Method Article

التصوير المتزامن والكشف القائم على قياس التدفق الخلوي لعلامات الشيخوخة الفلورية المتعددة في الخلايا السرطانية الشائخة الناجمة عن العلاج

DOI:

10.3791/63973

⸱

July 12th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Johannes Kepler University Linz, 2Charité - University Medicine Berlin, 3Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي للتصور والقياس الكمي للعلامات المتعددة المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا المفردة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تحفز أدوية العلاج الكيميائي تلف الحمض النووي الذي لا يمكن إصلاحه في الخلايا السرطانية ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج أو الشيخوخة المبكرة. على عكس موت الخلايا الماصة ، فإن الشيخوخة هي آلية مختلفة اختلافا جوهريا تقيد انتشار الخلايا السرطانية. كشفت عقود من الدراسات العلمية عن الآثار المرضية المعقدة للخلايا السرطانية الشائخة في الأورام والبيئات الدقيقة التي تعدل الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية. تشير الأدلة الجديدة إلى أن الشيخوخة هي عامل تنبؤ قوي أثناء علاج السرطان ، وبالتالي فإن الكشف السريع والدقيق عن الخلايا الشائخة في عينات السرطان أمر ضروري. تقدم هذه الورقة طريقة لتصور واكتشاف الشيخوخة الناجمة عن العلاج (TIS) في الخلايا السرطانية. عولجت خطوط الخلايا اللمفاوية الكبيرة المنتشرة بالخلايا البائية (DLBCL) باستخدام المافوسفاميد (MAF) أو الدونوروبيسين (DN) وتم فحصها بحثا عن علامة الشيخوخة ، β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal) ، وعلامة تخليق الحمض النووي 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ، وعلامة تلف الحمض النووي gamma-H2AX (γH2AX). يمكن أن يساعد تصوير مقياس التدفق الخلوي في توليد صور أحادية الخلية عالية الدقة في فترة زمنية قصيرة لتصور العلامات الثلاثة في الخلايا السرطانية وتحديدها كميا في وقت واحد.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن لمجموعة متنوعة من المحفزات أن تؤدي إلى الشيخوخة الخلوية، مما يتسبب في دخول الخلايا في حالة من توقف دورة الخلية المستقرة. وتشمل هذه المحفزات تغييرات الإشارات الجوهرية أو الضغوط الخارجية. تشمل الإشارات الجوهرية تقصير التيلومير التدريجي ، والتغيرات في بنية التيلومير ، والتعديل اللاجيني ، واضطرابات البروتيوستاسيس ، وخلل الميتوكوندريا ، وتنشيط الجينات الورمية. تشمل الضغوط الخارجية إشارات تلف الالتهاب و / أو الأنسجة ، والإشعاع أو العلاج الكيميائي ، والحرمان الغذائي1،2،3،4. من بين الأنواع المتميزة من الشيخوخة ، فإن الأكثر شيوعا والمدروسة جيدا ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خطوط الخلايا DLBCL مع مافوسفاميد أو علاج دونوروبيسين للحث على الشيخوخة الخلوية

ملاحظة: يعمل البروتوكول أيضا مع الخلايا السرطانية الملتصقة. اعتمادا على حجم الخلية ، × البذور 1-2 10 5 خلايا في بئر واحد من صفيحة من 6 آبار وتحتضن اللوحة في حاضنة5 ٪ CO2 ، 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل العلاج. خطوات البروتوكول هي نفسها بالنسبة لخلايا التعليق ولكن مع استثناءين. أولا ، يجب إزالة الخلايا من اللوحة بعد الخطوة 3.4. ثانيا ، يتم تنفيذ خطوات الغسيل دون الطرد المركزي قبل التربسين.

  1. عد خلايا DLBCL والبذور 1 × 10 6 خلايا / مل في 4 مل من الوسط لكل بئر في لوحة زراعة6 آبار. زراعة خلايا DLBCL في ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إنشاء مصفوفة تعويض باستخدام برنامج تحليل الصور عن طريق تحميل البيانات المسجلة لعينات التحكم أحادية اللون. كما هو موضح في الشكل التكميلي S1 ، تم الكشف عن امتداد ضوئي لا يكاد يذكر (قيمة المعامل ≥ 0.1) من EdU إلى C12FDG بقيمة معامل المحادثة المتقاطعة 0.248 ، في حين أن المحادثة المتقاطعة بين القنوات الأخرى لم تكن كبيرة. تمت معالجة أربعة خطوط خلايا DLBCL مختلفة باستخدام 5 ميكروغرام / مل MAF أو 20 نانوغرام / مل DN للحث على الشيخوخة الخلوية وتحليلها باستخدام إما تلطيخ SA-β-gal التقليدي أو طريقة ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فحصت هذه الطريقة القدرة على دخول الشيخوخة لأربعة خطوط مختلفة من خلايا DLBCL عند العلاج الكيميائي ، مع التصوير الساطع المجال والقياس الكمي القائم على التدفق الخلوي. على مستوى الخلية الواحدة، نجحنا في اكتشاف المجموعات السكانية الشائخة الرئيسية C12FDG+EdU-Ki67+ في خلايا KARPAS422 وWSU-DLCL2 المعالجة، وبدرجة أقل في خلايا OCI-LY1، في حين أن خط خلايا SU-DHL6 كان مقاوما للعلاج. يمكن تفسير الفرق في القدرة على دخول الشيخوخة بين خطوط الخلايا من خلال عيوبها الجينومية المتميزة

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة إلى يونغ يو من جامعة يوهانس كيبلر لينز (BERM16108001).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) الأجسام المضادةBiolegend613407
للفأر المضادة (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)فيشر 11590276
الكلوروكين -ديفوسفاتسيجما ألدريتشC6628
منظف (كولتر كلينز)بيكمان كولتر8546929
Click-iT EdU مجموعة فحص التدفق الخلوي الأزرق في المحيط الهادئThermo ScientificC10418
DaunorubicinMedchemexpressHY-13062A
Debubbler (70٪ Isopropanol)برنامج تحليل الصور Millipore1.3704
(Amnis  أفكار  6.3)LuminexCN-SW69-12
وبرامج التصوير (Amnis  ImageStreamX  نظام مقياس التدفق الخلوي للتصوير Mk II وبرنامج INSPIR)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
mafosfamide cyclohexylamineNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
ParaformaldehydeFisherScientific 11473704
PETG (2-Phenylethyl-&beta ؛ -D-thiogalactosid) سيجما ألدريتشP4902
سابونينسيجما ألدريتش47036
غمدميليبورBSS-1006-B
SpeedBead Kit لمعقم ImageStreamLuminex400041
(0.4-0.7٪ هيبوكلوريت) VWRJT9416-1
SU-DHL6DSMZACC 572
WSU-DLCL2DSMZACC 575
الأجسام المضادة للفأر أحادية النسيلة المضادة العلمي أداة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  2. Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Flow CytometrySenescence MarkersTherapy Induced SenescenceFluorescent Marker DetectionDLBCL Cell LinesGamma H2AX DetectionEdU IncorporationC12 FDG StainingSingle Cell ImagingNuclear Foci Quantification

Related Articles