توسيع فهم البيئة الدقيقة للورم باستخدام تصوير قياس الطيف الكتلي لعينات الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين المضمنة

تعد أهمية أنواع الخلايا العديدة المحيطة بمجموعات الأورام النسيلة عنصرا حاسما في تصنيف التسرطن. وقد ازداد الاهتمام بتوضيح تكوين وتفاعلات البيئة الدقيقة للورم (TME) باستمرار بعد إنشاء العلاج القائم على المناعة كجزء من ترسانة علاج السرطان. لذلك ، تحولت استراتيجيات العلاج من نهج يركز على الورم إلى نهج يركز على TME¹.

زادت الجهود المبذولة لتوضيح أدوار الخلايا المناعية في مراقبة الورم وتطور السرطان بشكل لافت للنظر في السنوات الأخيرة ^2,3. في البحوث الطبية ، نشأت مجموعة كبيرة من الأساليب ، بما في ذلك الأساليب القائمة على قياس الخلايا وتقنيات التصوير أحادية البلكس والمتعددة ، كجزء من هذه المحاولة لفك رموز التفاعلات الفريدة لعناصر متعددة من TMEs.

تركز الطرق الرائدة مثل قياس التدفق الخلوي (اخترع في 1960s) ، وفرز الخلايا المنشطة بالفلور ، وقياس الخلايا الجماعية بشكل أساسي على تحديد مكونات TME^{وقياسها} كميا 4. على الرغم من أن التقنيات الكمية القائمة على قياس الخلايا تسمح بالتنميط الظاهري للمناظر الطبيعية المناعية ، إلا أن تحديد التوزيع المكاني الخلوي أمر مستحيل. على العكس من ذلك ، فإن طرقا مثل الكيمياء النسيجية المناعية أحادية البلكس القياسية تحافظ على بنية الأنسجة وتمكن الباحثين من تحليل التوزيع الخلوي ، على الرغم من أن انخفاض عدد الأهداف في قسم نسيج واحد هو قيد على هذه الطرق ^5,6. على مدى السنوات العديدة الماضية ، ظهرت تقنيات التصوير متعددة الإرسال لدقة الخلية الواحدة مثل التألق المناعي المتعدد ، والتصوير الفلوري بالترميز الشريطي ، وقياس الطيف الكتلي التصويري كاستراتيجيات شاملة للحصول على معلومات حول تلطيخ العلامات المتزامنة باستخدام نفس قسم الأنسجة⁷.

نقدم هنا تقنية تجمع بين الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن وقياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي وتمكن من تحديد كمية دقة الخلية الواحدة ، والتعبير المشترك للعلامة (النمط الظاهري) ، والتحليل المكاني باستخدام عينات الأنسجة الثابتة من الفورمالين ، والبارافين المدمج (FFPE) ، وعينات الأنسجة المجمدة الطازجة (FF) ^8,9. عينات FFPE هي المواد الأكثر استخداما على نطاق واسع لأرشفة عينات الأنسجة وتمثل موردا متاحا بسهولة أكبر لتقنيات التصوير متعددة الإرسال من العينات المجمدة الطازجة¹⁰. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه التقنية إمكانية استعادة الصور بعد أشهر. هنا ، نناقش بروتوكولات التلطيخ ومعالجة الصور باستخدام عينات أنسجة FFPE.

تم الحصول على عينات الأنسجة لأغراض البحث وفقا لمجلس المراجعة المؤسسية لمركز إم دي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس ، وتم إلغاء تحديد العينات بشكل أكبر.

1. اختيار الأجسام المضادة

1. حدد أسئلة البحث لاختيار أفضل استنساخ الأجسام المضادة المتاحة. استخدم أطلس البروتين البشري والأبحاث المنشورة ومواقع الشركات المصنعة للأجسام المضادة كموارد بحثية.
   ملاحظة: يعد اختيار عناصر التحكم في الأنسجة البشرية المناسبة ونفس عناصر التحكم في الأنسجة البشرية المراد تلطيخها في الخطوات المختلفة أمرا بالغ الأهمية للتأكد من تلطيخ العلامات بشكل صحيح وفي المكان المناسب وفي المقصورة الخلوية الصحيحة. يوصى دائما باستخدام مصفوفة صغيرة من الأنسجة الدقيقة (TMA) بما في ذلك الأنسجة الطبيعية والأنسجة الورمية للتحقق من صحة التلطيخ.
2. استخدم فقط الأجسام المضادة الخالية من الناقل لتصميم اللوحة.
   ملاحظة: يلزم استخدام تركيبات الأجسام المضادة الخالية من الناقل في حالة عدم توفر جسم مضاد تجاري خال من الناقل؛ يمكن استخدام مجموعات التنقية لضبط الجسم المضاد على التركيبة الصحيحة. من المعروف أن إضافات البروتين مثل ألبومين مصل البقر تقلل من قدرة الاقتران.
3. اختبار ومعايرة كل جسم مضاد باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية الكروموجينية القياسية لتحديد النمط دون الخلوي لتعبير العلامة ؛ غشاء ، سيتوبلازم ، أو تلطيخ نووي ؛ والتعبير في خلايا محددة في الأنسجة الضابطة.
   ملاحظة: ومع ذلك ، يجب اختبار كل جسم مضاد في سيترات الرقم الهيدروجيني 6 وحمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) ، ويجب تحديد ما إذا كانت اللوحة ستكون ملطخة بسيترات الأس الهيدروجيني 6 أو الرقم الهيدروجيني 9 EDTA. يوصى باستخدام الرقم الهيدروجيني 9 EDTA للحصول على إشارات جيدة ، خاصة عند العمل مع هذه المنهجية.
4. اختر تركيز التلطيخ الأمثل وفقا لنمط التعبير في عناصر التحكم الإيجابية.
5. قم بتعيين كل جسم مضاد لأحد النظائر المعدنية المتاحة وفقا لوفرة العلامة الكيميائية النسيجية المناعية ، والتوطين تحت الخلوي ، والتعبير الخلوي المشترك مع الأهداف الأخرى.
6. قم بتلطيخ الجسم المضاد بالمعدن المعين المقابل ومقارنته بالتعبير في نفس نسيج التحكم المستخدم سابقا.
   ملاحظة: يبدأ اقتران معادن الأجسام المضادة بتحضير الأجسام المضادة وتقليلها والاقتران اللاحق (الملف التكميلي 1). كل أنبوب بوليمر محمل بالمعدن يكفي لوضع علامات على 100 ميكروغرام من الجسم المضاد.

2. تصميم لوحة الأجسام المضادة

1. إنشاء دفعات صغيرة من تلطيخ الأجسام المضادة. اختبر ما يصل إلى خمس علامات في كوكتيل.
   ملاحظة: إن اختبار الأجسام المضادة التي تم اقترانها وتحليلها بالفعل باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية على دفعات يسهل التحديد المبكر لتداخلات القنوات ويوفر الفرصة لإعادة اقتران الأجسام المضادة بمعدن آخر. كما أنه يوفر فرصة لتقييم التعبير المشترك المناسب للعلامة.
2. قم بتلطيخ كل دفعة صغيرة بأربعة تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة (0.05 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، و 4.0 ميكروغرام / مل).
   ملاحظة: مقارنة العدارات المختلفة، وتحديد تركيز الأجسام المضادة التي تؤدي إلى الموقع الصحيح وأعلى تعبير مع الحد الأدنى من تلطيخ الخلفية (أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء).

3. FFPE تقسيم الأنسجة

1. حدد شرائح مطلية بالذهب (خاصة لهذا الغرض) واحتفظ بها بالقرب من الميكروتوم. قم بإعداد الميكروتوم عن طريق إدخال شفرة جديدة في الحامل. اضبط سمك القسم على 4-5 ميكرومتر.
2. ضع كتل FFPE على الجليد قبل التقسيم. قم بإعداد حمام تعويم الأنسجة عن طريق تسخين الماء المقطر أو الماء منزوع الأيونات (diH₂O) إلى 40-45 درجة مئوية.
   ملاحظة: استخدام diH₂O أو الماء المقطر يقلل من احتمال التلوث.
3. ابدأ التقسيم. ضع قسم الأنسجة في الماء باستخدام ملاقط واتركه يتسطح. استخدم الشرائح لإزالة مقاطع الأنسجة من الماء.
4. ضع الشرائح في رف منزلق واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

4. FFPE تلطيخ الأجسام المضادة

ملاحظة: تتم عملية التلطيخ في يومين منفصلين.

تنبيه: الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول يحتمل أن تكون قابلة للتآكل وتمثل مخاطر على الجلد والعينين. ينصح بارتداء القفازات ومعطف المختبر ومعدات واقية للعين والوجه وجزء من سياسة السلامة البيولوجية لمؤسستنا.

1. إعداد الكاشف (اليوم 1)
   1. قم بتخفيف 50 مل من 20x محلول ملحي مخزن مؤقتا ب Tris مع Tween (TBS-T) إلى 950 مل من diH₂O لصنع 1 لتر من TBS-T.
   2. قم بتخفيف 8 مل من 10x من حمض Tris-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) إلى 72 مل من diH₂O لصنع محلول استرجاع epitope 1x الناجم عن الحرارة (HIER).
   3. قم بتخفيف مصل الحمير في 1x TBS-T إلى تركيز نهائي بنسبة 5٪ لجعل المخزن المؤقت للحظر. يخزن المحلول على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
2. إعداد HIER: وحدة المعالجة المسبقة (PT)
   تنبيه: ارتد قفازات واقية كيميائية عند التعامل مع أي كواشف أو أجزاء مغمورة في أي كواشف مستخدمة في وحدة PT.
   1. قم بتخفيف 140 مل من 10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى 1260 مل من diH₂O لجعل 1.4 لتر من 1x PBS. بدلا من ذلك ، قم بتخفيف سبعة أقراص PBS إلى 1.4 لتر من diH₂O.
   2. املأ الخزان ب 1.4 لتر من PBS وضع حاوية غرفة الشرائح المعدة مع 100 مل من محلول 1x HIER في الخزان.
   3. سخن الخزان مسبقا في وحدة PT إلى 75 درجة مئوية.
3. إزالة البارافين الزائد
   1. تخبز الشرائح على حرارة 70 درجة مئوية في الفرن لمدة 20 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: قد تحتاج بعض الأنسجة أو الأقسام إلى أوقات خبز أطول. وقت الخبز الموصى به لأنسجة المخ أو TMA هو 1 ساعة. يمكن تمديد هذا إلى 16 ساعة (بين عشية وضحاها) أو وفقا لتجربة المختبر.
   2. ضع الشرائح المخبوزة في حامل الشرائح وقم بتنفيذ خطوات الغسيل التالية على شاكر تحت غطاء الدخان. اغسل الشرائح في المحلول التالي: Xylene 2x لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ، 100٪ كحول 2x لمدة 30 ثانية (خالية من المعدن) ، 95٪ كحول 2x لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ، 80٪ كحول لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ، 70٪ كحول لمدة 30 ثانية (خالية من المعدن) ، و diH₂O 2x لمدة 30 ثانية (خالية من المعدن).
   3. احتفظ بالشرائح في حاوية diH₂O جديدة حتى تصبح جاهزة لاسترجاع المستضد.
      ملاحظة: يجب عدم تجفيف الشرائح حتى نهاية الإجراء.
4. استرجاع المستضدات
   1. ضع الشرائح في غرفة شرائح مسخنة مسبقا تحتوي على مخزن مؤقت 1x HIER داخل وحدة PT. ضع الغطاء على الخزان. أغلق الغطاء وأغلقه.
   2. اضغط على زر القائمة في وحدة PT لفتح القائمة الرئيسية واضغط على زر دورة الإعداد (الوقت ودرجة الحرارة) لإنشاء برنامج مخصص.
   3. قم بتشغيل وحدة PT عند 97 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. بعد ذلك ، سوف تبرد وحدة PT تلقائيا إلى 65 درجة مئوية.
   4. قم بإزالة الشرائح من وحدة PT بمجرد الوصول إلى درجة حرارة 65 درجة مئوية. احتفظ بالشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: لن تفتح وحدة PT حتى تبرد درجة الحرارة إلى 65 درجة مئوية. لا تلمس السطح الذهبي للشرائح أثناء هذه العملية ، واستخدم القفازات دائما.
5. حجب الأجسام المضادة
   1. اضبط الخلاط على 70 دورة في الدقيقة.
   2. اغسل الشرائح عن طريق غمسها في 1x TBS-T لمدة 5 دقائق 2x.
   3. باستخدام قلم حاجز مسعور ، ارسم حدا حول قسم الأنسجة على بعد 1 مم على الأقل من حواف الشريحة واتركه يجف لمدة 15-30 ثانية.
      ملاحظة: احرص على منع سائل القلم من لمس قسم الأنسجة لتجنب أي تداخل للأنسجة مع التلطيخ. لا تضغط على القلم لأسفل بشدة أثناء رسم الحاجز لتجنب التسريبات المحتملة. للحصول على أفضل نتائج للتلطيخ والحصول على الصور، يتم وضع أقسام الأنسجة في منتصف الشرائح المطلية بالذهب في إطار لا يزيد حجمه عن 15 مم × 30 مم للسماح بمساحة كافية لرسم الحاجز دون لمس الأنسجة أو نقاط التوجيه الموضوعة على الحافة الخارجية للشريحة.
   4. لإزالة أي بقايا قلم، اغمس الشرائح في TBS-T.
   5. في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة ، احتضن قسم الأنسجة ب 100-200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع لمدة 20 دقيقة. اترك الأنسجة المحتضنة في المخزن المؤقت المانع حتى يصبح المزيج الرئيسي للأجسام المضادة جاهزا.
6. إعداد لوحة الأجسام المضادة
   ملاحظة: يختلف الحجم النهائي لكوكتيل لوحة الأجسام المضادة وفقا لمساحة سطح قسم الأنسجة المقدرة. لتغطية مساحة 20 مم × 20 مم ، قم بإعداد 100-200 ميكرولتر من الكوكتيل.
   قم بما يلي لإعداد كوكتيل من الأجسام المضادة المترافقة مع النظائر المعدنية:
   1. تأكد من الحجم النهائي للكوكتيل الذي يساوي حجم كوكتيل الأجسام المضادة المضاف إلى حجم المخزن المؤقت المانع.
   2. قم بتأكيد مواصفات جميع الأجسام المضادة و / أو التخفيفات و / أو تركيزات الأجسام المضادة في جدول بيانات لوحة للمشروع.
   3. قم بتدوير جميع الأنابيب التي تحتوي على الأجسام المضادة عند 10000 × g لمدة 5 دقائق. أضف أجساما مضادة فردية إلى المخزن المؤقت المانع واخلطها جيدا. لا تزعج الجزء السفلي من أنبوب الأجسام المضادة عند سحبه.
   4. قم بتصفية لوحة الأجسام المضادة عن طريق التبول المسبق لجهاز مرشح الطرد المركزي 0.1 ميكرومتر مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب. قم بتدوير الفلتر عند 10000 × g لمدة 2 دقيقة وقم بإزالة تدفق المخزن المؤقت المانع باستخدام ماصة.
   5. انقل لوحة الأجسام المضادة إلى عمود دوران وقم بتدوير المرشح عند 10000 × g لمدة دقيقتين. تخلص من عمود الدوران واستخدم التدفق كلوحة الأجسام المضادة التي تمت تصفيتها.
      ملاحظة: قم بإجراء التلطيخ مباشرة بعد صنع الكوكتيل لمنع تبادل المعادن. إذا كانت هناك حاجة إلى تخزين كوكتيل الأجسام المضادة لفترة طويلة ، فيمكن أن يخضع للجفيد.
7. تلطيخ الأجسام المضادة
   1. قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب بعناية من الشرائح عن طريق قلب كل شريحة على جانبها والنقر برفق على الحواف مقابل ممسحة المهام.
   2. ضع الشرائح في غرفة رطوبة وأضف 100-200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الرئيسي إلى الأنسجة (تجنب ملامسة الأنسجة وإنشاء فقاعات هواء).
   3. أضف شرائح تحكم إيجابية وسلبية إلى دفعة التلطيخ.
   4. احتضان الشرائح عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (14-16 ساعة).
8. إعداد الكاشف (اليوم 2)
   1. تمييع 100 مل من 10x PBS منخفضة الباريوم ، درجة الحموضة 7.4 ، في 900 مل من diH₂O لجعل 1x PBS.
   2. تحضير 350 مل من محلول مخزون العمل من 2٪ glutaraldehyde في PBS منخفض الباريوم (340 مل من PBS منخفض الباريوم + 10 مل من 70٪ glutaraldehyde).
      ملاحظة: قم بإجراء التخفيف تحت غطاء محرك السيارة. Glutaraldehyde هو سائل لزج للغاية. استخدم ماصة 1 مل وأضف 1 مل من PBS منخفض الباريوم إلى أنبوب glutaraldehyde في كل مرة حتى يصبح سائلا بما يكفي لسكبه خارج الأنبوب.
   3. تمييع 10x Tris ، درجة الحموضة 8.5 ، في 900 مل من diH₂0 لجعل 1x Tris.
9. التثبيت والجفاف
   1. قم بإزالة مزيج الأجسام المضادة الرئيسي من كل شريحة عن طريق قلب الشريحة على جانبها والنقر برفق على الحافة مقابل ممسحة المهام.
   2. اغسل الشرائح بإثارة خفيفة إلى معتدلة في المخازن المؤقتة التالية: 1x TBS-T ، 3x مرات لمدة 5 دقائق لكل منها (خالية من المعادن) ؛ تصفية 2 ٪ غلوتارالدهيد لمدة 5 دقائق. تصفية 1x tris ، درجة الحموضة 8.5 ، 3x لمدة 30 ثانية ؛ تصفية diH₂O 2x لمدة 30 ثانية ؛ 70 ٪ من الكحول لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ؛ 80 ٪ من الكحول لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ؛ 95 ٪ من الكحول لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن) ؛ والكحول 100٪ لمدة 30 ثانية (خالية من المعادن).
   3. اضغط برفق على حافة كل شريحة مقابل ممسحة مهمة لإزالة الكحول الزائد والسماح للكحول المتبقي بالتبخر في درجة حرارة الغرفة (~ 5-10 دقائق).
   4. قم بتجفيف الشرائح في المجفف لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الحصول على الصورة أو احتفظ بالشرائح في غرفة فراغ للتخزين على المدى الطويل.

5. الحصول على الصور

1. إعداد الشرائح
   ملاحظة: قبل إجراء المسح الضوئي باستخدام الأداة، يجب تعريف الشرائح وإعدادها باستخدام تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب باتباع الخطوات الموضحة أدناه.
   1. في صفحة الشريحة في تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب، انقر فوق الانضمام شريحة جديدة وأدخل التفاصيل المطلوبة (الاسم وتحديد الشريحة والموقع والوصف).
   2. أنشئ مقاطع المسح الضوئي بالنقر فوق إضافة قسم. املأ المعلومات الخاصة بكل قسم (اسم المشروع واسم الشريحة والكتلة والموضع). لحفظ الشرائح/الأقسام الجديدة التي تم إنشاؤها، انقر فوق إرسال.
   3. ضمن علامة تبويب الموارد، افتح صفحة اللوحات وحدد اللوحة المراد استخدامها. بالنسبة إلى اللوحات الجديدة، انقر فوق إنشاء لوحة جديدة.
   4. بعد تحديد اللوحة ، انقر فوق الأقسام. أضف المقاطع التي تم إنشاؤها في الخطوة 2. بالنقر فوق تحرير تعيين القسم. حفظ بالنقر على إرسال.
2. إعداد الأداة
   ملاحظة: يتم تشغيل هذا الجهاز (انظر جدول المواد) باستخدام برنامج تحكم محدد (انظر جدول المواد).
   1. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج التحكم. انقر فوق تنبيه إذا كان الجهاز في وضع السكون.
      ملاحظة: قبل 1 ساعة على الأقل من العملية ، يوصى بتسخين الأداة ، مما يساعد على تثبيت تركيز الشعاع.
   2. لتحميل شريحة، انقر فوق نموذج Exchange ثم انقر فوق متابعة لفتح الباب. ضع الشريحة في فتحة التحميل مع توجيه العينة لأعلى والملصق على اليمين. انقر فوق متابعة لإغلاق الباب.
      ملاحظة: إذا لم يتم تحميل الشريحة بشكل صحيح، فسيظهر صوت تحذير وإعلام لضبط الشريحة.
   3. حدد المشروع ثم حدد اسم الشريحة للعينة التي تم تحميلها.
   4. تصور الصورة البانورامية في جزء الصورة البصرية الشريحة.
3. اختيار مجال الرؤية (FOV) واقتناؤه
   1. انقر على قائمة الوضع وحدد SED (كاشف الإلكترون الثانوي). انقر على قائمة وضع التصوير واختر مراقبة الجودة −300 ميكرومتر.
   2. انقر فوق Jog Stage للتحكم في موقع FOV ثم انقر فوق الأسهم للتنقل وتحديد موضع FOV.
   3. انقر فوق إضافة FOV ، وقم بتعيين 400 ميكرومتر × 400 ميكرومتر كحجم الحقل ، وحدد جيدا كوضع التصوير و 1 مللي ثانية من وقت الإقامة. انقر على تأكيد.
      ملاحظة: يعتمد وقت الإقامة المحدد على الدقة المطلوبة. يزداد وقت الإقامة مع زيادة القرار. قد يختلف وقت الاكتساب اعتمادا على عوامل متعددة ، بما في ذلك فترة كسر الكاشف وطول التشغيل. يبلغ متوسط وقت الاستحواذ لدينا ل FOV واحد حوالي 17 دقيقة. استخدم الأداة دون توقف لمدة تصل إلى 8 ساعات ، مما يسمح بمسح حوالي 28 FOVs. تنخفض جودة الصور المكتسبة بعد ساعات عديدة متتالية من الاستخدام.
   4. بعد إنشاء قائمة FOV ، انتقل إلى تركيز الصورة واضبط الوصمة عن طريق تحريك الشعاع إلى منطقة نسيج لن يتم تصويرها. اضبط المعلمات حتى يتم الحصول على صورة مركزية واضحة.
      ملاحظة: لتحسين الحصول على الصور، يعد الحفاظ على مركز قسم الأنسجة على الشريحة أمرا مثاليا. أثناء التركيز ، يمكن الحصول على صورة واضحة للمنطقة المركزية فقط. إذا كان قسم الأنسجة كبيرا جدا ، فستكون الحواف خارج التركيز البؤري ، وستكون الصورة غير واضحة.
   5. انقر فوق بدء التشغيل. سيتم تحميل الصور التي تم الحصول عليها تلقائيا وتخزينها في تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب.

6. إعداد الصور

1. تصحيح متساوي الضغط للصورة
   ملاحظة: الغرض من التصحيح متساوي الضغط هو إزالة إشارة الامتداد بين القنوات الناتجة عن وجود نظائر ذات كتلة متساوية أو متشابهة جدا لا يمكن اكتشاف الاختلافات في الكتلة باستخدام محلل الكتلة.
   1. في تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب ، انقر فوق رمز التنزيل الأخضر لحفظ FOVs (صور TIFF).
   2. قم بتنزيل أحدث إصدار من برنامج معالجة الصور (راجع جدول المواد) المتوفر في علامة التبويب حول في تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب واحفظه في ملف. افتح ملف أرشفة .zip واتبع خطوات التثبيت. افتح البرنامج بمجرد اكتمال التثبيت.
   3. حدد المجلد الذي يحتوي على الصور المراد تصحيحها بالنقر فوق رمز الملف في جزء الإدخال في برنامج معالجة الصور. سيتم تحميل قائمة FOV.
   4. انقر فوق أيقونة عامل التصفية في جزء الإدخال لتطبيق التصحيحات الافتراضية. لكل قناة، تصور الصور التي تم الحصول عليها قبل وبعد التصحيح على الجانب الأيمن من الشاشة.
   5. انقر فوق رمز القرص المرن في جزء الإخراج لحفظ الصورة المصححة.
2. تصفية الصور: فورونوي تيسليشن
   ملاحظة: توضح مخططات توزيع فورونوي قسما من الفضاء يحتوي على نقاط بذور في خلايا فورونوي. والهدف من ذلك هو تقدير كثافة الخلايا وتحديد حدود الخلايا. باستخدام حساب Voronoi tessellation ، يتم إنشاء قناع وتطبيقه على الصورة الأصلية للتصفية.
   1. انقر فوق علامة التبويب تصفية وحدد Voronoi Tesselation في قائمة معلمات التصفية.
   2. في جزء الإدخال، حدد صورة MassCorrected.tiff. انقر فوق أيقونة التصفية في جزء الإدخال .
   3. انقر فوق رمز القرص المرن في جزء الإخراج لحفظ الصورة التي تمت تصفيتها. سيكون للملفين الناتجين اللواحق -Filtered.tiff و-Filtered.json.
      ملاحظة: يمكن تحميل الصورة المسماة MassCorrected-Filtered.tiff بعد ذلك إلى برنامج تحليل رقمي تابع لجهة خارجية أو برنامج مفتوح المصدر.

تم الحصول على أجزاء أنسجة TMA من سرطان اللوزتين والرئة الغدي (بسمك 5 مم) ووضعها في منتصف الشرائح المطلية بالذهب وفقا للمواصفات المتعلقة بحجم الأنسجة والهوامش الآمنة للشرائح. تعد الهوامش الزجاجية الحرة التي تبلغ 5 مم و 10 مم بين حافة الأنسجة والحدود الجانبية والسفلية للشرائح الزجاجية ، على التوالي ، ضرورية للتلطيخ الأمثل. تم خبز أقسام الأنسجة بين عشية وضحاها في فرن قبل تلطيخ لضمان الالتزام السليم للقسم بالشريحة. تألفت لوحة الأجسام المضادة من 23 علامة. في نفس دفعة التلطيخ ، تم تضمين شريحة لوزتين وشريحة TMA تحتوي على أنسجة متعددة لتقييم التعبير عن العلامات التي يتم التعبير عنها بشكل ضئيل في عينات السرطان الغدي الرئوي (الشكل 1). يجب اختيار الضوابط الإيجابية وفقا لأهداف الأجسام المضادة المستخدمة في الألواح ؛ على سبيل المثال ، لتقييم تعبير SOX10 ، هناك حاجة إلى عينات سرطان الجلد ، ولتقييم تعبير GAFP ، هناك حاجة إلى عينات الورم الأرومي الدبقي (الشكل 2).

الشكل 1: نقاء النظائر والحديث المتبادل بين القنوات. تظهر المصفوفة النسبة المئوية للحديث المتبادل المستمدة من نقاء المسبار وأكاسيده (الصناديق الزرقاء ، ≥0.5٪ ؛ الصناديق الشفافة ، <0.5٪). بالنسبة للعلامات الجماعية ، يتم عرض المسابير التي ساهمت بنسبة 0.5٪ على الأقل في الحديث المتبادل في أي قنوات (خضراء) أو قناة واحدة أو قناتين (صفراء) أو أكثر من قناتين (برتقالية). كما يتم عرض القنوات الجماعية التي تتلقى ما لا يقل عن 0.5٪ من الحديث المتبادل من أي مجسات (أخضر) أو مسبار واحد أو اثنين (أصفر) أو أكثر من مسبارين (برتقالي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صور تلطيخ تمثيلية في أنسجة مختلفة . (أ) سرطان غدي رئوي. (ب) الكلى غير الورمية. (ج) اللوزتين. يظهر CD20 باللون الأصفر ، ويظهر Ki67 باللون الأرجواني ، ويظهر CD3 باللون الأبيض ، ويظهر CD11c باللون الأخضر ، ويظهر CD68 باللون الأحمر ، ويظهر السيتوكيراتين باللون السماوي ، ويظهر الحمض النووي المزدوج (dsDNA) باللون الأزرق. التكبير ، 200x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يشبه إجراء التلطيخ هذا إلى حد كبير التلطيخ الكيميائي المناعي القياسي وحدث في يومين متتاليين. الخطوات الخمس الرئيسية لبروتوكول التلطيخ هي 1) إزالة البارافين الزائدة ، 2) استرجاع المستضد ، 3) حجب الأجسام المضادة ، 4) تلطيخ الأجسام المضادة ، و 5) التثبيت والجفاف (الشكل 3). تتمثل إحدى الخطوات الأساسية في إجراء التلطيخ في اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب التلوث المعدني للعينات ، بما في ذلك استخدام الكواشف الخالية من المعادن المخزنة في الأدوات البلاستيكية والتعامل الدقيق مع العينات للحد من الأضرار الميكانيكية. يوصى بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة مباشرة قبل تلطيخه. هذا يقلل من تبادل المعادن. بمجرد اكتمال التلطيخ ، قمنا بتخزين الشرائح ومسحها ضوئيا في اليوم التالي. قبل الحصول على الصورة ، تتمثل الخطوة الضرورية في إعداد الشرائح باستخدام تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب (الشكل 4).

الشكل 3: سير عمل الحصول على الصورة والشريحة المقترنة بها. (أ) ملخص سير عمل الحصول على الصورة. 1) يتم تنقيط مقطع نسيج FFPE ملطخ بالأجسام المضادة المترافقة مع المعدن باستخدام مسدس أيون أولي ، مما يؤدي إلى إطلاق أيونات ثانوية. 2) يفصل مطياف الكتلة في وقت الطيران الأيونات ويقيسها بناء على كتلتها على مستوى البكسل. 3) القياس الكمي القائم على البكسل للأيونات الثانوية. يتوافق المحور y مع عدد الأيونات المكتشفة (الذروة) ، ويتوافق المحور x مع كتلة كل معدن. 4) استنادا إلى ذروة كل طيف كتلي ، يتم إعادة بناء الصور متعددة الأبعاد. (ب) مخطط الشريحة المستخدمة في هذا الإجراء. للحصول على أنسجة تلطيخ مثالية، يجب وضع القسم على بعد 5 مم على الأقل من الحافة الجانبية للشريحة و10 مم من الحافة السفلية. عند رسم الحاجز الكارهة للماء حول قسم الأنسجة ، يجب الاحتفاظ به داخل المستطيل على بعد 1 مم على الأقل من حافة الشريحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: إعداد الشرائح في تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب. قبل مسح الشرائح ضوئيا، يعد إعداد كل شريحة أمرا ضروريا. أدخل التفاصيل المطلوبة التي يمكن أن تساعد في تحديد الشرائح. انقر فوق إضافة قسم (سهم أسود) لتضمين معلومات الكتلة والموضع. للحفظ، انقر على إرسال (سهم أحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في يوم المسح الضوئي، قم بتشغيل أداة الاكتساب باستخدام برنامج التحكم. يؤدي النقر فوق Exchange Slide إلى فتح باب الأداة ، مما يسمح بتحميل الشريحة. وضعنا الشريحة على فتحة التحميل متجهة لأعلى مع وجود الملصق على الجانب الأيمن. يمكن مسح شريحة واحدة فقط ضوئيا في وقت واحد. وكانت الخطوة التالية هي اختيار FOVs وتعديل التركيز والوصم باتباع الخطوات الموضحة في البروتوكول. لقد حصلنا على صور بالنقر فوق Start Run. يختلف وقت الاستحواذ اعتمادا على حجم FOV والدقة المطلوبة. يتراوح حجم FOV من 200 ميكرومتر × 200 ميكرومتر إلى 800 ميكرومتر × 800 ميكرومتر ، وهو ما يتوافق مع نطاق حجم إطار من 128 بكسل × 128 بكسل إلى 2048 بكسل × 2048 بكسل. تتوفر ثلاثة درجات دقة قياسية: الخشنة والناعمة والفائقة. يستغرق مسح FOVs الأكبر حجما بدقة فائقة وقتا طويلا ، حيث يتراوح وقت الاكتساب النهائي ل FOV واحد من 25 ثانية إلى 4.7 ساعة (الشكل 5).

الشكل 5: الحصول على الصور باستخدام برنامج التحكم. يمكن ضبط إعدادات الاكتساب حسب الرغبة. لتعديل دقة المسح الضوئي ، انقر فوق القائمة المنسدلة بواسطة وضع التصوير (سهم أسود). لتعديل حجم FOV، أدخل رقما في الحقل حجم FOV (μm) (سهم أحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد اكتمال المسح الضوئي ، تم تحميل مجموعة صور تتضمن جميع FOVs تلقائيا إلى تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب. إلى جانب تخزين الصور ، يتيح هذا التطبيق تصور جميع القنوات معا أو بشكل منفصل ، وتعديلات الصور ، وتنزيل الصور لمزيد من التحضير. يتم حفظ الصورة المرئية القياسية كملف TIFF (الشكل 6).

الشكل 6: تصور الصور باستخدام تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب. يتم تخزين الصور المكتسبة وتصورها باستخدام النظام الأساسي عبر الإنترنت. من الممكن ضبط معلمات التصور وتغيير لون كل علامة. انقر فوق إضافة قناة صورة (سهم أبيض) لتصور علامات أخرى. التكبير ، 200x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التداخلات المعدنية متأصلة في طرق وضع العلامات المعدنية على الرغم من استخدام استراتيجيات لتقليلها. لإزالة إشارات الخلفية الزائدة من النظائر المعدنية المقترنة بالأجسام المضادة وإعداد الصور للتحليل، استخدمنا برنامج معالجة الصور المرتبط بها (انظر جدول المواد). يحتوي إجراء إعداد الصورة على خطوتين: 1) تصحيح متساوي الضغط ، والذي يزيل الإشارات بين القنوات ، و 2) التصفية ، التي تزيل الإشارات الناجمة عن المجاميع على الصورة.

لبدء التصحيح متساوي الضغط ، تم تحديد الملف الذي يحتوي على صورة TIFF المحفوظة بالنقر فوق رمز الملف في جزء الإدخال. يقوم البرنامج تلقائيا بتحميل جميع صور TIFF المؤرشفة في الملف ، مما يسمح بتحليل الدفعات. بعد ذلك ، قمنا بتصحيح الصورة بالنقر فوق رمز التصفية في جزء الإدخال. تم إنشاء ملفين ناتجين بلاحقة -MassCorrected تلقائيا: أحدهما مؤرشف بتنسيق TIFF والآخر مؤرشف بتنسيق JSON. بشكل افتراضي ، تم حفظ المحفوظات الناتجة في نفس الملف الذي تم تحميل الصورة الأولية منه (الشكل 7).

الشكل 7: إعداد الصورة: خطوة التصحيح. لتحميل صورة للتحضير في برنامج معالجة الصور ، انقر فوق رمز الملف في جزء الإدخال (سهم أسود) وحدد الصورة. لتطبيق إجراء التصحيح الافتراضي ، انقر فوق رمز التصفية في جزء الإدخال (سهم أحمر). لحفظ الصورة المحدثة والمصححة ، انقر فوق رمز القرص المرن في جزء الإخراج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الخطوة الثانية من إعداد الصور هي التصفية ، والتي يمكن تحديدها في علامة التبويب العلوية في البرنامج. حددنا الصورة المصححة في جزء الإدخال. في هذه الخطوة ، تم استخدام tessellation Voronoi الآلي كمعلمة تصفية. بالنقر فوق أيقونة المرشح في لوحة الإدخال ، قم تلقائيا بتطبيق المرشح المحدد على جميع القنوات. في كل من خطوات إعداد الصورة (التصحيح والتصفية) ، يتم عرض صور كل قناة قبل وبعد المعالجة واختلافات الإشارة على الجانب الأيمن من الشاشة.

وعلى غرار خطوة التصحيح متساوي الضغط، تم إنشاء أرشيفين جديدين، أحدهما بتنسيق TIFF والآخر بتنسيق JSON. في هذه الخطوة، كانت اللاحقة التي تلي اسم الملف -تمت تصفيتها. لذلك ، تم تسمية الصورة النهائية التي تم الحصول عليها باسم MassCorrected-Filtered.tiff. من خلال إكمال هذه الخطوات ، قمنا بإعداد الصورة للتحليل باستخدام برنامج علم الأمراض الرقمي المفضل (الشكل 8 والشكل 9). باستخدام هذه التقنية ، تمكنا من تحليل جميع العلامات ال 23 في لوحة الأجسام المضادة مع الحد الأدنى من التداخلات بين القنوات على المستوى دون الخلوي في قسم نسيج واحد.

الشكل 8: إعداد الصورة: خطوة التصفية. حدد تصفية في علامة التبويب العلوية (سهم أسود) في برنامج معالجة الصور. ضمن معلمات التصفية، حدد الطريقة المطلوبة (سهم أخضر). في جزء الإدخال، حدد صورة MassCorrected. لتطبيق الإجراء المحدد على الصورة، انقر فوق أيقونة التصفية في جزء الإدخال (سهم أحمر). لحفظ الصورة التي تمت تصفيتها المحدثة ، انقر فوق رمز القرص المرن في جزء الإخراج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: صور تمثيلية للتلطيخ قبل وبعد إعداد الصورة. (أ) صورة لمقطع أنسجة اللوزتين ملطخ باستخدام هذه التقنية ويتم تصوره باستخدام برنامج تحليل الصور الرقمية التابع لجهة خارجية قبل التصفية والتصحيح. (ب) صورة لنفس القسم في نفس الظروف بعد خطوات التصفية والتصحيح. يظهر CD20 باللون الأصفر ، ويظهر Ki67 باللون الأرجواني ، ويظهر CD3 باللون الأبيض ، ويظهر CD11c باللون الأخضر ، ويظهر السيتوكيراتين باللون السماوي ، ويظهر الحمض النووي المزدوج (dsDNA) باللون الأزرق. التكبير ، 200x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: قائمة لوحة الأجسام المضادة. اقترن كل جسم مضاد بنظائر معدنية محددة ذات كتلة مختلفة كما هو مدرج. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب للكشف عنه.