Method Article

بروتوكول فحص حفرة بسيط لتصور وقياس امتصاص الخلايا العظمية في المختبر

DOI:

10.3791/64016

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم إجراء فحص بسيط وفعال لاختبارات حفرة الارتشاف باستخدام ألواح زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العظمية الناضجة هي خلايا متعددة النوى يمكنها تحلل العظام من خلال إفراز الأحماض والإنزيمات. وهي تلعب دورا حاسما في الأمراض المختلفة (مثل هشاشة العظام وسرطان العظام) وبالتالي فهي أشياء مهمة للبحث. في المختبر ، يمكن تحليل نشاطهم عن طريق تشكيل حفر ارتشاف. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة بسيطة لفحص الحفرة باستخدام ألواح زراعة الخلايا المطلية بفوسفات الكالسيوم (CaP) ، والتي يمكن تصورها وتحديدها كميا بسهولة. تم استزراع سلائف Osteoclast المشتقة من خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية (PBMCs) على الألواح المطلية في وجود محفزات عظمية المنشأ. بعد 9 أيام من الحضانة ، تم تثبيت الخلايا الآكلة العظمية وتلوينها للتصوير الفلوري بينما تم تلطيخ طلاء CaP بواسطة الكالسيين. لتحديد حجم المنطقة التي تم امتصاصها ، تم تلطيخ طلاء CaP على الألواح بنسبة 5٪ AgNO3 وتم تصوره بواسطة التصوير الساطع. تم قياس مساحة حفرة الارتشاف كميا باستخدام ImageJ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العظمية (OCs) هي بلاعم خاصة بالأنسجة مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، وتلعب دورا محوريا في إعادة تشكيل العظام مع الخلايا العظمية1. ترجع اضطرابات العظام الخبيثة والمناعية والخبيثة التي تدمر العظام بشكل منهجي أو محلي إلى النشاط العظمي الزائد ، بما في ذلك هشاشة العظام المرتبطة بانقطاع الطمث2 ، والتهاب المفاصل الروماتويدي3 ، وأمراض اللثة4 ، ومرض العظام النقوي5 ، وورم العظام العظمي6. في المقابل ، يمكن أن تسبب العيوب في تكوين OC ووظيفته أيضا هشاشة العظام7. تخضع HSCs للتمايز إلى أسلاف OC تحت تحفيز عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF ، رمز الجين ACP5). في وجود كل من M-CSF ومنشط مستقبلات رباط NF-κB (RANKL ، رمز الجين TNFSF11) ، يفرق أسلاف OC بشكل أكبر في OCs أحادية النواة ثم يندمجون لاحقا ليصبحوا OCs متعددة النوى 8,9,10. كل من السيتوكينات M-CSF و RANKL لا غنى عنهما وكافيان لتحريض علامات العظم مثل مستقبلات الكالسيتونين (CT) ، منشط مستقبلات العامل النووي κ B (RANK) ، مضخة البروتون V-ATPase ، الوحدة الفرعية لقناة الكلوريد 7 ألفا (CIC-7) ، integrin β3 ، فوسفاتيز حمض التطرطرات المقاوم للطرطرات (TRAP ، رمز الجين ACP5) ، كاسيبسين البروتياز البروتيني الليزوسومي K (CTSK) ، ومصفوفة metallopeptidase 9 (MMP9). تشكل OCs المنشطة منطقة مانعة للتسرب على سطح العظام من خلال تكوين حلقة أكتين ذات حدود كشكش11,12. داخل منطقة الختم ، تتوسط OCs في الارتشاف من خلال إفراز البروتونات عبر مضخة البروتون V-ATPase12,13 و MMP9 14 و CTSK15 ، مما يؤدي إلى تكوين الثغرات.

بالنسبة للتجارب المخبرية ، يمكن الحصول على أسلاف OC عن طريق توسيع البلاعم في نخاع العظم من عظم الفخذ والساق 16,17 ، وكذلك عن طريق عزل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية (PBMCs) من عينات الدم والمعاطف الباهتة18,19,20 ، أو عن طريق تمايز الخلايا الوحيدة المخلدة في الفئران RAW 264.7 21,22.

في هذا البروتوكول ، نصف اختبار ارتشاف العظام في لوحات زراعة الخلايا المطلية ب CaP باستخدام OCs المشتقة من PBMCs الأولية. تم اعتماد طريقة لوحات زراعة الخلايا المطلية CaP المستخدمة هنا وصقلها من الطريقة التي وصفها سابقا Patntirapong et al.17 و Maria et al.21. للحصول على سلائف OC ، يتم عزل PBMCs بواسطة الطرد المركزي المتدرج للكثافة وتوسيعها كما هو موضح سابقا20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية (رقم الموافقة 287/2020B02).

1. إعداد لوحات زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم

  1. تحضير محلول مخزون الكالسيوم (25 mM CaCl 2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl 2·6H 2 O in Tris buffer)
    1. قم بإعداد مخزن مؤقت 1.0 M Tris واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1 M HCl.
    2. قم بإعداد كوب زجاجي على مقلب مغناطيسي وأضف 100 مل من المخزن المؤقت 1.0 M Tris.
    3. يزن 0.368 جم من CaCl 2·2H 2O ، و 8.0 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.305 جم من MgCl 2·6H2 O ويذوب في مخزن Tris العازل واحدا تلو الآخر.
    4. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام 1 M HCl. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
  2. تحضير محلول مخزون الفوسفات (11.1 mM Na2HPO4· H2O، 42 mM NaHCO3 في المخزن المؤقت Tris)
    1. قم بإعداد كوب زجاجي على مقلب مغناطيسي وأضف 100 مل من المخزن المؤقت 1.0 M Tris.
    2. يزن 0.158 جم من Na2HPO4· H2O و 0.353 g من NaHCO3 ويذوب في المخزن المؤقت Tris واحدا تلو الآخر.
    3. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام 1 M HCl. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
  3. ما قبل تكلس لوحات زراعة الخلايا 96 بئرا
    1. قم بإعداد 30 مل من محلول العمل عن طريق خلط 15 مل من المخزن المؤقت Tris 1.0 M ، و 7.5 مل من محلول مخزون الكالسيوم (الخطوة 1.1.4) ، و 7.5 مل من محلول مخزون الفوسفات (الخطوة 1.2.3). قم بتصفية الحل باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر.
    2. قم بإعداد لوحة زراعة خلايا من 96 بئرا ذات قاع مسطح. ماصة 300 ميكرولتر من محلول فوسفات الكالسيوم (الخطوة 1.3.1) لكل بئر. قم بتغطية اللوحة بغطاء واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
  4. تحضير محلول فوسفات الكالسيوم (2.25 mM Na2HPO4· H2O، 4 mM CaCl 2·2H 2 O، 0.14 M NaCl، 50 mM Tris base in ddH 2O)
    1. أضف 2 مل من 1 M HCl إلى 40 مل من الماء منزوع الأيونات في كوب مع حبة تحريك مغناطيسية وقم بإذابة 0.016 جم من Na2HPO4· H2O، 0.0295 g من CaCl2·2H2O، 0.409 g من كلوريد الصوديوم، و 0.303 g من قاعدة Tris واحدة تلو الأخرى.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1 M HCl. أضف الماء منزوع الأيونات لملء الحجم إلى 50 مل. قم بتصفية الحل باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر.
  5. تكلس لوحات زراعة الخلايا 96 بئرا
    1. استنشق محلول ما قبل التكلس من ألواح زراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا المتكلسة مسبقا وأضف 300 ميكرولتر من محلول فوسفات الكالسيوم (الخطوة 1.4.2) إلى كل بئر. تغطية لوحات مع غطاء وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 يوم.
    2. اقلب الطبق لصب المحلول واغسل الطبق ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات جيدا. جفف اللوحة على الفور باستخدام مجفف شعر أو غاز CO 2 أو N2 مضغوط للحفاظ على سطح موحد.
    3. تعقيم اللوحة المطلية بالأشعة فوق البنفسجية في مقعد نظيف لمدة 1 ساعة. استخدم اللوحة المطلية على الفور أو أغلق اللوحة باستخدام parafilm وخزنها في درجة حرارة الغرفة.

2. عزل PBMCs عن الدم المحيطي البشري

  1. سحب 15 مل من الدم من الوريد بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المتبرع بالدم (التصويت الأخلاقي: 287/2020B02).
  2. تمييع 15 مل من الدم الطازج مع حجم متساو من PBS وتخلط عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات أو عن طريق سحب الخليط داخل وخارج ماصة.
  3. قم بإعداد أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 15 مل من محلول تدرج الكثافة (على سبيل المثال ، Ficoll ، جدول المواد) لكل أنبوب. قم بإمالة الأنبوب وقم بطبقة 30 مل من عينة الدم المخففة بعناية على محلول تدرج الكثافة 15 مل (عينة الدم المخففة: محلول تدرج الكثافة ، نسبة 1: 0.5-1).
    ملاحظة: عند تراكب العينة، انتبه إلى عدم خلط محلول تدرج الكثافة مع عينة الدم المخففة.
  4. جهاز طرد مركزي بسرعة 810 × جم لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية في دوار دلو متأرجح بدون فرامل.
  5. شفط الطبقة العليا تاركا طبقة الخلايا أحادية النواة (الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة والصفيحات) دون عائق في الطور البيني.
  6. انقل طبقة الخلايا أحادية النواة بعناية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
  7. املأ الأنبوب ب PBS ، واخلطه ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية (يمكن استخدام الفرامل من هذه المرحلة فصاعدا).
  8. قم بإزالة supernatant بعناية تماما. أعد تعليق حبيبات الخلايا في 50 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة supernatant بعناية تماما.
  9. لإزالة الصفائح الدموية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 50 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × g لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة supernatant بعناية تماما.
  10. نقل الخلايا المعاد تعليقها إلى قوارير زراعة الخلايا لتوسيع أسلاف OC.

3. توسيع أسلاف OC

  1. إعادة تعليق PBMCs بالكامل α-MEM (10٪ FBS ، 1٪ Pen / Strep ، 1٪ amphotericin B) التي تحتوي على 20 نانوغرام / مل M-CSF. بذور PBMCs بكثافة 2.5 × 105 خلايا / سم2. عادة ، يمكن زرع الخلايا المعزولة من 15-20 مل من الدم الطازج في قارورة واحدة 75 سم 2 (1.5-2 × 107 خلايا).
  2. قم بتغذية الخلايا ب α-MEM كاملة طازجة تحتوي على 20 نانوغرام / مل M-CSF كل ثلاثة أيام حتى تصل الخلايا المرفقة إلى التقاء المطلوب. الغلة النموذجية هي 1.5-2 × 106 خلايا / قارورة عندما تكون الخلايا ملتقية بنسبة 95٪. عادة ، تستمر فترة التوسع 6 أيام.
    ملاحظة: يمكن أن تنخفض الإمكانات العظمية المنشأ للسلائف مع طول وقت الزراعة.

4. تحريض تكوين العظم في الألواح المغلفة CaP

  1. لتسهيل التصاق الخلايا، احتضن الألواح المطلية بتقنية CaP ب 50 ميكرولتر من FBS لمدة 1 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية.
  2. لفصل سلائف OC ، اغسل القارورة باستخدام PBS مرتين لإزالة الخلايا الميتة أو غير الملتصقة. أضف 4 مل من التربسين (جدول المواد) لكل قارورة 75 سم2 ، لمدة 30 دقيقة.
    1. أضف 4 مل من α-MEM الكامل لوقف الهضم ، وافصل الخلايا بعناية باستخدام مكشطة الخلايا وانقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل.
    2. حدد إجمالي عدد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور أو ما شابه ذلك.
  3. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 350 × جم. أعد تعليق الكريات في α-MEM كاملة كافية تحتوي على 20 نانوغرام / مل M-CSF و 20 نانوغرام / مل RANKL للحصول على تركيز 1 × 106 خلايا / مل.
  4. استنشاق محلول FBS من لوحة CaP المطلية ب 96 بئرا وماصة 200 ميكرولتر من تعليق الخلايا لكل بئر (2 × 105 خلايا / بئر).
  5. احتضان سلائف OC للفترة الزمنية المطلوبة أو مع الكواشف المطلوبة ذات الصلة بالتصميم التجريبي. عادة ، يمكن ملاحظة أعداد كبيرة من OCs الكبيرة والمتعددة النوى بعد 6 أيام وعندما تتشكل حفر الارتشاف. تغذية الخلايا مع وسط α-MEM كامل طازج يحتوي على 20 نانوغرام / مل M-CSF و 20 نانوغرام / مل RANKL كل ثلاثة أيام.
  6. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين ، وقم بإصلاحه بنسبة 4٪ paraformaldehyde لمدة 10 دقائق ، واغسله باستخدام PBS مرة أخرى.
  7. استخدم OCs الثابتة مباشرة لتلطيخ التألق أو تخزينها عند 4 درجات مئوية.

5. تلطيخ التألق من OCs وطلاء CaP

  1. احتضن الخلايا الثابتة باستخدام مخزن مؤقت للنفاذية (0.1٪ Triton في PBS) لمدة 5 دقائق.
  2. بقع خيوط الأكتين مع 100 ميكرولتر من محلول الفيلويدين المسمى AlexaFluor 546 في PBS لمدة 30 دقيقة وشفط محلول التلطيخ. أضف 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ Hoechst 33342 (10 ميكروغرام / مل في PBS) لمدة 10 دقائق لتلطيخ النوى. يمكن أيضا استخدام DAPI.
  3. طلاء CaP اللعين مع 100 ميكرولتر من 10 ميكرومتر كالسيين في PBS لمدة 10 دقائق. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS والتقط الصور.
  4. بعد التصوير الفلوري ، يمكن استخدام نفس اللوحات لتحديد مساحة حفرة الارتشاف بواسطة تلطيخ فون كوسا. للقيام بذلك ، اغسل الألواح بالماء منزوع الأيونات مرتين.

6. القياس الكمي لإجمالي مساحة حفرة الارتشاف

  1. لتلطيخ طلاء CaP مع تلطيخ فون كوسا ، احتضان مع 50 ميكرولتر من 5٪ AgNO3 في الماء منزوع الأيونات لكل بئر تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 ساعة ، حتى يتحول الطلاء الموجود في قاع الآبار إلى اللون البني.
  2. اغسل اللوحة ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات والتقط صورا ساطعة. يمكن استخدام هدف قليل التكبير ، مثل هدف 1.25x ، لالتقاط البئر بالكامل في صورة واحدة. هذا يسهل تحليل الصور اللاحقة. يمكن تطبيق طرق بديلة لالتقاط كامل مساحة البئر.
  3. فتح ملف صورة باستخدام ImageJ: | الملفات فتح | صورة | النوع | 8 بت. تحقق من وحدة المقياس في الزاوية السفلية اليسرى من الصورة باستخدام الخط المستقيم | تحليل | تعيين المقياس. أدخل الطول في بطانية "المسافة المعروفة"، وأدخل وحدة مقياس جديدة في وحدة الطول، وحدد المربع عالمي.
  4. قائمة معلمات القياس المراد تحليلها: تحليل | تعيين القياسات. في النافذة تعيين القياسات، حدد المربعين المساحة والحد إلى العتبة.
  5. قياس مساحة الحفر: الصورة | ضبط | العتبة. في نافذة العتبة، حدد خانة الاختيار خلفية داكنة وانقر فوق تلقائي. تتحول مساحة الحفر إلى اللون الأحمر. أغلق نافذة العتبة وحدد تحليل | القياس. حفظ ملف النتيجة: ملف | حفظ باسم.

7. تحديد كمية عدد OC وحجمه ، ومنطقة حفرة الارتشاف العادية

  1. افتح صورة فلورية لخلايا الخلايا الآكلة للعظم باستخدام ImageJ وتحقق من وحدة المقياس (انظر الخطوة 6.3).
  2. قائمة معلمات القياس المراد تحليلها: تحليل | تعيين القياسات. في النافذة تعيين القياسات، حدد المربع منطقة .
  3. حدد OCs باستخدام مدير عائد الاستثمار وتحديدات المضلع: قم بتحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار. انقر فوق تحديدات المضلع في مجموعة الأدوات، وحدد OC واحدا (الخلايا ذات حلقة الأكتين ≥ ثلاث نواة) وانقر فوق إضافة [t] في نافذة إدارة عائد الاستثمار. كرر الخطوط العريضة حتى يتم تضمين جميع OCs.
  4. قياس عدد وحجم OCs: حدد جميع العناصر في مدير عائد الاستثمار وانقر على قياس. حفظ ملف النتيجة: | الملفات حفظ باسم (الشكل 3E).
  5. قياس منطقة حفرة الصور الفلورية. افتح الصورة الفلورية للطلاء المرتبط بالصورة في الخطوة 7.3 وتحقق من وحدة المقياس (انظر الخطوة 6.3).
    1. قائمة معلمات القياس المراد تحليلها (انظر الخطوة 6.4). حدد | الصورة ضبط | العتبة. في نافذة العتبة، ألغ تحديد كافة المربعات وانقر فوق تلقائي. تتحول مساحة الحفر إلى اللون الأحمر. أغلق نافذة العتبة وحدد تحليل | القياس. احفظ ملف النتيجة.
  6. حساب مساحة الحفرة العادية برقم OC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ طلاء فوسفات الكالسيوم في الجزء السفلي من ألواح زراعة الخلايا في خطوتين للطلاء تتضمنان تكلس مسبق لمدة 3 أيام وخطوة تكلس لمدة 1 يوم. كما هو موضح في الشكل 1 ، تم الحصول على فوسفات الكالسيوم الموزع بشكل موحد في الجزء السفلي من لوحات البئر 96. التزم الطلاء جيدا بالقاع بعد خطوات الغسيل المنجزة.

figure-results-1
الشكل 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نصف طريقة بسيطة وموثوقة لفحص ارتشاف العظام باستخدام OCs المشتقة والموسعة في المختبر من PBMCs. يمكن تحضير لوحات زراعة الخلايا المغلفة ب CaP المستخدمة بسهولة وتصورها باستخدام المواد المتاحة في المختبر. بالإضافة إلى PBMCs غير المصنفة المعتمدة في هذا البروتوكول ، تم أيضا استزراع OCs المتولدة من الخلايا أحادية الخلايا الفئران21 وخلايا البلاعم في نخاع العظم17 على ركائز اصطناعية مماثلة لفحص الحفرة ، وبالتالي يمكن نقل مصادر الخلايا هذه إلى هذا النهج في إشارة إلى الأدبي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني [CSC No. 201808440394]. تم تمويل W.C. من قبل CSC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3< / sub>SERVA Electrophoresis GmbH35110نترات الفضة
a-MEMGibco32561-029MEM alpha ، GlutaMAX ، بدون نيوكليوسيدات
أمفوتريسين بBiochrom03-028-1Bمحلول الأمفوتريسين B
CaCl2< / sub>Sigma-Aldrich21097-50Gثنائي هيدرات
كلوريد الكالسيومالكالسينسيجما ألدريتشC0875الكالسين
FBSسيجما-ألدريتشF7524مصل الأبقار الجنيني
فيكولسيتيفا17144002فيكول باك بلس
التثبيت العازلةBiolegend420801بارافورمالديهايد
هيدروكلوريكميرك1.09057.1000حمض الهيدروكلوريك
Hoechst 33342بروموكينPK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25المؤتلف البشري M-CSF
MgCl2< / sub>Sigma-Aldrich7791-18-6كلوريد المغنيسيوم
Na2< / sub>HPO4< / sub>AppliChem GmbHA2943،0250ثنائي فوسفات هيدروجين الصوديوم اللامائي
NaClMerkS7653-250Gكلوريد الصوديوم
NaHCO3< / sub>MerkK15322429بيكربونات الصودا
PBSLonza17-512Fمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (1X) ، DBPS بدون قلم الكالسيوم والمغنيسيوم
StrreprepLonzaDE17-602Eخليط البنسلين والستربتومايسين
فالويدين أليكسا فلور 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKLPeproTech310-01مؤتلف الإنسان sRANK Ligand (مشتق من الإشريكية القولونية)
تريسسيجما ألدريتش93362تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان
تريتون X-100سيجما ألدريتشT8787ألكيل فينيل بولي إيثيلين جلايكول
TrypLE ExpressGibco12605010إنزيمات تفكك الخلايا المؤتلفة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
  3. Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
  4. Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
  5. Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
  6. Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
  7. Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
  8. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8(2018).
  9. Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
  10. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
  11. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  12. Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
  13. Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
  14. Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143(2020).
  15. Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  16. Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
  17. Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
  18. Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
  19. Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578(2021).
  20. Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
  21. Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
  22. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  23. Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
  24. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
  25. Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
  26. Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
Posted by JoVE Editors on 6/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/64016

Tags

Pit AssayOsteoclastic ResorptionCalcium Phosphate CoatingOsteoclast DifferentiationPBMC IsolationResorption Pit QuantificationVon Kossa StainingFluorescence ImagingM CSF RANKLImageJ Analysis

Related Articles