باستخدام البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين (PEI) ، أنتجنا جزيئات فيروسية لينتيفيروسية للتعبير المستقر عن shRNAs في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H9 (hESCs) والخلايا السلفية العصبية المشتقة من H9 (NPCs) بكفاءة عالية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تسليم الحمض النووي الريبوزي المرسال بوساطة فيروسية إلى hESCs و NPCs باستخدام بولي إيثيلينيمين البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة (PEI)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يصف البروتوكول الحالي استخدام الجسيمات الفيروسية اللينتيفيروسية لتوصيل الحمض النووي الريبي قصير الدبوس الشعري (shRNAs) إلى كل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وكذلك الخلايا السلفية العصبية (NPCs) المشتقة من hESCs بكفاءة عالية. تم توليد جزيئات الفيروس العاصف عن طريق النقل المشترك لخلايا HEK293T باستخدام ناقلات الدخول (التي تحمل shRNAs) جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة والتغليف (pAX و pMD2.G) باستخدام بوليمر البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين (PEI). وتركزت الجسيمات الفيروسية باستخدام الطرد المركزي الفائق، مما أدى إلى متوسط عيارات أعلى من 5 × 107. يمكن أن تصاب كل من hESCs و NPCs بكفاءة عالية باستخدام هذه الجسيمات الفيروسية ، كما هو موضح في اختيار puromycin والتعبير المستقر في hESCs ، وكذلك تعبير GFP العابر في NPCs. علاوة على ذلك ، أظهر تحليل اللطخة الغربية انخفاضا كبيرا في التعبير عن الجينات التي تستهدفها shRNAs. بالإضافة إلى ذلك ، احتفظت الخلايا بتعدد قدراتها وكذلك إمكانات التمايز ، كما يتضح من تمايزها اللاحق إلى سلالات مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. ويتناول البروتوكول الحالي تسليم الحمض النووي الريبوزي المرسال؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام نفس النهج للتعبير خارج الرحم عن cDNAs لدراسات التعبير المفرط.
المقدمة
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) المشتقة من كتلة الخلايا الداخلية للكيسة الأريمية متعددة القدرات ويمكن تمييزها إلى أنواع مختلفة من الخلايا اعتمادا على العوامل الخارجية في ظل ظروف المختبر 1,2. من أجل تسخير إمكانات hESCs بشكل كامل ، من الضروري أن يكون لديك طرق سريعة وموثوقة لتوصيل الجينات لهذه الخلايا. تقليديا ، يمكن تصنيف التقنيات المستخدمة على نطاق واسع إلى نوعين: أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية والفيروسية 3,4. أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية الأكثر استخداما هي lipofection و electroporation و nucleofection. تعد أنظمة التوصيل غير ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. نقل خلايا HEK293T باستخدام كاشف جزيرة الأمير إدوارد أو ليبوفيكتامين 3000
- استزرع خلايا HEK293T في DMEM + 10٪ FBS + 1x البنسلين / الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع جو من 5٪ CO 2 و 21٪ O2 حتى تصبح ملتقية بنسبة 90٪ قبل البذر للنقل. استخدم عددا منخفضا نسبيا من الخلايا لإنتاج فيروس عيار مرتفع (من الناحية المثالية أقل من P30).
- البذور 4 × 106 خلايا في 10 مل من متوسط النمو الكامل في لوحة زراعة الأنسجة 100 ملم وتنمو بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة مع جو من 5٪ CO 2 و 21٪ O2.
- لكل عملية نقل، قم بتخفيف الحمض النووي البلازميدي (مخزون 1 ملغم/مل) في 1....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد نقل الجينات ، هناك حاجة حتمية إلى جدوى عالية من hESCs. على الرغم من الجهود المبذولة وتحسين البروتوكولات للحد من موت الخلايا بعد الكهربية من hESCs ، لا يزال أكثر من 50 ٪ من موت الخلايا يلاحظ بعد الكهربية لهذه الخلايا ، جنبا إلى جنب مع انخفاض كفاءة النقل20. لا يؤدي نقل الجينات بوساطة الفيروس العدسي إلى كفاءة عالية في نقل الجينات فحسب ، بل يوضح أيضا مستويات عالية من صلاحية الخلايا بعد النقل. تقدم النتائج أدناه نهجين: أحدهما يستخدم GFP كمراسل وتعبير عابر في NPCs المشتقة من hESCs والآخر يستخدم البي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
القدرة على تعديل الخلايا الجذعية وراثيا لأغراض الدراسة أو السريرية محدودة من خلال التكنولوجيا والفهم الأساسي لبيولوجيا hESCs. التقنيات التي أظهرت إمكانات كبيرة في ESCs الفئران ، مثل lipofection و electroporation ، ليست فعالة للغاية بالنسبة ل hESCs ، والتي تشتهر بصعوبة توصيل الجينات بالطرق التقليدية20. وقد أدى هذا المفهوم ليس فقط إلى تحسين التقنيات القائمة ولكن أيضا إلى تطوير أساليب جديدة لزيادة كفاءة النقل في HESCs. كان تركيز هذه التطورات الجديدة على توصيل الجينات بكفاءة واستقرار إلى hESCs مع الحف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية من جامعة الإمارات العربية المتحدة (UAEU) ، والمنحة رقم 31R170 (مركز زايد للعلوم الصحية) و # 12R010 (منحة جامعة الإمارات العربية المتحدة). نشكر البروفيسور راندال مورس (مركز وادزورث، ألباني، نيويورك) على مساعدتنا في تحرير المخطوطة من حيث الأسلوب والقواعد.
جميع البيانات متاحة عند الطلب.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 مل ، معقم + أنابيب رقيقة الشفافة عالية الوضوح مجانية معتمدة | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF المؤتلف البشري | Invitrogen | PHG0261 | |
| ألبومين مصل الأبقار FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| مصفوفة غشاء القاعدة Corning Matrigel ، | الخلايا الجذعية 354234 | ||
| Cyclopamine | من LDEV 72074 | ||
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient Mix F12 & nbsp ؛ | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS بدون : Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| مصل الجنين بوفيي | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) الأرانب mAb الأجسام المضادة | CST | 2118S | |
| كاشف تفكك الخلايا | اللطيف تقنيات الخلايا الجذعية | 7174 | |
| HyClone الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) 100X محلول | جنرال إلكتريك للرعاية الصحية | SH30238.01 | |
| لتر جلوتامين ، 100X & nbsp ؛ | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH الأجسام المضادة متعددة النسيلة | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 وسائط كاملة | تقنيات الخلايا الجذعية | 85850 | |
| الوسط العصبي القاعدي 1X CTS | مكمل Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin Streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| كاشف عدوى البوليبرين | Sigma | TR1003- G | |
| بولي إيثيلينيمين ، متفرع | سيجما | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| بورمورفامين | توكرس | 4551/10 | |
| بوروميسين | إنفيتروجين | مثبط A1113802 | |
| ROCK Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد ؛ | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05٪ EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
المراجع
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
