Method Article

بروتوكول فحص حفرة بسيط لتصور وقياس امتصاص الخلايا العظمية في المختبر

DOI:

10.3791/64016

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
Posted by JoVE Editors on 6/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/64016

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم إجراء فحص بسيط وفعال لاختبارات حفرة الارتشاف باستخدام ألواح زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العظمية الناضجة هي خلايا متعددة النوى يمكنها تحلل العظام من خلال إفراز الأحماض والإنزيمات. وهي تلعب دورا حاسما في الأمراض المختلفة (مثل هشاشة العظام وسرطان العظام) وبالتالي فهي أشياء مهمة للبحث. في المختبر ، يمكن تحليل نشاطهم عن طريق تشكيل حفر ارتشاف. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة بسيطة لفحص الحفرة باستخدام ألواح زراعة الخلايا المطلية بفوسفات الكالسيوم (CaP) ، والتي يمكن تصورها وتحديدها كميا بسهولة. تم استزراع سلائف Osteoclast المشتقة من خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية (PBMCs) على الألواح المطلية في وجود محفزات عظمية المنشأ. بعد 9 أيام من الحضانة ، تم تثبيت الخلايا الآكلة العظمية وتلوينها للتصوير الفلوري بينما تم تلطيخ طلاء CaP بواسطة الكالسيين. لتحديد حجم المنطقة التي تم امتصاصها ، تم تلطيخ طلاء CaP على الألواح بنسبة 5٪ AgNO3 وتم تصوره بواسطة التصوير الساطع. تم قياس مساحة حفرة الارتشاف كميا باستخدام ImageJ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العظمية (OCs) هي بلاعم خاصة بالأنسجة مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، وتلعب دورا محوريا في إعادة تشكيل العظام مع الخلايا العظمية1. ترجع اضطرابات العظام الخبيثة والمناعية والخبيثة التي تدمر العظام بشكل منهجي أو محلي إلى النشاط العظمي الزائد ، بما في ذلك هشاشة العظام المرتبطة بانقطاع الطمث2 ، والتهاب المفاصل الروماتويدي3 ، وأمراض اللثة4 ، ومرض العظام النقوي5 ، وورم العظام العظمي6. في المقابل ، يمكن أن تسبب العيوب في تكوين OC ووظيفته أيضا هشاشة العظام7. تخضع HSCs للتمايز إلى أسلاف OC ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية (رقم الموافقة 287/2020B02).

1. إعداد لوحات زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم

  1. تحضير محلول مخزون الكالسيوم (25 mM CaCl 2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl 2·6H 2 O in Tris buffer)
    1. قم بإعداد مخزن مؤقت 1.0 M Tris واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1 M HCl.
    2. قم بإعداد كوب زجاجي على مقلب مغناطيسي وأضف 100 مل من المخزن المؤقت 1.0 M Tris.
    3. يزن 0.368 جم من CaCl 2·2H 2O ، و 8.0 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.305 جم من MgCl 2·6H2 O ويذوب في مخزن Tri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ طلاء فوسفات الكالسيوم في الجزء السفلي من ألواح زراعة الخلايا في خطوتين للطلاء تتضمنان تكلس مسبق لمدة 3 أيام وخطوة تكلس لمدة 1 يوم. كما هو موضح في الشكل 1 ، تم الحصول على فوسفات الكالسيوم الموزع بشكل موحد في الجزء السفلي من لوحات البئر 96. التزم الطلاء جيدا بالقاع بعد خطوات الغسيل المنجزة.

figure-results-1
الشكل 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نصف طريقة بسيطة وموثوقة لفحص ارتشاف العظام باستخدام OCs المشتقة والموسعة في المختبر من PBMCs. يمكن تحضير لوحات زراعة الخلايا المغلفة ب CaP المستخدمة بسهولة وتصورها باستخدام المواد المتاحة في المختبر. بالإضافة إلى PBMCs غير المصنفة المعتمدة في هذا البروتوكول ، تم أيضا استزراع OCs المتولدة من الخلايا أحادية الخلايا الفئران21 وخلايا البلاعم في نخاع العظم17 على ركائز اصطناعية مماثلة لفحص الحفرة ، وبالتالي يمكن نقل مصادر الخلايا هذه إلى هذا النهج في إشارة إلى الأدبي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني [CSC No. 201808440394]. تم تمويل W.C. من قبل CSC.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3< / sub>SERVA Electrophoresis GmbH35110نترات الفضة
a-MEMGibco32561-029MEM alpha ، GlutaMAX ، بدون نيوكليوسيدات
أمفوتريسين بBiochrom03-028-1Bمحلول الأمفوتريسين B
CaCl2< / sub>Sigma-Aldrich21097-50Gثنائي هيدرات
كلوريد الكالسيومالكالسينسيجما ألدريتشC0875الكالسين
FBSسيجما-ألدريتشF7524مصل الأبقار الجنيني
فيكولسيتيفا17144002فيكول باك بلس
التثبيت العازلةBiolegend420801بارافورمالديهايد
هيدروكلوريكميرك1.09057.1000حمض الهيدروكلوريك
Hoechst 33342بروموكينPK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25المؤتلف البشري M-CSF
MgCl2< / sub>Sigma-Aldrich7791-18-6كلوريد المغنيسيوم
Na2< / sub>HPO4< / sub>AppliChem GmbHA2943،0250ثنائي فوسفات هيدروجين الصوديوم اللامائي
NaClMerkS7653-250Gكلوريد الصوديوم
NaHCO3< / sub>MerkK15322429بيكربونات الصودا
PBSLonza17-512Fمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (1X) ، DBPS بدون قلم الكالسيوم والمغنيسيوم
StrreprepLonzaDE17-602Eخليط البنسلين والستربتومايسين
فالويدين أليكسا فلور 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKLPeproTech310-01مؤتلف الإنسان sRANK Ligand (مشتق من الإشريكية القولونية)
تريسسيجما ألدريتش93362تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان
تريتون X-100سيجما ألدريتشT8787ألكيل فينيل بولي إيثيلين جلايكول
TrypLE ExpressGibco12605010إنزيمات تفكك الخلايا المؤتلفة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pit AssayOsteoclastic ResorptionCalcium Phosphate CoatingOsteoclast DifferentiationPBMC IsolationResorption Pit QuantificationVon Kossa StainingFluorescence ImagingM CSF RANKLImageJ Analysis

Related Articles