Method Article

توسيع فهم البيئة الدقيقة للورم باستخدام تصوير قياس الطيف الكتلي لعينات الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين المضمنة

DOI:

10.3791/64015

⸱

June 29th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في عصر العلاج المناعي للسرطان ، زاد الاهتمام بتوضيح ديناميكيات البيئة الدقيقة للورم بشكل ملحوظ. يفصل هذا البروتوكول تقنية تصوير مطياف الكتلة فيما يتعلق بخطوات التلطيخ والتصوير ، والتي تسمح بالتحليل المكاني المتعدد الإرسال للغاية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أحدث التقدم في العلاجات القائمة على المناعة ثورة في علاج السرطان وأبحاثه. وقد أدى ذلك إلى تزايد الطلب على توصيف المشهد المناعي للورم. على الرغم من أن الكيمياء النسيجية المناعية القياسية مناسبة لدراسة بنية الأنسجة ، إلا أنها تقتصر على تحليل عدد صغير من العلامات. على العكس من ذلك ، يمكن لتقنيات مثل قياس التدفق الخلوي تقييم علامات متعددة في وقت واحد ، على الرغم من فقدان المعلومات حول مورفولوجيا الأنسجة. في السنوات الأخيرة ، ظهرت استراتيجيات متعددة الإرسال تدمج التحليل الظاهري والمكاني كنهج شاملة لتوصيف المشهد المناعي للورم. هنا ، نناقش تقنية مبتكرة تجمع بين الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية ومطياف الكتلة الأيونية الثانوية مع التركيز على الخطوات التقنية في تطوير الفحص وتحسينه ، وإعداد الأنسجة ، والحصول على الصور ومعالجتها. قبل تلطيخ ، يجب تطوير لوحة الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية وتحسينها. يدعم نظام الصور عالي الضفيرة هذا ما يصل إلى 40 جسما مضادا موسوما بعلامات معدنية في قسم واحد من الأنسجة. وتجدر الإشارة إلى أن خطر تداخل الإشارة يزداد مع زيادة عدد العلامات المدرجة في اللوحة. بعد تصميم اللوحة ، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لتعيين النظائر المعدنية للجسم المضاد لتقليل هذا التداخل. يتم إجراء اختبار اللوحة الأولي باستخدام مجموعة فرعية صغيرة من الأجسام المضادة والاختبار اللاحق للوحة بأكملها في أنسجة التحكم. يتم الحصول على أقسام الأنسجة المثبتة بالفورمالين والبارافين وتركيبها على شرائح مغلفة بالذهب وملطخة أكثر. يستغرق التلطيخ 2 أيام ويشبه إلى حد كبير تلطيخ المناعة النسيجية الكيميائية القياسية. بمجرد تلطيخ العينات ، يتم وضعها في أداة الحصول على الصور. يتم تحديد حقول العرض، ويتم الحصول على الصور وتحميلها وتخزينها. المرحلة الأخيرة هي إعداد الصور لتصفية وإزالة التداخل باستخدام برنامج معالجة الصور الخاص بالنظام. عيب هذه المنصة هو عدم وجود برامج تحليلية. ومع ذلك ، يتم دعم الصور التي تم إنشاؤها بواسطة برامج علم الأمراض الحسابية المختلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد أهمية أنواع الخلايا العديدة المحيطة بمجموعات الأورام النسيلة عنصرا حاسما في تصنيف التسرطن. وقد ازداد الاهتمام بتوضيح تكوين وتفاعلات البيئة الدقيقة للورم (TME) باستمرار بعد إنشاء العلاج القائم على المناعة كجزء من ترسانة علاج السرطان. لذلك ، تحولت استراتيجيات العلاج من نهج يركز على الورم إلى نهج يركز على TME1.

زادت الجهود المبذولة لتوضيح أدوار الخلايا المناعية في مراقبة الورم وتطور السرطان بشكل لافت للنظر في السنوات الأخيرة 2,3. في البحوث الطبية ، نشأت مجموعة كبيرة من الأساليب ، بما في ذلك الأساليب القائمة على قياس الخلايا وتقنيات التصوير أحادية البلكس والمتعددة ، كجزء من هذه المحاولة لفك رموز التفاعلات الفريدة لعناصر متعددة من TMEs.

تركز الطرق الرائدة مثل قياس التدفق الخلوي (اخترع في 1960s) ، وفرز الخلايا المنشطة بالفلور ، وقياس الخلايا الجماعية بشكل أساسي على تحديد مكونات TMEوقياسها كميا 4. على الرغم من أن التقنيات الكمية القائمة على قياس الخلايا تسمح بالتنميط الظاهري للمناظر الطبيعية المناعية ، إلا أن تحديد التوزيع المكاني الخلوي أمر مستحيل. على العكس من ذلك ، فإن طرقا مثل الكيمياء النسيجية المناعية أحادية البلكس القياسية تحافظ على بنية الأنسجة وتمكن الباحثين من تحليل التوزيع الخلوي ، على الرغم من أن انخفاض عدد الأهداف في قسم نسيج واحد هو قيد على هذه الطرق 5,6. على مدى السنوات العديدة الماضية ، ظهرت تقنيات التصوير متعددة الإرسال لدقة الخلية الواحدة مثل التألق المناعي المتعدد ، والتصوير الفلوري بالترميز الشريطي ، وقياس الطيف الكتلي التصويري كاستراتيجيات شاملة للحصول على معلومات حول تلطيخ العلامات المتزامنة باستخدام نفس قسم الأنسجة7.

نقدم هنا تقنية تجمع بين الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن وقياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي وتمكن من تحديد كمية دقة الخلية الواحدة ، والتعبير المشترك للعلامة (النمط الظاهري) ، والتحليل المكاني باستخدام عينات الأنسجة الثابتة من الفورمالين ، والبارافين المدمج (FFPE) ، وعينات الأنسجة المجمدة الطازجة (FF) 8,9. عينات FFPE هي المواد الأكثر استخداما على نطاق واسع لأرشفة عينات الأنسجة وتمثل موردا متاحا بسهولة أكبر لتقنيات التصوير متعددة الإرسال من العينات المجمدة الطازجة10. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه التقنية إمكانية استعادة الصور بعد أشهر. هنا ، نناقش بروتوكولات التلطيخ ومعالجة الصور باستخدام عينات أنسجة FFPE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على عينات الأنسجة لأغراض البحث وفقا لمجلس المراجعة المؤسسية لمركز إم دي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس ، وتم إلغاء تحديد العينات بشكل أكبر.

1. اختيار الأجسام المضادة

  1. حدد أسئلة البحث لاختيار أفضل استنساخ الأجسام المضادة المتاحة. استخدم أطلس البروتين البشري والأبحاث المنشورة ومواقع الشركات المصنعة للأجسام المضادة كموارد بحثية.
    ملاحظة: يعد اختيار عناصر التحكم في الأنسجة البشرية المناسبة ونفس عناصر التحكم في الأنسجة البشرية المراد تلطيخها في الخطوات المختلفة أمرا بالغ الأهمية للتأكد من تلطيخ العلامات بشكل صحيح وفي المكان المناسب وفي المقصورة الخلوية الصحيحة. يوصى دائما باستخدام مصفوفة صغيرة من الأنسجة الدقيقة (TMA) بما في ذلك الأنسجة الطبيعية والأنسجة الورمية للتحقق من صحة التلطيخ.
  2. استخدم فقط الأجسام المضادة الخالية من الناقل لتصميم اللوحة.
    ملاحظة: يلزم استخدام تركيبات الأجسام المضادة الخالية من الناقل في حالة عدم توفر جسم مضاد تجاري خال من الناقل؛ يمكن استخدام مجموعات التنقية لضبط الجسم المضاد على التركيبة الصحيحة. من المعروف أن إضافات البروتين مثل ألبومين مصل البقر تقلل من قدرة الاقتران.
  3. اختبار ومعايرة كل جسم مضاد باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية الكروموجينية القياسية لتحديد النمط دون الخلوي لتعبير العلامة ؛ غشاء ، سيتوبلازم ، أو تلطيخ نووي ؛ والتعبير في خلايا محددة في الأنسجة الضابطة.
    ملاحظة: ومع ذلك ، يجب اختبار كل جسم مضاد في سيترات الرقم الهيدروجيني 6 وحمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) ، ويجب تحديد ما إذا كانت اللوحة ستكون ملطخة بسيترات الأس الهيدروجيني 6 أو الرقم الهيدروجيني 9 EDTA. يوصى باستخدام الرقم الهيدروجيني 9 EDTA للحصول على إشارات جيدة ، خاصة عند العمل مع هذه المنهجية.
  4. اختر تركيز التلطيخ الأمثل وفقا لنمط التعبير في عناصر التحكم الإيجابية.
  5. قم بتعيين كل جسم مضاد لأحد النظائر المعدنية المتاحة وفقا لوفرة العلامة الكيميائية النسيجية المناعية ، والتوطين تحت الخلوي ، والتعبير الخلوي المشترك مع الأهداف الأخرى.
  6. قم بتلطيخ الجسم المضاد بالمعدن المعين المقابل ومقارنته بالتعبير في نفس نسيج التحكم المستخدم سابقا.
    ملاحظة: يبدأ اقتران معادن الأجسام المضادة بتحضير الأجسام المضادة وتقليلها والاقتران اللاحق (الملف التكميلي 1). كل أنبوب بوليمر محمل بالمعدن يكفي لوضع علامات على 100 ميكروغرام من الجسم المضاد.

2. تصميم لوحة الأجسام المضادة

  1. إنشاء دفعات صغيرة من تلطيخ الأجسام المضادة. اختبر ما يصل إلى خمس علامات في كوكتيل.
    ملاحظة: إن اختبار الأجسام المضادة التي تم اقترانها وتحليلها بالفعل باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية على دفعات يسهل التحديد المبكر لتداخلات القنوات ويوفر الفرصة لإعادة اقتران الأجسام المضادة بمعدن آخر. كما أنه يوفر فرصة لتقييم التعبير المشترك المناسب للعلامة.
  2. قم بتلطيخ كل دفعة صغيرة بأربعة تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة (0.05 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، و 4.0 ميكروغرام / مل).
    ملاحظة: مقارنة العدارات المختلفة، وتحديد تركيز الأجسام المضادة التي تؤدي إلى الموقع الصحيح وأعلى تعبير مع الحد الأدنى من تلطيخ الخلفية (أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء).

3. FFPE تقسيم الأنسجة

  1. حدد شرائح مطلية بالذهب (خاصة لهذا الغرض) واحتفظ بها بالقرب من الميكروتوم. قم بإعداد الميكروتوم عن طريق إدخال شفرة جديدة في الحامل. اضبط سمك القسم على 4-5 ميكرومتر.
  2. ضع كتل FFPE على الجليد قبل التقسيم. قم بإعداد حمام تعويم الأنسجة عن طريق تسخين الماء المقطر أو الماء منزوع الأيونات (diH2O) إلى 40-45 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخدام diH2O أو الماء المقطر يقلل من احتمال التلوث.
  3. ابدأ التقسيم. ضع قسم الأنسجة في الماء باستخدام ملاقط واتركه يتسطح. استخدم الشرائح لإزالة مقاطع الأنسجة من الماء.
  4. ضع الشرائح في رف منزلق واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

4. FFPE تلطيخ الأجسام المضادة

ملاحظة: تتم عملية التلطيخ في يومين منفصلين.

تنبيه: الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول يحتمل أن تكون قابلة للتآكل وتمثل مخاطر على الجلد والعينين. ينصح بارتداء القفازات ومعطف المختبر ومعدات واقية للعين والوجه وجزء من سياسة السلامة البيولوجية لمؤسستنا.

  1. إعداد الكاشف (اليوم 1)
    1. قم بتخفيف 50 مل من 20x محلول ملحي مخزن مؤقتا ب Tris مع Tween (TBS-T) إلى 950 مل من diH2O لصنع 1 لتر من TBS-T.
    2. قم بتخفيف 8 مل من 10x من حمض Tris-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) إلى 72 مل من diH2O لصنع محلول استرجاع epitope 1x الناجم عن الحرارة (HIER).
    3. قم بتخفيف مصل الحمير في 1x TBS-T إلى تركيز نهائي بنسبة 5٪ لجعل المخزن المؤقت للحظر. يخزن المحلول على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
  2. إعداد HIER: وحدة المعالجة المسبقة (PT)
    تنبيه: ارتد قفازات واقية كيميائية عند التعامل مع أي كواشف أو أجزاء مغمورة في أي كواشف مستخدمة في وحدة PT.
    1. قم بتخفيف 140 مل من 10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى 1260 مل من diH2O لجعل 1.4 لتر من 1x PBS. بدلا من ذلك ، قم بتخفيف سبعة أقراص PBS إلى 1.4 لتر من diH2O.
    2. املأ الخزان ب 1.4 لتر من PBS وضع حاوية غرفة الشرائح المعدة مع 100 مل من محلول 1x HIER في الخزان.
    3. سخن الخزان مسبقا في وحدة PT إلى 75 درجة مئوية.
  3. إزالة البارافين الزائد
    1. تخبز الشرائح على حرارة 70 درجة مئوية في الفرن لمدة 20 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: قد تحتاج بعض الأنسجة أو الأقسام إلى أوقات خبز أطول. وقت الخبز الموصى به لأنسجة المخ أو TMA هو 1 ساعة. يمكن تمديد هذا إلى 16 ساعة (بين عشية وضحاها) أو وفقا لتجربة المختبر.
    2. ضع الشرائح المخبوزة في حامل الشرائح وقم بتنفيذ خطوات الغسيل التالية على شاكر تحت غطاء الدخان. اغسل الشرائح في المحلول التالي: Xylene 2x لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ، 100٪ كحول 2x لمدة 30 ثانية (خالية من المعدن) ، 95٪ كحول 2x لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ، 80٪ كحول لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ، 70٪ كحول لمدة 30 ثانية (خالية من المعدن) ، و diH2O 2x لمدة 30 ثانية (خالية من المعدن).
    3. احتفظ بالشرائح في حاوية diH2O جديدة حتى تصبح جاهزة لاسترجاع المستضد.
      ملاحظة: يجب عدم تجفيف الشرائح حتى نهاية الإجراء.
  4. استرجاع المستضدات
    1. ضع الشرائح في غرفة شرائح مسخنة مسبقا تحتوي على مخزن مؤقت 1x HIER داخل وحدة PT. ضع الغطاء على الخزان. أغلق الغطاء وأغلقه.
    2. اضغط على زر القائمة في وحدة PT لفتح القائمة الرئيسية واضغط على زر دورة الإعداد (الوقت ودرجة الحرارة) لإنشاء برنامج مخصص.
    3. قم بتشغيل وحدة PT عند 97 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. بعد ذلك ، سوف تبرد وحدة PT تلقائيا إلى 65 درجة مئوية.
    4. قم بإزالة الشرائح من وحدة PT بمجرد الوصول إلى درجة حرارة 65 درجة مئوية. احتفظ بالشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: لن تفتح وحدة PT حتى تبرد درجة الحرارة إلى 65 درجة مئوية. لا تلمس السطح الذهبي للشرائح أثناء هذه العملية ، واستخدم القفازات دائما.
  5. حجب الأجسام المضادة
    1. اضبط الخلاط على 70 دورة في الدقيقة.
    2. اغسل الشرائح عن طريق غمسها في 1x TBS-T لمدة 5 دقائق 2x.
    3. باستخدام قلم حاجز مسعور ، ارسم حدا حول قسم الأنسجة على بعد 1 مم على الأقل من حواف الشريحة واتركه يجف لمدة 15-30 ثانية.
      ملاحظة: احرص على منع سائل القلم من لمس قسم الأنسجة لتجنب أي تداخل للأنسجة مع التلطيخ. لا تضغط على القلم لأسفل بشدة أثناء رسم الحاجز لتجنب التسريبات المحتملة. للحصول على أفضل نتائج للتلطيخ والحصول على الصور، يتم وضع أقسام الأنسجة في منتصف الشرائح المطلية بالذهب في إطار لا يزيد حجمه عن 15 مم × 30 مم للسماح بمساحة كافية لرسم الحاجز دون لمس الأنسجة أو نقاط التوجيه الموضوعة على الحافة الخارجية للشريحة.
    4. لإزالة أي بقايا قلم، اغمس الشرائح في TBS-T.
    5. في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة ، احتضن قسم الأنسجة ب 100-200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع لمدة 20 دقيقة. اترك الأنسجة المحتضنة في المخزن المؤقت المانع حتى يصبح المزيج الرئيسي للأجسام المضادة جاهزا.
  6. إعداد لوحة الأجسام المضادة
    ملاحظة: يختلف الحجم النهائي لكوكتيل لوحة الأجسام المضادة وفقا لمساحة سطح قسم الأنسجة المقدرة. لتغطية مساحة 20 مم × 20 مم ، قم بإعداد 100-200 ميكرولتر من الكوكتيل.
    قم بما يلي لإعداد كوكتيل من الأجسام المضادة المترافقة مع النظائر المعدنية:
    1. تأكد من الحجم النهائي للكوكتيل الذي يساوي حجم كوكتيل الأجسام المضادة المضاف إلى حجم المخزن المؤقت المانع.
    2. قم بتأكيد مواصفات جميع الأجسام المضادة و / أو التخفيفات و / أو تركيزات الأجسام المضادة في جدول بيانات لوحة للمشروع.
    3. قم بتدوير جميع الأنابيب التي تحتوي على الأجسام المضادة عند 10000 × g لمدة 5 دقائق. أضف أجساما مضادة فردية إلى المخزن المؤقت المانع واخلطها جيدا. لا تزعج الجزء السفلي من أنبوب الأجسام المضادة عند سحبه.
    4. قم بتصفية لوحة الأجسام المضادة عن طريق التبول المسبق لجهاز مرشح الطرد المركزي 0.1 ميكرومتر مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب. قم بتدوير الفلتر عند 10000 × g لمدة 2 دقيقة وقم بإزالة تدفق المخزن المؤقت المانع باستخدام ماصة.
    5. انقل لوحة الأجسام المضادة إلى عمود دوران وقم بتدوير المرشح عند 10000 × g لمدة دقيقتين. تخلص من عمود الدوران واستخدم التدفق كلوحة الأجسام المضادة التي تمت تصفيتها.
      ملاحظة: قم بإجراء التلطيخ مباشرة بعد صنع الكوكتيل لمنع تبادل المعادن. إذا كانت هناك حاجة إلى تخزين كوكتيل الأجسام المضادة لفترة طويلة ، فيمكن أن يخضع للجفيد.
  7. تلطيخ الأجسام المضادة
    1. قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب بعناية من الشرائح عن طريق قلب كل شريحة على جانبها والنقر برفق على الحواف مقابل ممسحة المهام.
    2. ضع الشرائح في غرفة رطوبة وأضف 100-200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الرئيسي إلى الأنسجة (تجنب ملامسة الأنسجة وإنشاء فقاعات هواء).
    3. أضف شرائح تحكم إيجابية وسلبية إلى دفعة التلطيخ.
    4. احتضان الشرائح عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (14-16 ساعة).
  8. إعداد الكاشف (اليوم 2)
    1. تمييع 100 مل من 10x PBS منخفضة الباريوم ، درجة الحموضة 7.4 ، في 900 مل من diH2O لجعل 1x PBS.
    2. تحضير 350 مل من محلول مخزون العمل من 2٪ glutaraldehyde في PBS منخفض الباريوم (340 مل من PBS منخفض الباريوم + 10 مل من 70٪ glutaraldehyde).
      ملاحظة: قم بإجراء التخفيف تحت غطاء محرك السيارة. Glutaraldehyde هو سائل لزج للغاية. استخدم ماصة 1 مل وأضف 1 مل من PBS منخفض الباريوم إلى أنبوب glutaraldehyde في كل مرة حتى يصبح سائلا بما يكفي لسكبه خارج الأنبوب.
    3. تمييع 10x Tris ، درجة الحموضة 8.5 ، في 900 مل من diH20 لجعل 1x Tris.
  9. التثبيت والجفاف
    1. قم بإزالة مزيج الأجسام المضادة الرئيسي من كل شريحة عن طريق قلب الشريحة على جانبها والنقر برفق على الحافة مقابل ممسحة المهام.
    2. اغسل الشرائح بإثارة خفيفة إلى معتدلة في المخازن المؤقتة التالية: 1x TBS-T ، 3x مرات لمدة 5 دقائق لكل منها (خالية من المعادن) ؛ تصفية 2 ٪ غلوتارالدهيد لمدة 5 دقائق. تصفية 1x tris ، درجة الحموضة 8.5 ، 3x لمدة 30 ثانية ؛ تصفية diH2O 2x لمدة 30 ثانية ؛ 70 ٪ من الكحول لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ؛ 80 ٪ من الكحول لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ؛ 95 ٪ من الكحول لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ؛ والكحول 100٪ لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن).
    3. اضغط برفق على حافة كل شريحة مقابل ممسحة مهمة لإزالة الكحول الزائد والسماح للكحول المتبقي بالتبخر في درجة حرارة الغرفة (~ 5-10 دقائق).
    4. قم بتجفيف الشرائح في المجفف لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الحصول على الصورة أو احتفظ بالشرائح في غرفة فراغ للتخزين على المدى الطويل.

5. الحصول على الصور

  1. إعداد الشرائح
    ملاحظة: قبل إجراء المسح الضوئي باستخدام الأداة، يجب تعريف الشرائح وإعدادها باستخدام تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب باتباع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. في صفحة الشريحة في تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب، انقر فوق الانضمام شريحة جديدة وأدخل التفاصيل المطلوبة (الاسم وتحديد الشريحة والموقع والوصف).
    2. أنشئ مقاطع المسح الضوئي بالنقر فوق إضافة قسم. املأ المعلومات الخاصة بكل قسم (اسم المشروع واسم الشريحة والكتلة والموضع). لحفظ الشرائح/الأقسام الجديدة التي تم إنشاؤها، انقر فوق إرسال.
    3. ضمن علامة تبويب الموارد، افتح صفحة اللوحات وحدد اللوحة المراد استخدامها. بالنسبة إلى اللوحات الجديدة، انقر فوق إنشاء لوحة جديدة.
    4. بعد تحديد اللوحة ، انقر فوق الأقسام. أضف المقاطع التي تم إنشاؤها في الخطوة 2. بالنقر فوق تحرير تعيين القسم. حفظ بالنقر على إرسال.
  2. إعداد الأداة
    ملاحظة: يتم تشغيل هذا الجهاز (انظر جدول المواد) باستخدام برنامج تحكم محدد (انظر جدول المواد).
    1. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج التحكم. انقر فوق تنبيه إذا كان الجهاز في وضع السكون.
      ملاحظة: قبل 1 ساعة على الأقل من العملية ، يوصى بتسخين الأداة ، مما يساعد على تثبيت تركيز الشعاع.
    2. لتحميل شريحة، انقر فوق نموذج Exchange ثم انقر فوق متابعة لفتح الباب. ضع الشريحة في فتحة التحميل مع توجيه العينة لأعلى والملصق على اليمين. انقر فوق متابعة لإغلاق الباب.
      ملاحظة: إذا لم يتم تحميل الشريحة بشكل صحيح، فسيظهر صوت تحذير وإعلام لضبط الشريحة.
    3. حدد المشروع ثم حدد اسم الشريحة للعينة التي تم تحميلها.
    4. تصور الصورة البانورامية في جزء الصورة البصرية الشريحة.
  3. اختيار مجال الرؤية (FOV) واقتناؤه
    1. انقر على قائمة الوضع وحدد SED (كاشف الإلكترون الثانوي). انقر على قائمة وضع التصوير واختر مراقبة الجودة −300 ميكرومتر.
    2. انقر فوق Jog Stage للتحكم في موقع FOV ثم انقر فوق الأسهم للتنقل وتحديد موضع FOV.
    3. انقر فوق إضافة FOV ، وقم بتعيين 400 ميكرومتر × 400 ميكرومتر كحجم الحقل ، وحدد جيدا كوضع التصوير و 1 مللي ثانية من وقت الإقامة. انقر على تأكيد.
      ملاحظة: يعتمد وقت الإقامة المحدد على الدقة المطلوبة. يزداد وقت الإقامة مع زيادة القرار. قد يختلف وقت الاكتساب اعتمادا على عوامل متعددة ، بما في ذلك فترة كسر الكاشف وطول التشغيل. يبلغ متوسط وقت الاستحواذ لدينا ل FOV واحد حوالي 17 دقيقة. استخدم الأداة دون توقف لمدة تصل إلى 8 ساعات ، مما يسمح بمسح حوالي 28 FOVs. تنخفض جودة الصور المكتسبة بعد ساعات عديدة متتالية من الاستخدام.
    4. بعد إنشاء قائمة FOV ، انتقل إلى تركيز الصورة واضبط الوصمة عن طريق تحريك الشعاع إلى منطقة نسيج لن يتم تصويرها. اضبط المعلمات حتى يتم الحصول على صورة مركزية واضحة.
      ملاحظة: لتحسين الحصول على الصور، يعد الحفاظ على مركز قسم الأنسجة على الشريحة أمرا مثاليا. أثناء التركيز ، يمكن الحصول على صورة واضحة للمنطقة المركزية فقط. إذا كان قسم الأنسجة كبيرا جدا ، فستكون الحواف خارج التركيز البؤري ، وستكون الصورة غير واضحة.
    5. انقر فوق بدء التشغيل. سيتم تحميل الصور التي تم الحصول عليها تلقائيا وتخزينها في تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب.

6. إعداد الصور

  1. تصحيح متساوي الضغط للصورة
    ملاحظة: الغرض من التصحيح متساوي الضغط هو إزالة إشارة الامتداد بين القنوات الناتجة عن وجود نظائر ذات كتلة متساوية أو متشابهة جدا لا يمكن اكتشاف الاختلافات في الكتلة باستخدام محلل الكتلة.
    1. في تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب ، انقر فوق رمز التنزيل الأخضر لحفظ FOVs (صور TIFF).
    2. قم بتنزيل أحدث إصدار من برنامج معالجة الصور (راجع جدول المواد) المتوفر في علامة التبويب حول في تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب واحفظه في ملف. افتح ملف أرشفة .zip واتبع خطوات التثبيت. افتح البرنامج بمجرد اكتمال التثبيت.
    3. حدد المجلد الذي يحتوي على الصور المراد تصحيحها بالنقر فوق رمز الملف في جزء الإدخال في برنامج معالجة الصور. سيتم تحميل قائمة FOV.
    4. انقر فوق أيقونة عامل التصفية في جزء الإدخال لتطبيق التصحيحات الافتراضية. لكل قناة، تصور الصور التي تم الحصول عليها قبل وبعد التصحيح على الجانب الأيمن من الشاشة.
    5. انقر فوق رمز القرص المرن في جزء الإخراج لحفظ الصورة المصححة.
  2. تصفية الصور: فورونوي تيسليشن
    ملاحظة: توضح مخططات توزيع فورونوي قسما من الفضاء يحتوي على نقاط بذور في خلايا فورونوي. والهدف من ذلك هو تقدير كثافة الخلايا وتحديد حدود الخلايا. باستخدام حساب Voronoi tessellation ، يتم إنشاء قناع وتطبيقه على الصورة الأصلية للتصفية.
    1. انقر فوق علامة التبويب تصفية وحدد Voronoi Tesselation في قائمة معلمات التصفية.
    2. في جزء الإدخال، حدد صورة MassCorrected.tiff. انقر فوق أيقونة التصفية في جزء الإدخال .
    3. انقر فوق رمز القرص المرن في جزء الإخراج لحفظ الصورة التي تمت تصفيتها. سيكون للملفين الناتجين اللواحق -Filtered.tiff و-Filtered.json.
      ملاحظة: يمكن تحميل الصورة المسماة MassCorrected-Filtered.tiff بعد ذلك إلى برنامج تحليل رقمي تابع لجهة خارجية أو برنامج مفتوح المصدر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على أجزاء أنسجة TMA من سرطان اللوزتين والرئة الغدي (بسمك 5 مم) ووضعها في منتصف الشرائح المطلية بالذهب وفقا للمواصفات المتعلقة بحجم الأنسجة والهوامش الآمنة للشرائح. تعد الهوامش الزجاجية الحرة التي تبلغ 5 مم و 10 مم بين حافة الأنسجة والحدود الجانبية والسفلية للشرائح الزجاجية ، على التوالي ، ضرورية للتلطيخ الأمثل. تم خبز أقسام الأنسجة بين عشية وضحاها في فرن قبل تلطيخ لضمان الالتزام السليم للقسم بالشريحة. تألفت لوحة الأجسام المضادة من 23 علامة. في نفس دفعة التلطيخ ، تم تضمين شريحة لوزتين وشريحة TMA تحتوي على أنسجة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال التوضيح الشامل للتفاعلات المعقدة والمعقدة بين المكونات المتعددة ل TME هدفا محوريا لأبحاث السرطان. قدم المصنعون العديد من الفحوصات متعددة الإرسال كجزء من هذا الجهد ، خاصة على مدى السنوات ال 5 الماضية. التحليل المكاني متعدد الإرسال هو أداة متعددة الاستخدامات وقوية تسهل التصنيف المتزامن لعدة أهداف مع الحفاظ على المورفولوجيا الهيكلية في عينات الورم. يمكن إجراء تقنيات التحليل المكاني باستخدام التصوير الفلوري أو قياس الطيف الكتلي ، مثل التقنية الموضحة هنا11،12،...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف المؤلفون دون نوروود من خدمات التحرير ، ومكتبة الأبحاث الطبية في MD Anderson لتحرير هذه المقالة ومختبر التألق المناعي المتعدد وتحليل الصور في قسم علم الأمراض الجزيئية الانتقالية في MD Anderson. نتج هذا المنشور جزئيا عن بحث تم تيسيره من خلال الدعم العلمي والمالي لمراكز مراقبة وتحليل مناعة السرطان - شبكة كومنز البيانات المناعية للسرطان (CIMAC-CIDC) المقدمة من خلال اتفاقية التعاون بين المعهد الوطني للسرطان (NCI) (U24CA224285) إلى مركز جامعة تكساس إم دي أندرسون للسرطان مركز مراقبة وتحليل مناعة السرطان (CIMAC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100٪ كاشف كحولسيجما ألدريتشR8382
95٪ كاشف كحولسيجما ألدريتشR3404
80٪ كاشف كحولسيجما ألدريتشR3279
70٪ كاشف كحولسيجما ألدريتشR315
20X TBS-Tالمسار الأيوني567005
10X منخفض الباريوم PBS درجة الحموضة 7.4المسار الأيوني567004
10X Tris درجة الحموضة 8.5   ؛المسار الأيوني567003
4 درجة ؛ C ثلاجةThermoScientificREVCO
Aerosol Barrier Tips Pipette P10Olympus24-401
نصائح ماصة حاجز الهباء الجوي P20أوليمبوس24-404
نصائح ماصة حاجز الهباء الجوي P200أوليمبوس24-412
أطراف ماصة حاجز الهباء الجوي P1000أوليمبوس24-430
مرشح الطرد المركزي Ultrafree-MCFisher ScientificUFC30VV00
منزوعة الأيونات H2OIonpath567002
مصل الحمارSigma-AldrichD9663
EasyDip جرة تلطيخ الشرائح ،علوم المجهر الإلكتروني71385-G
EasyDip جرة تلطيخ الشرائح ،علوم المجهر الإلكتروني71385-Y
EasyDip طقم تلطيخ الشرائح (جرة + رف) ،علوم المجهر الإلكتروني71388-01
EasyDip حامل الفولاذ المقاومعلوم المجهر الإلكتروني71388-50
الجلوتارالديهايد 70٪المجهر الإلكترونيEM 16360
المخزن المؤقت لاسترجاع الحاتمة المستحثة بالحرارة (HIER): 10X Tris مع EDTA ، درجة الحموضة 9DakoS2367
شريحة مقاومة للحرارة علومالمجهر62705-01
قلم حاجز مسعورفيشر50-550-221
برنامج MIBI / Oبرنامج المسار الأيونيNA
MIBIcontrolبرنامج المسار الأيونيNA
MIBIslideIonpath567001
MIBIscopeIonpathNA
أجهزة الطرد المركزي الدقيقةEppendorf5415D
MicrotomeLeicaRM2135
غرفة الرطوبة (الغرفة الرطبة)أقراص SimportM922-1
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificBP2944100
PTModule Thermo ScientificA80400012
تصفية معقمة سريعة التدفق يمكن التخلص منهاالدوران Fisher Scientific097403A
ShakerBioRockerS2025
(مرشح تدور Ultrafree-MC ، 0.5 مل 0.1 & mu ؛ م)فرنMillQ UFC30VV00
فيشر Scientific6901
مجفف خزانة فراغVWR30621-076
Task-whipeKimberly Clark34155
XyleneSigma-Aldrich534056-4L
الأخضر الأصفر الأبيض للصدأ علوم من الدرجة الإلكتروني للغرفة وحدات عمود منزلق

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
  2. Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89(2020).
  3. Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
  4. Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
  5. Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
  6. Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466(2020).
  7. Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98(2021).
  8. Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
  9. Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
  10. Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
  11. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).
  12. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  13. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).
  14. Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
  15. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
  16. Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tumor MicroenvironmentMass Spectrometry ImagingFormalin Fixed TissueParaffin Embedded TissueMultiplex ImagingMetal Labeled AntibodiesAntibody Panel OptimizationTissue CompartmentalizationCell SegmentationDigital Image Analysis

Related Articles