نقدم هنا طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي للتصور والقياس الكمي للعلامات المتعددة المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا المفردة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير المتزامن والكشف القائم على قياس التدفق الخلوي لعلامات الشيخوخة الفلورية المتعددة في الخلايا السرطانية الشائخة الناجمة عن العلاج
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن أن تحفز أدوية العلاج الكيميائي تلف الحمض النووي الذي لا يمكن إصلاحه في الخلايا السرطانية ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج أو الشيخوخة المبكرة. على عكس موت الخلايا الماصة ، فإن الشيخوخة هي آلية مختلفة اختلافا جوهريا تقيد انتشار الخلايا السرطانية. كشفت عقود من الدراسات العلمية عن الآثار المرضية المعقدة للخلايا السرطانية الشائخة في الأورام والبيئات الدقيقة التي تعدل الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية. تشير الأدلة الجديدة إلى أن الشيخوخة هي عامل تنبؤ قوي أثناء علاج السرطان ، وبالتالي فإن الكشف السريع والدقيق عن الخلايا الشائخة في عينات السرطان أمر ضروري. تقدم هذه الورقة طريقة لتصور واكتشاف الشيخوخة الناجمة عن العلاج (TIS) في الخلايا السرطانية. عولجت خطوط الخلايا اللمفاوية الكبيرة المنتشرة بالخلايا البائية (DLBCL) باستخدام المافوسفاميد (MAF) أو الدونوروبيسين (DN) وتم فحصها بحثا عن علامة الشيخوخة ، β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal) ، وعلامة تخليق الحمض النووي 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ، وعلامة تلف الحمض النووي gamma-H2AX (γH2AX). يمكن أن يساعد تصوير مقياس التدفق الخلوي في توليد صور أحادية الخلية عالية الدقة في فترة زمنية قصيرة لتصور العلامات الثلاثة في الخلايا السرطانية وتحديدها كميا في وقت واحد.
المقدمة
يمكن لمجموعة متنوعة من المحفزات أن تؤدي إلى الشيخوخة الخلوية، مما يتسبب في دخول الخلايا في حالة من توقف دورة الخلية المستقرة. وتشمل هذه المحفزات تغييرات الإشارات الجوهرية أو الضغوط الخارجية. تشمل الإشارات الجوهرية تقصير التيلومير التدريجي ، والتغيرات في بنية التيلومير ، والتعديل اللاجيني ، واضطرابات البروتيوستاسيس ، وخلل الميتوكوندريا ، وتنشيط الجينات الورمية. تشمل الضغوط الخارجية إشارات تلف الالتهاب و / أو الأنسجة ، والإشعاع أو العلاج الكيميائي ، والحرمان الغذائي1،2،3،4. من بين الأنواع المتميزة من الشيخوخة ، فإن الأكثر شيوعا والمدروسة جيدا ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خطوط الخلايا DLBCL مع مافوسفاميد أو علاج دونوروبيسين للحث على الشيخوخة الخلوية
ملاحظة: يعمل البروتوكول أيضا مع الخلايا السرطانية الملتصقة. اعتمادا على حجم الخلية ، × البذور 1-2 10 5 خلايا في بئر واحد من صفيحة من 6 آبار وتحتضن اللوحة في حاضنة5 ٪ CO2 ، 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل العلاج. خطوات البروتوكول هي نفسها بالنسبة لخلايا التعليق ولكن مع استثناءين. أولا ، يجب إزالة الخلايا من اللوحة بعد الخطوة 3.4. ثانيا ، يتم تنفيذ خطوات الغسيل دون الطرد المركزي قبل التربسين.
- عد خلايا DLBCL والبذور 1 × 10 6 خلايا / مل في 4 مل من الوسط لكل بئر في لوحة زراعة6 آبار. زراعة خلايا DLBCL في ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إنشاء مصفوفة تعويض باستخدام برنامج تحليل الصور عن طريق تحميل البيانات المسجلة لعينات التحكم أحادية اللون. كما هو موضح في الشكل التكميلي S1 ، تم الكشف عن امتداد ضوئي لا يكاد يذكر (قيمة المعامل ≥ 0.1) من EdU إلى C12FDG بقيمة معامل المحادثة المتقاطعة 0.248 ، في حين أن المحادثة المتقاطعة بين القنوات الأخرى لم تكن كبيرة. تمت معالجة أربعة خطوط خلايا DLBCL مختلفة باستخدام 5 ميكروغرام / مل MAF أو 20 نانوغرام / مل DN للحث على الشيخوخة الخلوية وتحليلها باستخدام إما تلطيخ SA-β-gal التقليدي أو طريقة ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
فحصت هذه الطريقة القدرة على دخول الشيخوخة لأربعة خطوط مختلفة من خلايا DLBCL عند العلاج الكيميائي ، مع التصوير الساطع المجال والقياس الكمي القائم على التدفق الخلوي. على مستوى الخلية الواحدة، نجحنا في اكتشاف المجموعات السكانية الشائخة الرئيسية C12FDG+EdU-Ki67+ في خلايا KARPAS422 وWSU-DLCL2 المعالجة، وبدرجة أقل في خلايا OCI-LY1، في حين أن خط خلايا SU-DHL6 كان مقاوما للعلاج. يمكن تفسير الفرق في القدرة على دخول الشيخوخة بين خطوط الخلايا من خلال عيوبها الجينومية المتميزة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة إلى يونغ يو من جامعة يوهانس كيبلر لينز (BERM16108001).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) الأجسام المضادة | Biolegend | 613407 | |
| للفأر المضادة (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | فيشر 11590276 | ||
| الكلوروكين -ديفوسفات | سيجما ألدريتش | C6628 | |
| منظف (كولتر كلينز) | بيكمان كولتر | 8546929 | |
| Click-iT EdU مجموعة فحص التدفق الخلوي الأزرق في المحيط الهادئ | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70٪ Isopropanol) | برنامج تحليل الصور Millipore | 1.3704 | |
| (Amnis أفكار 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| وبرامج التصوير (Amnis ImageStreamX نظام مقياس التدفق الخلوي للتصوير Mk II وبرنامج INSPIR) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | Scientific 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-&beta ؛ -D-thiogalactosid) | سيجما ألدريتش | P4902 | |
| سابونين | سيجما ألدريتش | 47036 | |
| غمد | ميليبور | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit لمعقم ImageStream | Luminex | 400041 | |
| (0.4-0.7٪ هيبوكلوريت) VWR | JT9416-1 | ||
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
المراجع
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
