مقالة منهجية

استخدام الملقط البصري المزدوج والموائع الدقيقة للدراسات أحادية الجزيء

DOI:

10.3791/64023

⸱

نوفمبر 18, 2022

1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Nebraska Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تسهيل الكيمياء الحيوية البصرية أحادية الجزيء التي تمت دراستها من خلال غرف الموائع الدقيقة بشكل كبير باستخدام برميل زجاجي ، ومحاقن مانعة لتسرب الغاز ، ووصلات مستقرة للأنابيب بخلايا التدفق ، والقضاء على الفقاعات عن طريق وضع صمامات التبديل بين المحاقن والأنابيب. يصف البروتوكول الفخاخ البصرية المزدوجة التي تمكن من تصور معاملات الحمض النووي والتفاعلات بين الجزيئات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكيمياء الحيوية البصرية هي تقنية قوية لمراقبة الخصائص العشوائية للإنزيمات المفردة أو مجمعات الإنزيم التي يتم حجبها في المتوسط الذي يحدث في دراسات المرحلة السائبة. لتحقيق التصور ، يتم تركيز الملقط البصري المزدوج ، حيث يتم تثبيت أحد المصيدة والآخر متحرك ، في قناة واحدة لغرفة الموائع الدقيقة متعددة التيارات الموضوعة على مرحلة مجهر مضان مقلوب. تحبس الملقط البصري جزيئات مفردة من الحمض النووي المسمى بالفلورسنت وتدفق السوائل عبر الغرفة وتتجاوز الخرز المحبوس ، وتمتد الحمض النووي إلى شكل B (تحت الحد الأدنى من القوة ، أي 0 pN) مع ملاحظة الحمض النووي كخيط أبيض على خلفية سوداء. يتم نقل جزيئات الحمض النووي من تيار إلى آخر ، عن طريق ترجمة المرحلة المتعامدة مع التدفق لتمكين بدء التفاعلات بطريقة خاضعة للرقابة. لتحقيق النجاح ، يتم تزاوج أجهزة الموائع الدقيقة ذات القنوات الواضحة بصريا مع المحاقن الزجاجية المثبتة في مكانها في مضخة حقنة. تستخدم النتائج المثلى الموصلات المرتبطة بشكل دائم بخلية التدفق ، وهي أنابيب صلبة ميكانيكيا ومقاومة كيميائيا ، ومتصلة بصمامات التبديل التي تقضي على الفقاعات التي تمنع التدفق الصفحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدمت القدرة على تصور تفاعلات البروتين والحمض النووي على مستوى الجزيء الواحد وفي الوقت الفعلي نظرة ثاقبة مهمة لاستقرار الجينوم 1,2. بالإضافة إلى العمل مع جزيئات مفردة من الحمض النووي واحدا تلو الآخر ، فإن القدرة على عرض المعاملات بين الجزيئات الفردية القريبة توفر رؤية إضافية3،4،5. يتطلب التلاعب بجزيئات الحمض النووي الإضافية كلا من الفخاخ البصرية الإضافية بالإضافة إلى خلايا تدفق الموائع الدقيقة عالية الجودة ومتعددة القنوات6.

هناك العديد من الطرق المتاحة لإنشاء أكثر من مصيدة بصرية واحدة. وتشمل هذه مرايا مسح الجلفانومتر ، ومعدلات البصريات الصوتية ، والبصريات الحيود ، والتي تولد ملاقط بصرية ثلاثية الأبعاد4،7،8،9. في كثير من الأحيان ، تنتج مرايا المسح الضوئي والمعدلات البصرية الصوتية مصائد تشارك بالوقت. في الإعداد الموضح هنا ، يتم تقسيم شعاع ليزر Nd: YAG واحد على الاستقطاب ، ثم تتحكم مرايا المسح الضوئي بالليزر الجلفانومتر في موضع ما يسمى بالمصيدة المتنقلة (الشكل 1) 4. لتسهيل وضع المرايا والمرشحات لتوجيه شعاع الاصطياد إلى الفتحة الخلفية لهدف المجهر ، يتم استخدام ليزر HeNe. هذا يجعل المحاذاة الكلية أسهل لأن شعاع HeNe مرئي للعين المجردة ، في حين أن أشعة الأشعة تحت الحمراء ليست كذلك. يعد شعاع HeNe أيضا أكثر أمانا للعمل مع جعل وضع المرايا والمكونات الأخرى أقل إرهاقا. في البداية ، يكون مسار شعاع هذا الليزر منفصلا عن شعاع 1064 نانومتر ، ولكن يتم إدخاله في نفس مسار الحزمة ، ثم في هدف المجهر. بمجرد تحقيق المحاذاة المادية ، يتم وضع شعاع 1064 نانومتر أعلى شعاع HeNe ويتم تسهيل ذلك من خلال استخدام عارض الأشعة تحت الحمراء وأدوات تصوير الحزمة المختلفة لتصور موضع الحزمة وجودتها. بعد ذلك ، يتم إدخال موسع الحزمة ، ويتم محاذاة شعاع الأشعة تحت الحمراء الموسع الناتج على الفتحة الخلفية للهدف. أخيرا ، تتم إزالة الهدف ويتم قياس القدرة في كل حزمة مستقطبة وتعديلها باستخدام ألواح موجية λ / 2 لتكون متساوية (الشكل 1C). يتم إجراء قياسات الطاقة أيضا بمجرد إرجاع الهدف وعادة ما يكون هناك فقدان للطاقة بنسبة 53٪. ومع ذلك ، هناك طاقة كافية لتشكيل مصائد بصرية ثابتة ومتحركة مستقرة في المستوى البؤري (الشكل 1D).

لتصوير معاملات الحمض النووي ، تلعب خلايا تدفق الموائع الدقيقة دورا رئيسيا لأنها تسمح بالقياسات الخاضعة للرقابة على مستوى الجزيء الواحد بدقة مكانية وزمانية عالية (الشكل 2). يشير مصطلح الموائع الدقيقة إلى القدرة على معالجة السوائل في قناة واحدة أو أكثر بأبعاد تتراوح من 5-500 ميكرومتر10,11. يشير مصطلح التيار إلى السائل الفعلي داخل القناة وتشير القناة إلى القناة المادية التي يتحرك فيها تيار أو تيارات مائعة. يحتوي تصميم خلية التدفق أحادية القناة على قناة مادية مشتركة حيث يتم ملاحظة التفاعلات وعادة ما يكون هناك تيار سائل واحد فقط. وبالتالي ، تعرف هذه التصميمات باسم خلايا التدفق أحادية الدفق. في المقابل ، يتم تعريف خلايا التدفق متعددة الدفق على أنها جهاز موائع دقيقة تتلاقى فيه قناتان أو أكثر من قنوات الدخول في قناة مادية واحدة مشتركة (الشكل 2 أ). داخل القناة المشتركة ، تتدفق تيارات السوائل التي تنشأ من القنوات الفردية بالتوازي مع بعضها البعض ، وتظل منفصلة مع حدوث الحد الأدنى من الاختلاط بينها بسبب الانتشار (الشكل 2 ب). في معظم الإعدادات التجريبية ، تدفع مضخة واحدة السوائل إلى كل قناة بنفس السرعة. في المقابل ، عند استخدام التوجيه الحدودي ، تقوم ثلاث مضخات أو أكثر يتم التحكم فيها بشكل مستقل بدفع السوائل عبر القنوات. ومع ذلك ، تعمل كل مضخة بسرعة مختلفة ولكن معدل التدفق الصافي في القناة المشتركة ثابت12. هذا يسمح بالتبادل السريع لمكونات القناة الرئيسية ببساطة عن طريق تغيير سرعة المضخة.

بالإضافة إلى التدفق الصفحي ، هناك عامل حاسم آخر هو ملف تعريف سرعة القطع المكافئ داخل تيار السائل الرقائقي. تحدث أعلى سرعة تدفق في منتصف التيار ويحدث الأبطأ بجوار الأسطح (الشكل 2C)13. يجب اعتبار هذا المظهر الجانبي لتمديد جزيء الحمض النووي المرتبط بخرزة مثبتة في التيار بالكامل من أجل التصور الدقيق للحمض النووي الفلوري والتحليلات الدقيقة لجزيء واحد. هنا ، يمتد الحمض النووي إلى الشكل B ويتم تثبيته في مكانه تحت 0 pN من القوة. لتحقيق ذلك ، يجب أن يكون تركيز موضع المصيدة الضوئية على موضع 10-20 ميكرومتر من سطح الغطاء السفلي (الشكل 2D). يجب توخي الحذر حتى لا يمتد جزيء الحمض النووي إلى ما بعد الشكل B لأن هذا يمكن أن يمنع تفاعلات الإنزيم. في ظل ظروف المخزن المؤقت النموذجية ، 1 ميكرومتر = 3000 نقطة أساس من الحمض النووي14. علاوة على ذلك ، من خلال محاصرة 10-20 ميكرومتر من الغطاء ، يتم وضع مركب الحمض النووي بعيدا عن السطح وبالتالي تقليل التفاعلات السطحية.

تم استخدام العديد من الطرق لإنشاء قنوات جهاز الموائع الدقيقة ويمكن القيام بذلك في المختبر أو يمكن شراء خلايا التدفق من المصادر التجارية6،15،16،17. يجب أن تكون المواد المثلى المستخدمة لبناء خلايا التدفق صلبة ميكانيكيا ، وشفافة بصريا مع مضان منخفض ، وغير منفذة للمذيبات العضوية6. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام الزجاج المصقول البورسليكات ، أو السيليكا المنصهرة لتوفير بيئة تدفق مستقرة لفترة طويلة مناسبة للاصطياد البصري والتصور واكتشاف القوة. تسمح هذه المواد أيضا باستخدام المذيبات غير المائية (على سبيل المثال ، الميثانول من الدرجة الطيفية) لتبسيط ترطيب السطح وإزالة فقاعات الهواء ، والمواد المسخة (على سبيل المثال ، 6M guanidinium hydrochloride) أو المنظفات لتنظيف خلية التدفق. أخيرا ، تختلف الطرق المستخدمة لإدخال السوائل في خلايا التدفق من أنظمة مضخات التفريغ المعقدة إلى مضخات المحاقن المفردة 14،18،19،20،21،22،23،24،25،26،27. في النهج الموضح هنا ، يتم استخدام مضخة حقنة يمكنها استيعاب ما يصل إلى 10 محاقن (الشكل 3 أ). يوفر هذا المرونة لاستخدام خلايا التدفق أحادية القناة أو خلايا التدفق ذات قنوات مدخل متعددة. هنا ، يتم استخدام خلية تدفق ثلاثية القنوات ويتم تزاوجها مع المحاقن المثبتة في مكانها على مضخة المحقنة باستخدام أنابيب poly-ether-ether-ketone (PEEK) (الشكل 3A-C). يتم التحكم في تدفق السوائل بواسطة صمامات تبديل رباعية الاتجاهات وبالتالي تعمل على تقليل إدخال الفقاعات في خلية التدفق (الشكل 3 أ ، د). بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام محاقن هاملتون محكمة الغاز التي لها جدران زجاجية صلبة وغطاسات مطلية بالبولي تترافلوروإيثيلين (PTFE) ، لأنها توفر حركة مكبس سلسة بشكل استثنائي ضرورية للحصول على تدفق سلس14,27.

في النظام التجريبي الموصوف ، تم استخدام خلايا التدفق مع قناتين إلى خمس قنات. يتم تحديد عدد قنوات المدخل من خلال التجربة التي يتم إجراؤها. لدراسة RecBCD و Hop2-Mnd1 ، كانت قناتان دفق كافية14,28. بالنسبة إلى اللولب ، كان الإنزيم مرتبطا بالطرف الحر من الحمض النووي وترجم إلى تيار يحتوي على المغنيسيوم و ATP لبدء النقل والتفكيك. بالنسبة إلى Hop2-Mnd1 ، تمت ترجمة الحمض النووي المحاصر بصريا إلى تيار السائل المجاور الذي يحتوي على البروتينات والمخزن المؤقت ± أيونات المعادن ثنائية التكافؤ. يتيح استخدام خلايا التدفق ثلاثية القنوات للمرء حبس الحمض النووي في التيار 1 ، وترجمة الحمض النووي إلى التيار 2 للسماح بحدوث ارتباط البروتين ، ثم التدفق 3 حيث يوجد ATP ، على سبيل المثال ، لبدء التفاعلات. الاختلاف في ما سبق هو استخدام البروتين الموسوم بالفلورسنت في القناة 2 ، مما يؤدي إلى أن يكون تيار السائل أبيض تماما ويمنع تصور الحمض النووي. عندما يترجم هذا الجزيء إلى تيار 3 ، يكون كل من البروتينات والحمض النووي مرئيا الآن عند بدء التفاعلات.

يعد استخدام صمامات التبديل رباعية الاتجاهات للتحكم في تدفق السوائل مكونا مهما في النظام للقضاء على الفقاعات في خلايا التدفق. الفقاعات ضارة بتدفق السوائل المستقر لأنها تتقلص وتتوسع بطرق غير متوقعة مما يؤدي إلى تغيرات سريعة في سرعة التدفق وإدخال الاضطراب. عندما يتم وضع الصمامات بين المحاقن وأنابيب المدخل ، يتم فصل مسار التدفق عن طريق تبديل موضع الصمام عند تغيير المحاقن. عندما يتم وضع المحقنة الجديدة في مكانها ، يمكن الضغط على المكبس يدويا بحيث يتم إخراج >6 ميكرولتر (الحجم الميت للصمام) وهذا يزيل الفقاعات بالكامل تقريبا.

غالبا ما يكون ربط الموصلات بخلايا التدفق هو خطوة تحديد المعدل في استخدام خلايا التدفق. وصفنا استخدام نوعين من الموصلات: قابلة للإزالة تعرف باسم press-fit وأخرى دائمة (تجميعات nanoport). الموصلات القابلة للإزالة سهلة الالتصاق بخلية التدفق ويمكن اختبار أنواع مختلفة من الأنابيب المرنة بالإضافة إلى PTFE الموصى بها باستخدام هذه الموصلات. هذه طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لاختبار الأنابيب والموصلات دون التضحية بخلايا تدفق الزجاج الأكثر تكلفة. في المقابل ، يتم إرفاق مجموعات المنافذ النانوية بشكل دائم ، وتتحمل ضغوطا تصل إلى 1000 رطل / بوصة مربعة ، وفي أيدينا ، يقتصر استخدامها على أنابيب PEEK بأقطار مختلفة. هذا ليس عيبا حيث يفضل استخدام أنابيب PEEK. يمكن إعادة استخدام خلية تدفق زجاجية واحدة مع تجميعات دائمة مرفقة لأكثر من 1 سنة مع الاستخدام الدقيق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. محاذاة مصيدة الليزر واختبارها باستخدام حبات البوليسترين

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 1 أ ، ب.

تنبيه: يجب على القائم بالتجربة ارتداء نظارات واقية مناسبة أو نظارات أمان بالليزر أثناء محاذاة شعاع الليزر. نظرا لأن نظام الملقط البصري الموصوف هنا يستخدم كلا من حزم HeNe و IR ، يلزم وجود مجموعتين منفصلتين من الأواني الزجاجية الآمنة بالليزر.

  1. محاذاة شعاع HeNe
    1. ضع جميع المكونات البصرية على اللوح. قم بمحاذاة اللوح بحيث يكون قريبا من زاوية 90 درجة قدر الإمكان بالنسبة إلى المجهر.
    2. قم بتوصيل أنبوب التزاوج الذي يحتوي على الهدف وعدسة telan بالمجهر (الشكل 1A-11،12).
      ملاحظة: عدسة telan هي نظام عدسة يستخدم لتركيز الصورة على مستوى الصورة المتوسط في العدسات.
    3. قم بتشغيل ليزر HeNe وافتح الغالق (الشكل 1A-18). يجب أن يضرب الشعاع المرشح (الشكل 1A-3) على ارتفاع 54 مم يعكس 50٪ من الضوء على المرآة 5 (الشكل 1A-5). تصطدم نسبة 50٪ المتبقية من الحزمة بالمرآة 4 (الشكل 1A-4) بنفس ارتفاع المرآة 3.
    4. اضبط المرآة 4 (الشكل 1A-4) بحيث تصطدم الحزمة بالمرآة 6 (الشكل 1A-6) على ارتفاع 51 مم.
    5. اضبط المرآة 6 (الشكل 1A-6) بحيث يتم توجيه الحزمة إلى المرآة الجلفانية السفلية على ارتفاع 51 مم. سيكون الشعاع الذي يخرج من المرآة الجلفانية العلوية عند 57.5 مم.
    6. اضبط المرآة 3 (الشكل 1A-3) بحيث يضرب هذا الشعاع المرآة 5 (الشكل 1A-5) على ارتفاع 57.5 مم. بمجرد انعكاس المرآة 5 ، يجب أن تضرب الحزمة المرآة 9 (الشكل 1A-9) بنفس الارتفاع. يتم إعادة تجميع الحزمة بشكل فعال في المرآة 9 ، ويمر عبر الهدف ، ونظام عدسة telan على المرآة 21 (الشكل 1A-21) ، مما يعكسه في الهدف.
    7. ضع شريحة مجهر نظيفة على مرحلة المجهر. قم بتشغيل الكاميرا وتصوير حزم الحزم الثابتة والمسح الضوئي بشكل فردي على الشاشة. بدءا من المرآة 3 ، ثم 5 و 9 ، وأخيرا 21 ، قم بإجراء تعديلات صغيرة لوضع الحزمة الثابتة في وسط الشاشة.
    8. للتأكد من أن زاوية خروج الشعاع من المرآة 21 هي 90 درجة ، قم بتغيير ارتفاع Z للمجهر وضع الحزمة المصورة على الأسطح العلوية والسفلية للشريحة. عندما تكون متطابقة ، تكون الحزمة في الموضع الصحيح ، وهو عمودي على المرحلة. قم بإغلاق هذا الشعاع باستخدام الغالق 19 (الشكل 1A-19).
    9. بدءا من المرايا 4 و 6 ، قم بإجراء تعديلات صغيرة لوضع الشعاع الثابت في وسط الشاشة. مصراع هذا الشعاع.
  2. محاذاة شعاع الأشعة تحت الحمراء (IR)
    تنبيه: نفذ جميع الخطوات بطاقة ليزر منخفضة لأسباب تتعلق بالسلامة.
    1. اضبط لوحة الموجة 14 (الشكل 1A-14) لضبط نسبة الحزم المرسلة والمنعكسة التي يتم تقسيمها عند مقسم الحزمة 2 (الشكل 1A-2). يعكس مقسم الشعاع 2 المكون s لشعاع الليزر وينقل المكون p.
    2. تصطدم الحزمة التي تمر عبر 2 بالمرآة 7 (الشكل 1A-7) ، والتي تنحرف الحزمة إلى المرآة الجلفانية السفلية. يجب أن يتبع مسار شعاع HeNe على المرآة 21. أداء حركات صغيرة من مرآة 7 لتحقيق هذا الوضع.
    3. اضبط المرآة 2 بحيث يضرب الشعاع الذي تنعكس بواسطة المرآة 2 المرآة 10 (الشكل 1A-10) على ارتفاع 57.5 مم.
    4. ينعكس الشعاع من المرآة 10 إلى المرآة 8 (الشكل 1A-8) على ارتفاع 57.5 مم. يجب أن يضرب الشعاع اللاحق المرآة 9 بنفس الارتفاع. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بإجراء تعديلات صغيرة على المرايا 10 و 8 حسب الحاجة.
    5. قم بإزالة الهدف ووضع رأس عداد الطاقة فوق المنفذ في برج الهدف.
    6. استخدم اللوحات 14 و 15 و 16 (الشكل 1A-14،15،16) لضبط قوة كل شعاع ليزر بحيث تكون متساوية كما هو موضح في الشكل 1C.
    7. ضع موسع الشعاع 1 (الشكل 1A-1) في مكانه. اضبط شعاع الليزر الموسع ليكون دائريا دون أي غيبوبة أو استجماتيزم.
    8. لاختبار الفخاخ البصرية ، اصنع محلولا من حبات البوليسترين 1 ميكرومتر معلقة في الماء. بعد ذلك ، ضع 10 ميكرولتر من هذا المحلول على شريحة مجهر ، ضع غطاء في الأعلى وأغلقه بطلاء الأظافر. ضع الشريحة على مرحلة المجهر واختبر الفخاخ الضوئية عن طريق محاصرة هذه الخرز 1 ميكرومتر. تأكد من امتصاص الخرز في الفخاخ وتثبيته بثبات عند تحريك المسرح. يجب أن يحدث الاصطياد بكفاءة متساوية من جميع جوانب المصيدة.

2. إعداد غرفة الموائع الدقيقة

  1. إذا كانت خلية التدفق عبارة عن جهاز تم إنشاؤه تجاريا مصنوع من polydimethylsiloxane (PDMS) على قسيمة غطاء ، فانتقل إلى الخطوة 3. إذا كان جهازا زجاجيا به موصلات متصلة ، فانتقل إلى الخطوة 4.
  2. إذا لم تكن خلية التدفق تحتوي على موصلات متصلة ، فقم بربطها بفتحات الدخول الموجودة على شريحة المجهر أولا. راجع الخطوة 3 لمعرفة خطوات توصيل الموصلات.

3. اتصالات خلية التدفق باستخدام خلية تدفق PDMS

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 2D.

  1. ضع خلية التدفق على سطح مستو نظيف. امسك أنبوب PTFE 3 مم من الطرف الحر بالملقط. ادفع الأنبوب إلى المنفذ المشكل مسبقا (يمكن أن يدعم المنفذ ضغط خط 2 بار).
  2. كرر هذا الإجراء لكل منفذ من المنافذ المتبقية. قم بتوصيل منافذ المدخل بمضخة المحقنة والمخرج بزجاجة نفايات (الشكل 4 أ ، ب).
  3. املأ كل حقنة زجاجية ب 1 مل من الميثانول من الدرجة الطيفية. قم بتوصيل كل حقنة بصمام التبديل. تأكد من أن الصمام يحتوي على مخرج موجه للنفايات وتطهير كل خط ب 50 ميكرولتر من الميثانول (الشكل 4C ، الوضع المغلق).
  4. قم بتبديل موضع المخرج إلى خلية التدفق (الشكل 4C ، الوضع المفتوح). ضخ 800 ميكرولتر من الميثانول عبر خلية التدفق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة لتبليل الأسطح والقضاء على الفقاعات.
  5. في اليوم التالي ، كرر هذه العملية باستخدام 800 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. خلية التدفق جاهزة الآن للاستخدام.

4. إرفاق موصلات أنابيب الصحافة المناسبة

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 2F.

  1. إذا كان سيتم استخدام موصلات أنابيب مناسبة للضغط ، فقم بإزالة الشريط اللاصق بعناية من جانب واحد من الموصل وضعه فوق الفتحة الموجودة في شريحة المجهر. اضغط لأسفل لبضع ثوان. كرر العملية للموصلات المتبقية.
  2. ضع خلية التدفق على سطح مستو نظيف. امسك أنبوب PTFE 3 مم من الطرف الحر بالملقط. ادفع الأنبوب إلى الفتحة المشكلة مسبقا في المنفذ وكرر هذا الإجراء لكل منفذ من المنافذ المتبقية.
  3. قم بتوصيل الأنابيب من المداخل بصمامات التبديل. انتقل إلى الخطوة 7.

5. إرفاق الجمعيات الدائمة

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 2A-C.

  1. قم بإجراء المرفق إما على سطح نظيف ومسطح أو على مشعب مصمم خصيصا لتثبيت خلية التدفق والموصلات في مكانها أثناء حدوث الترابط.
  2. ضع خلية التدفق على سطح مستو نظيف أو في القسم الغائر من المشعب (الشكل 2 ب). ضع كمية صغيرة من الغراء الزجاجي في الجزء السفلي من المجموعة وأدخل الختم.
  3. ضع المنفذ النانوي فوق أحد فتحات الدخول على شريحة المجهر. ادفع برفق لأسفل وثبت في مكانه بدون حركة جانبية. كرر العملية للمنافذ المتبقية.
  4. السماح ليجف أو المشبك في مكانه في المشعب. قم بإزالة خلية التدفق برفق من المشعب وتأكد من محاذاة التجميعات جيدا مع منافذ الدخول في خلية التدفق. انتقل إلى الخطوة 7 عندما تكون جاهزا.

6. اتصالات خلية التدفق والتحضير

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 4 أ ، ب.

  1. ضع خلية تدفق على مرحلة المجهر. قم بتوصيل الأنبوب باستخدام الموصلات الضيقة للإصبع.
  2. املأ كل حقنة زجاجية ب 1 مل من الميثانول من الدرجة الطيفية. قم بتوصيل كل حقنة بصمام التبديل. تأكد من أن الصمام يحتوي على مخرج موجه للنفايات وتطهير كل خط ب 50 ميكرولتر من الميثانول (الشكل 4C ، الوضع المغلق).
  3. قم بتبديل موضع المخرج إلى خلية التدفق (الشكل 4C ، الوضع المفتوح). ضخ 800 ميكرولتر من الميثانول عبر خلية التدفق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة لتبليل الأسطح والقضاء على الفقاعات.
  4. في اليوم التالي ، كرر هذه العملية باستخدام 800 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. خلية التدفق جاهزة الآن للاستخدام.

7. التحكم في تدفق السوائل

  1. أدر صمامات التبديل إلى الوضع المغلق (الشكل 4 ج). إزالة المحاقن ، والتخلص من المياه المتبقية ، وملء المحاقن مع حلول تجريبية ، على سبيل المثال ، حبات الحمض النووي ؛ انزيم; و ATP. أعد المحاقن إلى المضخة وقم بتوصيلها بصمامات التبديل.
  2. في هذا الوضع ، قم بإجبار الغطاسات يدويا على خفض 5-10 ميكرولتر لإزالة أي فقاعات. قم بتغيير موضع صمام التبديل إلى فتح.
  3. استخدم مخطط معدل التدفق لتحقيق سرعة تدفق السوائل المثلى للملائمة والتصور كما هو موضح في الجدول 1. يجب أن يتيح التدفق الأمثل للسوائل للاصطياد البصري الاصطياد المستقر للخرز وبمجرد تمدد الحمض النووي ، يجب أن يكون على شكل B (~ 3000 bp / μm).

8. محاصرة حبات البوليسترين مع جزيئات الحمض النووي المفردة المرفقة

  1. عند التكبير 10x ، حدد موقع الحد الفاصل بين تيارات السوائل بالقرب من نقاط دخول القناة. أضف الزيت إلى هدف 100x وانتقل إلى التكبير الأعلى.
  2. افتح مصاريع الفخاخ الضوئية (إما كلاهما أو واحد في كل مرة). يجب أن تحبس أشعة الليزر المركزة الخرز ويجب أن يمتد الحمض النووي على الفور.
  3. بمجرد محاصرة المجمع ، قم بترجمة المرحلة بشكل عمودي على التدفق (الشكل 3A ، C ، أقحم). سيؤدي ذلك إلى نقل المركب المحاصر من محلول حبة الحمض النووي إلى التيار 2. مزيد من الترجمة ستنقل المجمع إلى تيار 3.

9. تنظيف خلايا التدفق

ملاحظة: نفذ هذا يوميا.

  1. قم بإيقاف تشغيل المضخة عند اكتمال التجربة. أدر صمامات التبديل إلى الوضع المغلق (الشكل 4 ج).
  2. إزالة المحاقن وتفريغها. شطف ثلاث مرات بالماء المقطر المصفى.
  3. املأ المحاقن بمحلول التنظيف. ضع المحاقن في المضخة وقم بتوصيلها بصمامات التبديل.
  4. تطهير صمامات التبديل وتغيير الموقف لفتح. ضخ 800 ميكرولتر من محلول التنظيف بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة عادة بين عشية وضحاها.
  5. في اليوم التالي ، أغلق صمامات التبديل ، ثم قم بإزالة المحاقن وشطفها بالماء. شطف خلية التدفق والخطوط مع 4-800 ميكرولتر من الماء بمعدل تدفق 400-800 ميكرولتر / ساعة. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من التنظيف الشاق لخلايا التدفق ، فاستبدل محلول التنظيف ب 6 M guanidium hydrochloride.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إجراء الاختبار الأولي لمحاذاة المصيدة وقوتها باستخدام حبات البوليسترين غير الفلورية 1 ميكرومتر. نظرا لأن معظم الأبحاث التي أجريت في المختبر تستخدم مضان ، فإننا نختبر قوة المصيدة باستخدام 1 ميكرومتر ، حبات البوليسترين الخضراء التنين (الشكل 1D ، E). بعد ذلك يتغير العمل إلى الاصطياد البصري لمجمعات خرزة الحمض النووي حيث يتم تلطيخ الحمض النووي بصبغة ثنائية الإقحام YOYO-114,29. عندما يتم احتجاز هذه المجمعات 10-15 ميكرو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التجميع الدقيق لنظام التدفق أمرا بالغ الأهمية لنجاح نتائج التجارب 4,6. أحد أكثر جوانب البروتوكول تحديا هو ربط الموصلات بالسطح الزجاجي. لهذا ، نستخدم النهجين التاليين: موصلات الأنابيب المناسبة للضغط وتجميعات المنافذ النانوية. تلتصق الموصلات المناسبة للضغط بسهولة بالزجاج متبوعة بدفع أنابيب PTFE إلى الثقوب المشكلة مسبقا باستخدام الملقط. عندما تكون هناك حاجة إلى مرفق أكثر استقرارا ، يفضل ربط تجميعات المنافذ النانوية. مع الاستخدام الدقيق والتنظيف ، يمكن استخدام خل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلف عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم البحث في مختبر بيانكو من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة GM100156 و GM144414 إلى PRB

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100x موضوعيLeica506318 أو 506038عدسات الغمر في الزيت ؛ التصوير والاصطياد البصري فقط؛ خطط أهداف APO المحسنة للتصوير الفلوري
10X ObjectiveLeica506263تستخدم لتحديد مواقع أشعة الليزر أثناء المحاذاة ؛ للعثور على التركيز وموضع XY في خلية التدفق
1 مم حبات الفلورسنتBangsLabs FSDG004تستخدم لأداء الصنبور ، وتحديد الموضع البؤري
مم حبات البوليسترينBangs LabsCPO1004تستخدم لتقييم أداء المصيدة والربط بجزيئات البيوتينيل الموضوعية
63xLeica506081تستخدم لتحديد موقع بقع أشعة الليزر أثناء المحاذاة وللعثور على التركيز وموضع X-y في خلية التدفق ؛ يمكن استخدامها للاصطياد البصري حيث أن لها قطر فتحة خلفية متطابقة مع 100X ؛ عدسة غمر
الزيت ليزر محاذاةLumentum1100 سلسلة10mW ليزر HeNe الذي يمكن رؤيته للعين المجردة التي تستخدم لوضع البصريات
كاميرا محاذاة شعاعAmscopeMU303كاميرا بسيطة وغير مكلفة ويتم التحكم فيها بالبرمجيات لتصوير موضع الشعاع
في الكاميرا وبرنامج التقاط الصورHamamatsuHCImageينسق أنشطة Lambda DG4 مع الكاميرا لتسهيل التبديل السريع للطول الموجي
الكاميرا ؛ كاميرا Orca flash 4Hamamatsuc13440-20cuCCD لتصوير تجارب الجزيء الفردي
C-mount لكاميرا محاذاة الشعاعحلول التصوير الموضعيDE50CMTيوفر الوضع الأمثل للكاميرا لتصوير أشعة الليزر أثناء المحاذاة
C-mount لكاميراOrca Flash 4يحتوي على حلقة تثبيت لتثبيت مرشح حجب الأشعة تحت الحمراء في مكانه. هذا يزيل شعاع الأشعة تحت الحمراء المنعكسة من المصائد البصرية ويسهل تصويرا أوضح للأجسام المحاصرة.
Cy5   مكعب مرشح مضانSemrockcy5-404a-lsc-zeroيستخدم جنبا إلى جنب مع Lambda DG4 لتصوير Cy5 فقط
Fitc-Txred   مكعب مرشح مضانSemrockfitc / txred-2x-b-000يستخدم جنبا إلى جنب مع Lambda DG4 لتصوير أنابيب FITC و TXRed
FluidicsGrace Bio46004أنابيب PTFE كبديل لنظرة خاطفة ؛ يعمل بشكل جيد على بعض خلايا التدفق. يمكن استخدامها مع خلايا تدفق PDMS أو خلايا التدفق الزجاجي عند استخدام موصلات الأنابيب الملائمة من Grace Bio
مرشح مضان GFPSemrockgfp-3035b-lsc-zeroتستخدم جنبا إلى جنب مع Lambda DG4 لتصوير GFP فقط
خلايا التدفق الزجاجيTranslumeقنواتتدفق واضحة مخصصة للتصوير (الشكل 2 ه)
غراء زجاجيLoctite233841يربط مجموعات Nanoport بخلايا تدفق الزجاج بشكل آمن وسهل
خلايا تدفق شطيرة زجاجية / PDMSخدمات CIDRA Precisionتصميم مخصصخلايا التدفق المبنية وفقا لمواصفاتك ؛ قنوات التصوير واضحة (الشكل 2 ج)
تنظيف هاميلتون18311تنظيف لطيف ولكنه فعال لخلايا التدفق الزجاجي ؛ لا تنفجر عند استخدامها بعناية
نظام الإضاءةSutter InstrumentLamda DG4توقف لذا يوصي بنظام الإضاءة Lambda 721
Sutter InstrumentLamda DG4توقف ، لذا أوصي ببرنامج تحليل الصور Lambda 721
CyberneticsImage Pro Premiereتحليل الصور وتتبع الجزيء الفردي
برنامج تحليل الصورFiji / NIH Image / Image JSharewareتحليل الصور وتتبع الجزيء الفردي
بطاقة العرضMelles Griot06 DLA 001منتج بديل من Thorlabs: زيت الغمر VRC5
Zeiss444960Immersol 518 F أدوات محاذاة شعاع الليزر الحرة الخالية من التألق
مختبرات ThorFMP05 / M ؛ dgo5-1500-h1 ؛ BHM1 تستخدم لضمان أن تكون الحزم أفقية وعلى الارتفاع الصحيح
عارض شعاع الليزرمختبرات الضوئيات الكنديةIR 3150تستخدم لتصوير بقع شعاع الأشعة تحت الحمراء على المرايا والأهداف
عداد طاقة الليزرمختبراتقياس إخراج الليزر وكذلك قوة المصيدة
نظارات السلامة بالليزر (HeNe)مختبرات ثورLG7 أو 8بلوكات >3 وحدات OD من الضوء بأطوال موجية >600 نانومتر
نظارات أمان ليزر (IR)مختبرات ثورLG11كتل >7 وحدات OD من ضوء الأطوال الموجية & sup3 ؛ 1000 نانومتر
Mcherry  مكعب مرشح مضانSemrockmcherry-a-lsc-zeroيستخدم بالاقتران مع Lambda DG4 لتصوير mcherry فقط
مجهرLeicaDMIRE2DIC تمت إزالته لاستيعاب المحاصرة ثنائية اللون / مرآة المحاذاة
برنامج التحكم في المجهر UCSF / البرنامج التجريبييتحكم uManagerفي المجهر ، ويسمح بالمحاذاة البؤرية للأهداف بالإضافة إلى التحكم في المرحلة
تجميع Nanoportموصلات IDEXN333التي يتم ربطها بخلايا التدفق
دعم الجدول البصريThor LabsPA52502دعم جدول العزل النشط
البصريات والعدسات SolarTIIمتنوعمرايا التداخل والتلسكوبات والعدسات المصممة خصيصا للنظام خلايا
تدفق PDMSufluidixخلاياالتدفق المخصصة المبنية وفقا لمواصفاتك ؛ قنوات التصوير واضحة (الشكلان 2 ب و د)
أنابيب نظرة خاطفةIDEX1532يوفر اتصالا ممتازا بخلايا التدفق وصمامات التبديل مكعب
مرشح مضان بينكلسيمروكlf488 / 543 / 635-3x-a-000تستخدم جنبا إلى جنب مع Lambda DG4 لتصوير العديد من الفلوروفورات بسرعة
اضغط على موصلات الأنابيب المناسبةGraceBio46003موصل سيليكون شفاف مع مادة لاصقة ترتبط جيدا بالزجاج
مرايا المسحGSI LumonicsVM500تستخدم لتوفير التحكم في المصيدة البصرية الثانية. لم يعد GSI Lumonics موجودا. يمكن شراء مرايا مماثلة من Cambridge Scientific
Stage Leica
Stage ميكرومترعلوم المجهر الإلكتروني68042-08يوفر مسطرة على الشاشة لتحديد موضع الحزمة ومعايرة النظام
صماماتالتبديل IDEXV-101Tالتحكم في اتجاه تدفق السوائل والقضاء على إدخال الفقاعات في خلايا التدفق
ومشعب الصماممتجر آلةلا شيءمضخة
حقنةهارفارد جهازPHD 2000يتحكم في تدفق السوائل من خلال خلايا التدفق
برنامج مضخة الحقنةهارفارد<قوي>70-6000< / قوي>يوفر التحكم في التدفق تحكما سلسا وقابلا للبرمجة في محاقن تدفق السوائل
هاميلتون81320محكم الغاز ، قفل PTFE Luer ، براميل زجاجية مع الغطاسات المطلية بالتفلون
سطح الطاولةThor LabsT36Hسطح الطاولة البصرية أو اللوح
محاصرة الليزرنيوبورت / سبكترا فيزياءسلسلة J ؛ BL106CNd: ليزر YAG ؛ 1064 نانومتر ؛ ليزر 5 واط
1 التحكم Fit مكعب محلول حل Media ثور منفذ مصممة خصيصا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
  2. Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491(2019).
  3. Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
  4. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  5. Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
  6. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  7. Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
  8. Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704(2006).
  9. Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810(2001).
  10. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
  11. Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
  12. Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
  13. Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
  14. Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
  15. Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
  16. Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
  17. Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069(2020).
  18. Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
  19. Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
  20. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
  21. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
  22. Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
  23. Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
  24. Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483(2007).
  25. Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
  26. Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
  27. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  28. Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
  29. Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA

مقالات ذات صلة