يصف هذا البروتوكول نموذجا لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر القمي (NEC) في طبق باستخدام الأمعاء المعوية الصغيرة ذات القطبية المعكوسة ، مما يسمح بالوصول إلى السطح القمي. نحن نقدم بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي للكشف عن الاضطراب الظهاري المرتبط ب NEC وطريقة لتحديد جدوى المعوية القمية الخارجة الخاضعة لبروتوكول NEC-in-a-dish.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في المختبر نموذج معوي قمي من التهاب الأمعاء والقولون الناخر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) هو مرض مدمر يصيب الأطفال الخدج ، ويتميز بالتهاب الأمعاء والنخر. ظهرت المعوية مؤخرا كنظام واعد لنمذجة أمراض الجهاز الهضمي. ومع ذلك ، فإن الطرق المستخدمة حاليا للتلاعب المعوي إما تفتقر إلى الوصول إلى السطح القمي للظهارة (ثلاثي الأبعاد [3D]) أو تستغرق وقتا طويلا وكثيفة الاستخدام للموارد (الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد [2D]). غالبا ما تتطلب هذه الطرق خطوات إضافية ، مثل الحقن المجهري ، حتى يصبح النموذج قابلا للترجمة الفسيولوجية. هنا ، نصف بروتوكولا ذا صلة فسيولوجية وغير مكلف لدراسة NEC في المختبر عن طريق عكس القطبية المعوية ، مما يؤدي إلى مواجهة السطح القمي للخارج (القمي للخارج). كما يتم توفير بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي لفحص سلامة الحاجز المعوي وتعبير البروتين الموصل بعد التعرض لعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) أو عديد السكاريد الشحمي (LPS) في ظل ظروف النورموكسيك أو نقص الأكسجين. كما يتم تقييم جدوى المعوية القمية 3D المعرضة ل normoxic أو hypoxic LPS أو TNF-α لمدة 24 ساعة. أظهرت المعوية المعرضة إما LPS أو TNF-α ، بالاشتراك مع نقص الأكسجة ، اضطرابا في البنية الظهارية ، وفقدان تعبير بروتين الوصلة الملتصقة ، وانخفاض في صلاحية الخلايا. يصف هذا البروتوكول نموذجا جديدا ل NEC-in-a-dish من القمي يقدم منصة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية وفعالة من حيث التكلفة لتحديد الأهداف الظهارية المحتملة لعلاجات NEC ودراسة الاستجابة المعوية المبكرة للعلاجات.
المقدمة
التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) ، وهو مرض التهابي حاد في الأمعاء الدقيقة يحدث في ما يصل إلى 10 ٪ من الأطفال الخدج ، يرتبط عادة بارتفاع معدلات المراضة والوفيات 1,2. معدلات الوفيات التي تقترب من 50٪ في الرضع ذوي الوزن المنخفض جدا عند الولادة (<1500 جم) ، الذين يحتاجون إلى تدخل جراحي ، ليست غير شائعة3. في حين أن المسببات الدقيقة ل NEC غير مفهومة حاليا ، يعتقد أن عوامل الخطر ، مثل التغذية بالصيغة ، تتضاعف مع الشذوذ الفسيولوجي ، مثل dysbiosis ، وظهارة معوية غير ناضجة ، وحاجز معوي مختل وظيفيا ، في تطور المرض 2,4. على الرغم من الج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما. تم الحصول على عينات راحة الأمعاء الدقيقة من الرئيسيات غير البشرية الخدج (NHP ، 90٪ من الحمل ، البابون الزيتون ، Papio anubis) بعد القتل الرحيم لدراسة منفصلة (البروتوكول # 101523-16-039-I).
1. إنشاء نموذج NEC-in-a-dish المعوي القمي
- إعداد الوسائط والعلاجات المعوية
ملاحظة: بمجرد إعدادها باتباع تقنية التعقيم القياسية ، يمكن تخزين الوسائط عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.- تحضير وسائط خالية من المضادات الحيوية (AFM) عن طريق خلط 50 مل من وسائط الن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أصبح استخدام الأمعاء لنمذجة التهاب الأمعاء ، حتى في سياق التهاب الأمعاء والقولون الناخر ، شائعا الآن. ومع ذلك ، فإن معظم الطرق المستخدمة حاليا إما تفتقر إلى الوصول إلى السطح القمي للأمعاء ، مما يلغي الأهمية الفسيولوجية للمركبات المخصصة للاستخدام في نهاية المطاف كعلاجات عن طريق الفم ، أو أنها صعبة تقنيا وتستغرق وقتا طويلا ، كما هو الحال مع الطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاء. لزيادة فائدة النماذج المعوية الحالية في المختبر من NEC ، عكسنا قطبية الأمعاء ، وبالاقتران مع نقص الأكسجة لمدة 24 ساعة و LPS أو TNF-α ، أنشأ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يسمح التطور الأخير للنماذج المعوية المشتقة من الخبايا الظهارية المعوية بأنسجة مختبرية أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة التسبب في التهاب الأمعاء والقولون الناخر. على الرغم من تضمين جميع أنواع الخلايا المتمايزة الرئيسية في ظهارة الأمعاء ، إلا أن الأمعاء 3D لا تزال تخضع للعديد من القيود الهامة. يتم تعليق الأمعاء القاعدية التقليدية في قباب هيدروجيل 3D ECM ، والتي قد يحد تكوينها وكثافتها من الانتشار الطبيعي داخل بيئة زراعة الأنسجة39. الأهم من ذلك ، أن هذه الأمعاء توفر وصولا محدودا إلى.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه وليس لديهما تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم HC من خلال منحة P20GM134973 من المعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم KB من خلال منحة مؤسسة مستشفى الأطفال (CHF) ومؤسسة الصحة المشيخية (PHF). نشكر مختبر البيولوجيا الجزيئية وأبحاث قياس الخلايا في OUHSC على استخدام المرفق الأساسي ، الذي يوفر التصوير البؤري المنسق.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.5 م EDTA ، درجة الحموضة 8.0 | فيشر Scientific | 15575-020 | |
| 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة | فيشر Scientific | 05-408-129 | |
| 15 مل أنبوب مخروطي | VWR | 89039-666 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Waability Assay | Promega | G9681 | |
| Corning Costar مرفق منخفض للغاية 24 بئر Microplates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| غطاء زجاجي 24 مم × 60 مم | Thermo Scientific | 102460 | |
| الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-21202 | |
| الحمار المضاد للأرانب IgG المضاد ، Cy3 المترافق | Sigma-Aldrich | AP182C | |
| خليط لحم الخنزير المتوسط / المغذي من Dulbecco Modified Eagle's F-12 (DMEM-F12) مع 15 ملي مولار HEPES عازلة | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| الجسم المضاد E-cadherin (7H12) | Novus Biologicals | NBP2-19051 | |
| محلول الفورمالديهايد 4٪ ، مخزن مؤقت ، درجة الحموضة 6.9 | Millipore Sigma | 1004960700 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| ImageJ | فيجي | N / A | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (بشري) | STEMCELL Technologies | 06010 | |
| Leica SP8 مجهر متحد البؤر | Leica Biosystems | ||
| عديدات السكاريد الدهنية من الإشريكية القولونية O111: B4 ، منقاة بواسطة كروماتوغرافيا ترشيح الهلام | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| شرائح مجهر | فيشر Scientific | 12-544-7 | |
| مصل الحمار العادي | سيجما ألدريتش | 566460 | |
| Nunc MicroWell 96-Well ، Nunclon Delta المعالجة ، صفيحة | حرارية | ||
| PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، 1x [-] كالسيوم ، مغنيسيوم ، درجة الحموضة 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| إطالة الزجاج المضاد للبهتان مع NucBlue | Fisher Scientific | P36983 | |
| الأجسام المضادة المؤتلفة المضادة للفيلين [SP145] | Abcam | ab130751 | |
| مؤتلف TNF البشري - & بروتين ألفا 100 & مايكرو ؛ g | Bio-Techne | 210-TA-100 / CF | |
| SpectraMax iD3 متعدد الأوضاع قارئ صفيحة دقيقة | الأجهزة | ||
| Thermo Forma Series II حاضنة ثلاثية الغاز مغلفة بالماء ، 184L | Fisher Scientific | 3140 | |
| TO-PRO-3 يوديد (642/661) | Thermo Scientific | T3605 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| أنابيب ، 0.5 مل ، غطاء مسطح | Thermo Scientific | AB0350 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 |
المراجع
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776(2011).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Jo....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
