialysis patients. Kidney International. 90 (3), 515-524 (2016).
  3. Brown, M. C., Simpson, K., Kerssens, J. J., Mactier, R. A. Scottish Renal Registry. Encapsulating peritoneal sclerosis in the new millennium: A national cohort study. ClinicalJournal of the American Society of Nephrology. 4 (7), 1222-1229 (2009).
  4. Aroeira, L. S., et al. Epithelial to mesenchymal transition and peritoneal membrane failure in peritoneal dialysis patients: Pathologic significance and potential therapeutic interventions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2004-2013 (2007).
  5. Yang, B., et al. Experimental models in peritoneal dialysis (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 21 (3), 240(2021).
  6. Pawlaczyk, K., et al. Animal models of peritoneal dialysis: Thirty Years of our own experience. BioMed Research International. 2015, 261813(2015).
  7. Chen, Y. T., et al. Lineage tracing reveals distinctive fates for mesothelial cells and submesothelial fibroblasts during peritoneal injury. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (12), 2847-2858 (2014).
  8. Yokoi, H., et al. Pleiotrophin triggers inflammation and increased peritoneal permeability leading to peritoneal fibrosis. Kidney International. 81 (2), 160-169 (2012).
  9. Hoff, C. M. Experimental animal models of encapsulating peritoneal sclerosis. Peritoneal Dialysis International. 25, Suppl 4 57-66 (2005).
  10. Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (2), 437-447 (2009).
  11. Nagai, T., et al. Linagliptin ameliorates methylglyoxal-induced peritoneal fibrosis in mice. PLoS One. 11 (8), 0160993(2016).
  12. Kakuta, T., et al. Pyridoxamine improves functional, structural, and biochemical alterations of peritoneal membranes in uremic peritoneal dialysis rats. Kidney International. 68 (3), 1326-1336 (2005).
  13. Barthelmai, W., Czok, R. Enzymatic determinations of glucose in the blood, cerebrospinal fluid and urine. Klinische Wochenschrift. 40, 585-589 (1962).
  14. Williams, J. D., et al. Morphologic changes in the peritoneal membrane of patients with renal disease. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (2), 470-479 (2002).
  15. Hurst, S. M., et al. Il-6 and its soluble receptor orchestrate a temporal switch in the pattern of leukocyte recruitment seen during acute inflammation. Immunity. 14 (6), 705-714 (2001).
  16. Pawlaczyk, K., et al. Vascular endothelial growth factor in dialysate in relation to intensity of peritoneal inflammation. The International Journal of Artificial Organs. 31 (6), 535-544 (2008).
  17. Loureiro, J., et al. Blocking TGF-beta1 protects the peritoneal membrane from dialysate-induced damage. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (9), 1682-1695 (2011).
  18. Margetts, P. J., et al. Transforming growth factor beta-induced peritoneal fibrosis is mouse strain dependent. Nephrology, Dialysis Transplantation. 28 (8), 2015-2027 (2013).
  19. Huang, J. W., et al. Tamoxifen downregulates connective tissue growth factor to ameliorate peritoneal fibrosis. Blood Purification. 31 (4), 252-258 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.