مقالة منهجية

عزل وتحليل الحويصلات خارج الخلية التي يمكن تتبعها والوظيفية من البلازما والأنسجة الصلبة

DOI:

10.3791/63990

⸱

أكتوبر 17, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine, The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science, Northwest University, 6Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة لاستخراج الحويصلات خارج الخلية من الدم المحيطي والأنسجة الصلبة مع التنميط اللاحق للمستضدات السطحية وشحنات البروتين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل الحويصلات خارج الخلية المنتشرة والمقيمة في الأنسجة (EVs) أهدافا واعدة كمؤشرات حيوية علاجية جديدة ، وتظهر كلاعبين مهمين في الحفاظ على التوازن العضوي وتطور مجموعة واسعة من الأمراض. بينما يركز البحث الحالي على توصيف الإكسوسومات الداخلية ذات الأصل الإندوسومي ، اكتسبت الحويصلات الدقيقة التي تتدفق من غشاء البلازما اهتماما متزايدا في الصحة والمرض ، والتي تتميز بوفرة من الجزيئات السطحية التي تلخص توقيع الغشاء للخلايا الأم. هنا ، يتم تقديم إجراء قابل للتكرار يعتمد على الطرد المركزي التفاضلي لاستخراج وتوصيف المركبات الكهربائية من البلازما والأنسجة الصلبة ، مثل العظام. يصف البروتوكول كذلك التنميط اللاحق للمستضدات السطحية وشحنات البروتين من المركبات الكهربائية ، والتي يمكن تتبعها بالتالي لاشتقاقاتها وتحديدها بمكونات تتعلق بالوظيفة المحتملة. ستكون هذه الطريقة مفيدة للتحليل الترابطي والوظيفي والميكانيكي للمركبات الكهربائية في الدراسات البيولوجية والفسيولوجية والمرضية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اقتراح الحويصلات خارج الخلية (EVs) لتحديد الهياكل خارج الخلية المغلقة بطبقة ثنائية من الدهون1 ، والتي تلعب أدوارا مهمة في مختلف الأحداث الفسيولوجية والمرضية2. يمكن تقسيم EVs التي تطلقها الخلايا السليمة على نطاق واسع إلى فئتين رئيسيتين ، وهما exosomes (أو EVs الصغيرة) التي تشكلت من خلال مسار الاتجار داخل الخلايا3 والحويصلات الدقيقة (أو EVs الكبيرة) التي طورها التبرعم الخارجي لغشاء البلازماللخلية 4. بينما تركز العديد من الدراسات على وظيفة EVs التي تم جمعها من الخلايا المستزرعة في المختبر5 ، فإن EVs المشتقة من الدورة الدموية أو الأنسجة أكثر تعقيدا وغير متجانسة ، والتي لها ميزة تعكس الحالة الحقيقية للكائن الحي في الجسم الحي6. علاوة على ذلك ، يمكن لجميع أنواع الأنسجة تقريبا إنتاج EVs في الجسم الحي ، ويمكن أن تعمل هذه المركبات الكهربائية كرسائل داخل الأنسجة أو يتم نقلها بواسطة سوائل الجسم المختلفة ، وخاصة الدم المحيطي ، لتسهيل الاتصال الجهازي7. EVs في الدورة الدموية والأنسجة هي أيضا أهداف لتشخيص الأمراض وعلاجها8.

في حين تمت دراسة الإكسوسومات بشكل مكثف في السنوات الأخيرة ، فإن الحويصلات الدقيقة لها أيضا وظائف بيولوجية مهمة ، والتي يمكن استخراجها بسهولة دون الطرد المركزي الفائق ، وبالتالي تعزيز البحوث الأساسية والسريرية9. والجدير بالذكر أن القضية الحرجة المتعلقة بالمركبات الكهربائية المعزولة من الدورة الدموية والأنسجة هي أنها مشتقة من أنواع مختلفة من الخلايا10. نظرا لأن الحويصلات الدقيقة يتم نفخها من غشاء البلازما وتتميز بوفرة من جزيئات سطح الخلية9 ، فإن استخدام علامات غشاء الخلية الأم لتحديد الأصل الخلوي لهذه المركبات الكهربائية أمر ممكن. على وجه التحديد ، يمكن تطبيق تقنية قياس التدفق الخلوي (FC) للكشف عن علامات الغشاء. علاوة على ذلك ، يمكن للباحثين عزل المركبات الكهربائية وإجراء مزيد من التحليلات بناء على الشحنات الوظيفية.

يوفر البروتوكول الحالي إجراء شاملا لاستخراج وتوصيف المركبات الكهربائية من عينات الجسم الحي. يتم عزل المركبات الكهربائية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي ، ويشمل توصيف المركبات الكهربائية التحديد المورفولوجي عبر تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) ، وتحليل الأصل عبر FC ، وتحليل شحنة البروتين عبر اللطخة الغربية. يتم استخدام بلازما الدم وعظم الفك العلوي للفئران كممثلين. يمكن للباحثين الرجوع إلى هذا البروتوكول للمركبات الكهربائية من مصادر أخرى وإجراء التعديلات المقابلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية للجامعة الطبية العسكرية الرابعة وإرشادات ARRIVE. بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام الفئران C57Bl / 6 البالغة من العمر 8 أسابيع (لا يوجد تفضيل للإناث أو الذكور). يوضح الشكل 1 الخطوات المتبعة في عزل المركبات الكهربائية للبلازما والأنسجة. يتم أخذ البلازما كممثل لوصف إجراء عزل EV من سوائل الجسم. يتم أخذ عظم الفك العلوي كممثل لشرح إجراء عزل EV من الأنسجة الصلبة.

1. تحضير عينات البلازما وعظم الفك العلوي

  1. قم بإعداد عينات البلازما باتباع الخطوات أدناه.
    1. تحديد وزن جسم الماوس باستخدام ميزان المختبر القياسي.
    2. أضف 20 ميكرولتر ، 2 مجم / مل من الهيبارين إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل واستخدم جهاز الخلاط (انظر جدول المواد) للسماح للهيبارين بالالتصاق بجدار الأنبوب.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام أنابيب منع التخثر مباشرة لجمع الدم.
    3. تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق ل 50 ملغم / كغم من الصوديوم بنتوباربيتال (انظر جدول المواد). أمسك عنق الفأر بالإبهام والسبابة ، ثم ثبت الذيل والساق الخلفية اليسرى بالإصبع الصغير وحقن الصوديوم البنتوباربيتال بحقنة حقن 1 مل بعد تعريض البطن.
    4. تأكد من تخدير الفأر بشكل صحيح بناء على عدم وجود منعكس القرنية ورد فعل الأطراف عند قرص وسادة القدم.
    5. حلق الشعر على الوجه ورموش العينين بمقص منحني.
    6. أمسك جلد الرقبة للماوس واضغط على الجلد حول العينين إلى الجزء الخلفي من الرقبة حتى تبرز مقلة العين. استخدم ملاقط العيون لتثبيت مقلة العين بسرعة ، وجمع تدفق الدم باستخدام أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل المعدة في الخطوة 1.1.2. التضحية بالماوس عن طريق خلع فقرة عنق الرحم.
      تنبيه: كن حذرا مع الشعر والرموش لأنها قد تسبب انحلال الدم.
    7. اقلب الأنبوب برفق رأسا على عقب عدة مرات لمنع تخثر الدم.
      تنبيه: اقلب الأنبوب رأسا على عقب في أسرع وقت ممكن.
    8. الطرد المركزي عينة الدم لمدة 15 دقيقة عند 1200 × جم عند 4 درجات مئوية.
    9. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة ونظيفة سعة 1.5 مل ، واستخدم عينة البلازما على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لبضع ساعات.
    10. تمييع طاف مع حجم متساو من 1x محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS) وتخلط جيدا.
      ملاحظة: البروتوكول المقدم أعلاه لجمع البلازما قاتل. يمكن أيضا جمع الدم من خلال ثقب الوريد تحت الترقوة11 دون التضحية بالماوس.
  2. قم بإعداد عينات عظم الفك العلوي باتباع الخطوات أدناه.
    1. عزل عظم الفك العلوي بملاقط ومقص العيون وغسلها ب PBS للتخلص من الأنسجة الرخوة بالملاقط.
    2. ضع عظم الفك العلوي في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل وقطع العظم إلى قطع صغيرة (يجب أن يكون الحجم أقل من 1 مم في القطر) بالمقص. أضف كمية معينة من الليبراز (5 ميكروغرام / مل ، انظر جدول المواد) لتغطية الأنسجة (عادة 1 مل لعينات العظام من فأر عمره 8 أسابيع) ، ثم احتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. أجهزة الطرد المركزي العينة عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. انقل بعناية المادة الطافية باستخدام ماصة إلى أنابيب طرد مركزي جديدة ونظيفة سعة 1.5 مل.

2. استخراج المركبات الكهربائية

  1. أجهزة الطرد المركزي العينات (المحضرة في الخطوة 1.1.10 والخطوة 1.2.4) لمدة 15 دقيقة عند 2500 × جم (4 درجات مئوية) لإزالة حطام الخلايا الكبيرة والصفائح الدموية المتبقية.
  2. انقل المواد الطافية بعناية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة ونظيفة سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 16800 × جم (4 درجات مئوية).
    ملاحظة: يمكن ضبط سرعة الطرد المركزي على أكثر من 10000 × جم لاستخراج المركبات الكهربائية12. كلما زادت سرعة أجهزة الطرد المركزي ، يمكن الحصول على كمية أكبر من المركبات الكهربائية. نظرا لأن الحد الأقصى لسرعة جهاز الطرد المركزي الذي استخدمناه هو 16800 × جم (انظر جدول المواد) ، فقد اخترنا هذه السرعة في هذا البروتوكول.
  3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في كل أنبوب ب 1 مل من برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 16800 × جم (4 درجات مئوية).
  4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في كل أنبوب باستخدام 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. قم بتخزين هذه العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تقل عن 24 ساعة فقط ، أو يفضل استخدامها على الفور للتحليلات التالية (الخطوات 3-5).
    تنبيه: التخزين عند -80 درجة مئوية غير مقبول ، لأن هذا سيقلل من تركيز المركبات الكهربائية ويزيد من أحجام الجسيمات في المركبات الكهربائية13 ، مما يؤثر على التحليل التالي للمركبات الكهربائية.

3. التعرف المورفولوجي للمركبات الكهربائية

  1. إجراء تحليل NTA.
    1. وفقا لكمية EVs (يتم الحكم عليها تقريبا من خلال حجم الكريات ، فإن جزيئات البلازما 50 ميكرولتر هي الحد الأدنى) ، قم بنقل 5-50 ميكرولتر من إعادة التعليق (الخطوة 2.4) ، وقم بتخفيفه في 10 مل من محلول المخزن المؤقت (تمت تصفية PBS بفلتر 0.22 ميكرومتر) ، واخلطه مع أطراف ماصة صغيرة سعة 1 مل بشكل كاف. استخدم هذا التعليق النهائي لقياس الجسيمات.
    2. استخدم حقنة معقمة سعة 1 مل لحقن ما لا يقل عن 5 مل من الماء المقطر بسرعة معتدلة وثابتة حتى يصبح عدد الجسيمات المعروضة على واجهة الكشف أقل من خمسة.
      ملاحظة: بعد حقن 1 مل من الماء المقطر عبر القناة بأكملها ، يظهر عدد الجسيمات مباشرة على واجهة الكشف. إذا كان العدد لا يزال أكثر من خمسة ، فاستمر في حقن 1 مل من الماء المقطر حتى يتم استيفاء المعايير.
    3. أعد تكوين 1 ميكرولتر من محلول المعايرة في 1 مل من الماء المقطر لتوليد محلول أولي ، ثم خذ 100 ميكرولتر من المحلول الأولي إلى 25 مل من الماء المقطر لإعداد محلول مخزون قياسي (1: 250,000). تخزين هذا الكاشف العامل في 4 °C لمدة 1 أسبوع.
    4. قم بمعايرة أداة NTA باستخدام حل المخزون القياسي (الخطوة 3.1.3). قم بحقن 1-5 مل من محلول معايرة العمل بحقنة معقمة سعة 1 مل لشطف قناة الماكينة حتى يتراوح عدد الجسيمات المعروضة على واجهة الكشف بين 50-400 (يفضل حوالي 300). قم بتشغيل برنامج المعايرة.
    5. كرر الخطوة 3.1.2 لشطف قناة الماكينة قبل كل قياس للعينة.
    6. استخدم حقنة معقمة سعة 1 مل لحقن ما لا يقل عن 2 مل من المحلول العازل لشطف قناة الماكينة بسرعة ثابتة حتى يصبح عدد الجسيمات المعروضة على واجهة الكشف أقل من 10.
    7. حقن 1 مل من عينة EV المحضرة في الخطوة 3.1.1 بسرعة معتدلة وثابتة (السرعة الموصى بها هي 0.5-1 مل / ثانية).
      ملاحظة: التركيز الأمثل للجسيمات هو جعل عدد الجسيمات المعروضة على واجهة الكشف يتراوح بين 50-400 ، ويفضل أن يكون حوالي 300. إذا كان عدد الجسيمات مرتفعا جدا ، كرر الخطوة 3.1.2 لشطف قناة الماكينة على الفور لتجنب احتباس الجسيمات عند جدار القناة وضبط تركيز عينة EV بالخطوة 3.1.1 ، ثم كرر من الخطوة 3.1.5.
    8. قم بإجراء تحليل الجسيمات وإنشاء تقارير التحليل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    9. إذا كانت العينة ثمينة ، فقم بضخ عينة EV مرة أخرى باستخدام حقنة سعة 1 مل وجمعها في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل. كرر الخطوة 2.2 لاستخراج المركبات الكهربائية.
    10. بعد اكتشاف جميع العينات ، قم بحقن ما لا يقل عن 2 مل من المحلول العازل لقناة الماكينة ثم حقن 5 مل على الأقل من الماء المقطر حتى يصبح عدد الجسيمات المعروضة على واجهة الكشف أقل من خمسة.
    11. استخدم حقنة معقمة سعة 5 مل لحقن ما لا يقل عن 10 مل من الهواء بسرعة ثابتة (السرعة الموصى بها هي 1 مل / ثانية) لإزالة الماء في القناة.
  2. إجراء تحليل TEM.
    ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية باستخدام أنظمة تعليق جديدة للمركبات الكهربائية. شبكة المجهر الإلكتروني المطلي بالكربون formvar لها جانبان ، مع كون جانب العمل مضيئا في الشبكات المركزية. الحد الأدنى لحجم البلازما لاستخراج EVs للإجراء أدناه هو 50 ميكرولتر.
    1. امزج عينة EV (الخطوة 2.4) مع حجم متساو من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). قم بإيداع 4 ميكرولتر من المركبات الكهربائية على شبكة واحدة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. ضع أربع قطرات من PBS (قطرة واحدة تساوي 50 ميكرولتر) على ورقة من فيلم البولي إيثيلين (انظر جدول المواد). انقل الشبكات بملاقط مجهرية نظيفة واغسل جانب العمل من الشبكة في PBS من قطرة إلى أخرى.
    3. استخدم أوراق الترشيح لإزالة PBS الإضافية التي بقيت في الشبكات.
    4. احتضان جانب العمل من الشبكة إلى 1٪ حمض الفوسفوتونجستيك (انظر جدول المواد) لمدة دقيقتين ثم كرر الخطوة 3.2.2.
      تنبيه: نظرا لأن حمض الفوسفوتونجستيك سام ، يجب تشغيل هذا الإجراء في غطاء الدخان ، ويجب إعادة تدوير حمض الفوسفوتونجستيك الزائد على وجه التحديد بدلا من التخلص منه مباشرة.
    5. ضع الشبكات ووجهها لأعلى في طبق 10 سم مغطى بأوراق الترشيح. يمكن تخزين الشبكات في RT لعدة سنوات.
    6. راقب الشبكات تحت المجهر الإلكتروني باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: لضمان ملاحظة الجسيمات المفردة ، يجب ضبط تركيز المركبات الكهربائية ، ويجب أن يكون التعليق واضحا دون تعكر واضح. قبل الإسقاط ، يجب أن تكون العينة مختلطة جيدا. يتم عرض تحليلات TEM و NTA التمثيلية في الشكل 2.

4. تحليل منشأ المركبات الكهربائية

ملاحظة: يتطلب تحديد الأصل الخلوي للمركبات الكهربائية تطبيق الأجسام المضادة لعلامات غشاء الخلية النموذجية. الحد الأدنى لحجم البلازما لاستخراج EVs للإجراء أدناه هو 300 ميكرولتر. بناء على هياكل الطبقة الثنائية الدهنية للمركبات الكهربائية ، يمكن استخدام صبغة الغشاء لتمييزها. بالنسبة لعينات بلازما الدم ، يتم اختيار CD18 للخلايا الليمفاوية14 للتمثيل. بالنسبة لعينات عظم الفك العلوي ، يتم اختيار المستقبلات المرتبطة بالخلايا الآكلة للعظم (OSCAR) ل osteoclasts15 كمثال. قبل FC ، تأكد من تكييف مقياس التدفق الخلوي لقياس EVs16 ، حيث يختلف حد الحجم الأدنى إلى حد كبير بين مقاييس التدفق الخلوي المتميزة.

  1. أعد تعليق العينات (الخطوة 2.4) باستخدام 500 ميكرولتر من PBS وانقل 50 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي جديد ونظيف سعة 1.5 مل كعنصر تحكم فارغ (الأنبوب A) و 50 ميكرولتر أخرى في أنبوب طرد مركزي جديد ونظيف سعة 1.5 مل كأنبوب تلطيخ بسيط ل FITC (الأنبوب B). أضف 0.5 ميكرولتر من صبغة الغشاء إلى الأنبوب الأساسي لتلطيخ الغشاء. احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
  2. جهاز الطرد المركزي الأنبوب الأساسي لمدة 30 دقيقة عند 16800 × جم (4 درجات مئوية). تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  3. قسم كل عينة سعة 50 ميكرولتر إلى أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل لأنابيب التلوين البسيطة ل PE (الأنبوب C) ، وتلطيخ علامات السطح (الأنبوب D) ، وأدوات التحكم في الأجسام المضادة الثانوية فقط (الأنبوب E).
  4. أضف الجسم المضاد الأساسي ل OSCAR في عينات EV العظمية بالإضافة إلى الجسم المضاد CD18 في عينات EV البلازما (انظر جدول المواد) إلى الأنبوب B (الخطوة 4.1) والأنبوب D (الخطوة 4.3) بشكل منفصل (مخفف عند 1: 100). احتضان لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  5. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 30 دقيقة عند 16800 × جم (4 درجات مئوية). تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الكريات ب 500 ميكرولتر من PBS ، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى لمدة 30 دقيقة عند 16800 × جم (4 درجات مئوية) لإزالة الأجسام المضادة الأولية الإضافية.
  6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات ب 50 ميكرولتر من PBS ، متبوعا بإضافة أجسام مضادة ثانوية مقترنة ب FITC (انظر جدول المواد) ، على التوالي (مخففة عند 1: 200) (الأنبوب E). أضف نفس الأجسام المضادة الثانوية إلى الأنبوب B (الخطوة 4.1) والأنبوب D (الخطوة 4.3). احتضان جميع الأنابيب لمدة 1 ساعة ، عند 4 درجات مئوية في الظلام.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة المترافقة بالفلورة المباشرة لمعالجة اكتشاف FC باستخدام عناصر التحكم المناسبة في النمط المتماثل.
  7. قم بتخفيف قطرة واحدة من تعليق حبات بحجم 0.2 و 0.5 و 1 ميكرومتر (انظر جدول المواد) على التوالي إلى 1 مل من PBS ، وقم بتشغيل كل حبة حجم أولا للتأكد من البوابة المختارة للمركبات الكهربائية. قم بتعيين عتبة مقياس التدفق الخلوي للبحث عن الخرز وسكان EV باستخدام تشتت أمامي مناسب (FSC) وتشتت جانبي (SSC).
    1. اضبط الحالة النهائية على حساب 100000 جسيم مصبوغ بالغشاء. قم بتحليل العينة عبر مقياس التدفق الخلوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). النتائج التمثيلية موضحة في الشكل 3.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام معدات NTA ذات القنوات الفلورية لتحليل المنشأ ، وإعداد العينة هو نفسه FC.

5. تحليل محتوى البروتين من EVs

ملاحظة: يتم إجراء تحليل محتوى البروتين داخل المركبات الكهربائية عن طريق اللطخة الغربية. على سبيل المثال ، تم اختيار EVs البلازما والعظام لتحليل 6-فوسفوغلوكونات ديهيدروجيناز (PGD) وبيروفات كيناز M2 (PKM2) لحالة التمثيل الغذائي. تم استخدام Golgin84 (عضية Golgi) كعنصر تحكم سلبي ، وتم استخدام Flotillin (بروتين الغشاء) و Caveolin (بروتين متكامل من caveolae) و β-actin (الهيكل الخلوي)17 كعنصر تحكم إيجابي في EVs مقارنة بعينات الخلايا. تم اختيار Mitofilin و α-Actinin-4 كعلامات EV كبيرة ، بينما تم اختيار CD9 و CD81 كعلامات EV صغيرة لإظهار المجموعات الفرعيةEV 18. تم اختيار Apoa1 كعلامة الجسيمات الشحمية في البلازما19. للحصول على تفاصيل الكاشف ذات الصلة ، انظر جدول المواد.

  1. أعد تعليق الكريات (الخطوة 2.4) في 50 ميكرولتر من محلول تحلل RIPA ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  2. حدد تركيزات البروتين لجميع العينات في الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئرا بواسطة مقايسة بروتين BCA باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    1. خفف 2 ملغم/مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) مع 0.9٪ من محلول ملحي طبيعي (NS) (يحتوي على 0.9٪ (وزن/حجم) من كلوريد الصوديوم) إلى 0.5 ملغم/مل. أضف 0.5 ملغم / مل من BSA و 0.9٪ من NS إلى ثلاثة آبار مكررة بأحجام معينة ، كما هو موضح في الجدول 1.
    2. أسقط 2 ميكرولتر من العينات (الخطوة 5.1) وأضف 18 ميكرولتر من NS إلى ثلاثة آبار مكررة بشكل منفصل.
    3. قم بإعداد محلول عملي عن طريق خلط كاشف BCA A مع الكاشف B (50: 1 الكاشف A: B). أضف 200 ميكرولتر من محلول العمل إلى كل بئر ورجه برفق لمدة 30 ثانية.
    4. احتضان الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئرا لمدة 20-25 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    5. قم بقياس OD عند 596 نانومتر بواسطة مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد).
    6. تصدير البيانات.
    7. ارسم منحنى قياسيا واحسب تركيز البروتين في العينات.
  3. وفقا للنتائج ، قم بتخفيف العينات إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر مع 0.9٪ من NS و 5x SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت (250 mM Tris · حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 6.8 ، 10٪ SDS ، 30٪ (v / v) الجلسرين ، 10 مللي متر DTT ، 0.05٪ (وزن / حجم) بروموفينول أزرق ، انظر جدول المواد). أغلق الأنابيب بغشاء محكم وسخنها لمدة 5 دقائق عند 100 درجة مئوية.
  4. قم بتحميل العينات وسلم البروتين في تركيز متدرج من 4٪ -20٪ Hepes-Tris gel (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: اختر نسبة الجل وفقا للوزن الجزيئي للبروتينات ذات الأهمية.
  5. قم بتشغيل الجل في المخزن المؤقت للتشغيل عند 80 فولت حتى تشكل البروتينات خطا ، ثم قم بالتبديل إلى 120 فولت لمدة 1 ساعة حتى تصبح صبغة التحميل في قاع الجل.
    ملاحظة: قد يختلف وقت التشغيل وفقا للمعدات المستخدمة أو نوع الجل وتركيزه.
  6. انقل الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) (انظر جدول المواد) ، المحتضن مسبقا في كحول الميثيل لمدة 20 ثانية. استخدم نظام النقل الرطب للنقل لمدة 1 ساعة عند 200 مللي أمبير.
    تنبيه: تأكد من عدم وجود فقاعة داخل نظام النقل والحفاظ على غشاء PVDF رطبا.
    ملاحظة: قد يختلف وقت النقل وفقا للوزن الجزيئي للبروتين المستهدف ؛ 1 دينار كويتي يحتاج عادة إلى دقيقة واحدة.
  7. قم بإعداد مخزن مؤقت لحجب BSA بنسبة 5٪ عن طريق إضافة 2.5 جم من BSA (انظر جدول المواد) في 50 مل من محلول ملحي Tween (TBST) (2 مل من Tween مضاف في 2 لتر من محلول PBS) في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. تحريك حتى يذوب مسحوق. سد الأغشية في هذا المخزن المؤقت لمدة 2 ساعة في RT مع الإثارة.
  8. احتضان الأغشية بأجسام مضادة أولية محددة مخففة ب TBST إلى تركيز مناسب (ميتوفيلين ، 1: 1000 ؛ α-أكتينين -4 ، 1: 1000 ؛ CD9 ، 1: 1000 ؛ CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; جولجين 84 ، 1: 1000 ؛ الأسطول-1، 1:1000; كافولين -1 ، 1: 1000 ؛ PGD ، 1: 1000 ؛ PKM2 ، 1: 1000 ؛ β-أكتين ، 1: 3000) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  9. اغسل الأغشية في المخزن المؤقت للغسيل (2 مل من توين مضاف في 2 لتر من محلول PBS) أربع مرات (15 دقيقة في كل مرة) ، واحتضان الأغشية بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة في 1: 4000 لمدة 1 ساعة في RT مع الإثارة.
  10. اغسل الأغشية في المخزن المؤقت للغسيل أربع مرات (15 دقيقة في كل مرة) ، وقم بتصوير الأغشية باستخدام مجموعة التلألؤ الكيميائي ونظام التصوير الهلامي (انظر جدول المواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفقا لسير العمل التجريبي ، يمكن استخراج EVs من الدم المحيطي والأنسجة الصلبة (الشكل 1). يبلغ عظم الفك العلوي للفأر الذي يبلغ من العمر 8 أسابيع حوالي 0.1 ± 0.05 جم ، ويمكن جمع حوالي 300 ميكرولتر من البلازما من الماوس. باتباع خطوات البروتوكول ، يمكن جمع 0.3 ملغ و 3 ميكروغرام من EVs ، على التوالي. كما تم تحليلها بواسطة TEM و NTA ، فإن الخصائص المورفولوجية النموذجية للمركبات الكهربائية هي حويصلات غشائية مستديرة على شكل كوب يتراوح قطرها من 50-300 نانومتر (الشكل 2). يم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند دراسة ميزات ومصير ووظيفة المركبات الكهربائية ، من الضروري عزل المركبات الكهربائية ذات العائد العالي والتلوث المنخفض. توجد طرق مختلفة لاستخراج المركبات الكهربائية ، مثل الطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC) ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، ومقايسات التقاط المناعة 4,20. هنا ، تم استخدام واحدة من أكثر الطرق شيوعا ، الطرد المركزي التفاضلي. مزايا هذا هو أنه لا يستغرق وقتا طويلا ، فإنه يولد غلة عالية من المركبات الكهربائية مع سهولة العزل عن عينات محدودة ، والقد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000974 و 81870796 و 82170988 و 81930025) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2019M663986 و BX20190380). نحن ممتنون للمساعدة التي قدمها المركز الوطني التجريبي للتدريس التجريبي للطب الأساسي (AMFU).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4٪ بارافورمالدهايد  Biosharp143174نقل المجهر الإلكتروني
Alexa fluor 488 الجسم المضاد الثانوي للماعزYeason34306ES60قياس التدفق الخلوي
Alexa fluor 488 الأجسام المضادة الثانويةالمضادة للأرانب InvitrogenA11008قياس التدفق الخلوي
المضاد CD18 Abcamab131044قياس التدفق الخلوي
المضاد للجسم المضاد CD81Abcamab109201لطخة غربية
مضادة للجسم المضاد ل CD9HuabioET1601-9لطخة غربية
الأجسام المضادة للميتوفيلينAbcamab110329اللطخة الغربية
APOA1 Rabbit pAbAbcloneA14211اللطخة الغربية
TIANGENPA115اللطخة الغربية
BLUeye سلم البروتين المصبغسيجما ألدريتش94964-500ULاللطخة الغربية
الأبقار الألبومينMP الطب الحيوي218072801اللطخة الغربية
Caveolin-1 الجسم المضادسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-53564اللطخة الغربية
CellMask بقعة غشاء البلازما البرتقاليةInvitrogenC10045التدفق الخلوي
التلألؤ الكيميائيAmersham BiosciencesN / Aلطخة
غربيةمقص التشغيل المنحنيJZ أداة جراحيةJ21040EV عزل
التوازن الإلكترونيZhi KeZK-DSTEV عزل
مقياس الطيف الضوئيBioTekN /A اللطخة الغربية
أنابيب EppendorfEppendorf3810XEV عزل
Flotillin-1 الجسم المضادPTM BIOPTM-5369اللطخة الغربية
نظام تصوير جلTanon4600Western blot
Golgin84Novusnbp1-83352شبكات اللطخة الغربية
- Formvar / Carbon Coated - Copper 200 meshPolysciences24915مجهر إلكتروني ناقل
محلول الهيبارينStemCell  7980EV عزل
Liberase من الدرجة البحثيةSigma-Aldrich5401127001عزل EV
ملاقط مجهريةJZ أداة جراحيةJD1020EV عزل
التدفق الخلوي NovoCyteACEAN / Aقياس التدفق الخلوي
Omni-PAGE Hepes-Tris Hepes 4 ~ 20٪ ، 10 آبارEpizymeLK206Western blot
OSCAR ( D-19) الجسم المضادسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-34235قياس التدفق
الخلوي PBS (2x)ZHHCPW013اللطخة الغربية
البنتوباربيتال الصوديومسيجما ألدريتش57-33-0التخدير
بيروكسيداز أفينيالماعز النقي المضاد للفأر IgG (H + L)جاكسون115-035-003اللطخة الغربية
بيروكسيداز أفينيالماعز النقي المضاد للأرانب IgG (H + L)جاكسون111-035-003اللطخة الغربية
حمض الفوسفوتونغستيكRHAWN12501-23-4مجهر إلكتروني
ناقل الحركة PKM2 (d78a4) xp rabbit   mab   ;إشارات الخلية4053tلطخة غربية
البولي إيثيلين (PE) فيلمشيانغ يي200150055مجهر إلكتروني ناقل
أغشية فلوريد البولي فينيلدين   ؛Roche3010040001لطخة غربية
مثبطات البروتيازRoche4693132001Western blot
المؤتلف المضاد للجسم المضاد الوراثي قبل الزرعAbcamab129199اللطخة الغربية
RIPA تحلل المخزنBeyotimeP0013اللطخة الغربية
SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت (5x)CwbioCW0027Sلطخة غربية
حجم الخرزInvitrogenF13839قياس التدفق
الخلوي منضدية أجهزة طرد مركزي صغيرة عالية السرعةهيتاشيCT15EEV عزل
مجهر إلكتروني ناقلهيتاشيH-7650مجهر إلكتروني ناقل
Tween-20MP Biomedicals19472اللطخة الغربية
دوامة خلاط GenieScientific IndustriesSI0425EV عزل
ZetaView BASIC NTA - مجهر فيديو تتبع الجسيمات النانوية PMX-120الجسيمات MetrixN / Aتحليل تتبع الجسيمات النانوية
ألفا ؛ - Actinin-4 Rabbit mAbAbcloneA3379Western blot
& beta - الأكتينCwbioCW0096Mلطخة غربية
مجموعة فحص البروتين BCA مصل قياس الحركة مقياس الحركة المؤقت الحركة الحركة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  3. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63(2018).
  6. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  7. Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043(2021).
  8. In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
  9. Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
  10. Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820(2019).
  11. Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556(2019).
  12. Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59(2019).
  13. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).
  14. Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
  15. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685(2020).
  16. Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526(2020).
  17. Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677(2017).
  18. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  19. Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582(2019).
  20. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).
  21. Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
  22. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  24. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).
  25. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  26. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238(2020).
  27. Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478(2017).
  28. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).
  29. Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
  30. Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
  31. Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
  32. Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030(2020).
  33. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة