يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التجديد الظهاري المعوي استجابة للإشعاع المؤين

2.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64028

⸱

يوليو 27, 2022

 ,  ,  ,  , 

في هذه المقالة

ملخص

الجهاز الهضمي هو واحد من أكثر الأعضاء حساسية للإصابة عند علاجات السرطان الإشعاعية. إنه في نفس الوقت نظام عضوي يتمتع بواحدة من أعلى قدرات التجدد بعد مثل هذه الإهانات. يصف البروتوكول المقدم طريقة فعالة لدراسة القدرة التجديدية للظهارة المعوية.

الملخص

تتكون ظهارة الأمعاء من طبقة واحدة من الخلايا ولكنها تحتوي على أنواع متعددة من الخلايا المتمايزة نهائيا ، والتي يتم إنشاؤها عن طريق الانتشار النشط للخلايا الجذعية المعوية الموجودة في الجزء السفلي من الخبايا المعوية. ومع ذلك ، خلال أحداث الإصابة المعوية الحادة ، تخضع هذه الخلايا الجذعية المعوية النشطة لموت الخلايا. تشعيع جاما هو علاج لسرطان القولون والمستقيم يستخدم على نطاق واسع ، والذي ، على الرغم من فعاليته العلاجية ، له تأثير جانبي يتمثل في استنفاد تجمع الخلايا الجذعية النشط. في الواقع ، يعاني المرضى في كثير من الأحيان من متلازمة الإشعاع المعدي المعوي أثناء خضوعهم للعلاج الإشعاعي ، ويرجع ذلك جزئيا إلى نضوب الخلايا الجذعية النشطة. يؤدي فقدان الخلايا الجذعية المعوية النشطة في الخبايا المعوية إلى تنشيط مجموعة من الخلايا الجذعية المعوية الاحتياطية الهادئة عادة ويؤدي إلى إلغاء تمايز الخلايا الأولية الإفرازية والخلايا المعوية. إن لم يكن لهذه الخلايا ، فإن ظهارة الأمعاء ستفتقر إلى القدرة على التعافي من العلاج الإشعاعي وغيرها من الإهانات الأنسجة الرئيسية. تسمح التطورات الجديدة في تقنيات تتبع النسب بتتبع تنشيط الخلايا وتمايزها وهجرتها أثناء التجديد وقد تم استخدامها بنجاح لدراسة ذلك في القناة الهضمية. تهدف هذه الدراسة إلى تصوير طريقة لتحليل الخلايا داخل ظهارة الأمعاء للفأر بعد الإصابة الإشعاعية.

المقدمة

ستغطي ظهارة الأمعاء البشرية سطح نصف ملعب كرة الريشة تقريبا إذا تم وضعها بشكل مسطح تماما1. بدلا من ذلك ، يتم ضغط طبقة الخلية المفردة هذه التي تفصل البشر عن محتويات أمعائهم في سلسلة من الإسقاطات الشبيهة بالأصابع ، والزغابات ، والمسافات البادئة ، وهي خبايا تزيد من مساحة سطح الأمعاء. تتمايز خلايا الظهارة على طول محور الزغابات المشفرة. تتكون الزغابات بشكل أساسي من الخلايا المعوية الممتصة للمغذيات ، والخلايا الكأسية المفرزة للمخاط ، وخلايا الغدد الصماء المعوية المنتجة للهرمونات ، بينما تتكون الخبايا بشكل أساسي من خلايا بانيث المنتجة للدفاع ، والخلايا الجذعية النشطة والاحتياطية ، والخلايا السلفية2،3....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إيواء جميع الفئران في قسم الموارد الحيوانية المختبرية (DLAR) في جامعة ستوني بروك. وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان بجامعة ستوني بروك (IACUC) على جميع الدراسات والإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية. أجريت التجارب التي شملت مواضيع حيوانية بدقة وفقا لبروتوكول التعامل مع الحيوانات المعتمد (IACUC # 245094).

ملاحظة: تم الحصول على سلالات الماوس B6 ؛ 129-Bmi1 tm1 (cre / ERT) Mrc / J (Bmi1-Cre ER) و B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sortm1 (EYFP) Cos / J (Rosa26eYFP) تجاريا (انظر جدول المواد) وتم عبورها للحصول على Bmi1-Cre ER ؛ Rosa2....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يسمح استخدام تشعيع الجسم الكلي 12 جراي (TBI) بالاشتراك مع تتبع النسب الوراثية للفئران بإجراء تحليل شامل لعواقب الإصابة الإشعاعية في الأمعاء. للبدء ، Bmi1-CreER ؛ تلقت فئران Rosa26eYFP حقنة واحدة من عقار تاموكسيفين ، مما يؤدي إلى تعزيز تعبير البروتين الفلوري الأصفر (EYFP) داخل مجموعة الخلايا الجذعية الاحتياطية Bmi1 + . بعد يومين من حقن عقار تاموكسيفين ، خضعت الفئران للإشعاع أو التشعيع الوهمي. قبل ثلاث ساعات من القتل الرحيم ، تم حقن الفئران ب EdU. بعد القتل الرحيم ، تم جمع عينات ال.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول نموذجا قويا وقابلا للتكرار للإصابة الإشعاعية. يسمح بالتحليل الدقيق للتغيرات في ظهارة الأمعاء على مدار 7 أيام بعد الإصابة. الأهم من ذلك ، أن النقاط الزمنية المختارة تعكس المراحل الحاسمة من الإصابة وتتميز بتغيرات مميزة في الأمعاء (الإصابة ، موت الخلايا المبرمج ، التجديد ، ومراحل التطبيع)60. تم إنشاء هذا النموذج من التشعيع وتقييمه بعناية ، مما يدل على مظهر مناسب للإصابة لتقليد تلك التي يعاني منها المرضى الذين يخضعون للعلاج الإشعاعي61. يخضع أكثر من نصف مرضى س.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يرغب المؤلفون في الاعتراف بمركز أبحاث الأنسجة في مركز ستوني بروك للسرطان للحصول على مساعدة الخبراء في إعداد عينات الأنسجة وقسم الموارد الحيوانية المختبرية في جامعة ستوني بروك للمساعدة في رعاية الحيوانات والتعامل معها. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة DK124342 الممنوحة ل Agnieszka B. Bialkowska و DK052230 للدكتور فنسنت دبليو يانغ.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل حقنةBD
309659-16G إبر تغذية الصغيرة القابلة لإعادة الاستخدام: مستقيمVWR20068-630-27G
× 1/2 "إبرةBD
305109-28G × 1/2 "Monoject 1 مل حقنة الأنسولينCovidien
& Prime ؛ -deoxyuridine (EdU)سانتا كروز التكنولوجياالحيويةsc284628A10 مجم / مل في DMSO المعقم: الماء (1: 4 V / V) ، aliquot وتخزينه في -20 درجة ؛ ج
عازر العلمية  10٪ محايد مخزن الفورمالينفيشر Scientific22-026-213-B6.129X1-GT
(ROSA) 26Sortm1 (EYFP) Cos / Jسلالة مختبر جاكسون#: 006148
B6 ؛ 129-Bmi1tm1 (cre / ERT) Mrc / Jسلالة مختبر جاكسون#: 010531
مصل الأبقار الألبومين الجزئي V ، صدمة حراريةMillipore-Sigma3116956001
الدجاج المضاد ل GFPAvesGFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 مجموعة التصوير ، InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-زيت
الذرةMillipore-SigmaC8267-Decloaking
ChamberBiocare MedicalDC2012-ثنائي
ميثيل سلفوكسيد (DMSO)كواشف فيشر الحيويةBP231-100
بروتيناز خال من DNase حساسللضوءInvitrogenمخفف 25x في DPBS
Donkey Anti Chicken AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-Eosin
Fisher ScientificS176
مجهر مضان نيكون Eclipse 90i ضوء ساطع وذو انزال ، مع الأهداف: 10X ، 20Xنيكون
Fluoromount تركيب مائي متوسطMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0.759 Gy دقيقة -1< / sup>
الماعز المضادة للأرانب AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
محلول الهيماتوكسيلين ، الخياشيم رقم 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 Microtome الروتاري من Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258 ، Pentahydrate (bis-Benzimide)Thermo Fisher ScientificH3569التخفيف 1: 1000
محلول بيروكسيد الهيدروجين ، ACS ، 29-32٪ ، الطيف الكيميائيفيشر العلمي18-603-252-في
الموقع للكشف عن موت الخلايا ، الفلورسين (Roche)Millipore-Sigma11684795910
مانع السائل Super PAP PEN ، مينيفيشر ScientificDAI-PAP-S-M
كربونات الليثيوم (مسحوق / ACS معتمد) ، فيشر كيماويكالفيشر ساينتفيكL119-5000.5 جم / 1 لتر dH2O
Luer-Lok حقنة معقمة ، للاستخدام مرة واحدة ، 10 ملVWR89215-218-Methanol
VWRBDH1135-4LP
منتجات Pharmco   ؛ الكحول الإيثيلي ، 200 PROOFفيشر Scientific
NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT حمض الخليك ACS الصفCapitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-Rabbit
anti-Ki67BioCare MedicalCRM325
ريتشارد آلان Scientific Cytoseal XYL تصاعد متوسطفيشر Scientific22-050-262
حاضنة الصناعات العلمية - جيني لشرائح الخبز عند 65 درجةفيشر سيانتيفيك50-728-103
سترات الصوديوم ثنائي هيدراتفيشر ScientificS279-500
طقم تشريح الفولاذ المقاومVWR25640-002
Superfrost Plus شرائح صغيرة [الحجم: 25 × 75 × 1 مم]VWR& nbsp ؛ 48311-703
تاموكسيفينMillipore-SigmaT564830 مجم / مل في زيت الذرة المعقم ، ويفضل أن يكون التخزين الطازج أو قصير المدى في -20 درجة ؛ C ، حاملات
Tissue-Tek 24-Slide الحساسة للضوء بمقبض قابل للفصلSakura4465
Tissue-Tek & nbsp ؛ أكيو-إيدج  شفرات منخفضةالأنظار Sakura4689
Tissue-Tek  طقم تلطيخ منزلق يدويساكورا4451
طبق تلطيخ مناديل تيك ، أخضر مع غطاءساكورا4456
طبق تلطيخ مناديل تيك ، أبيض مع غطاءساكورا4457
توين 20ميليبور سيجماP7949
كاسيت معالجة يونيسيتVWR87002-292-VWR
غطاء مايكروVWR48393-081
زيلينفيشر العلميX5P-1GAL
1188128012-5-Ethynyl-2 K C10618H للصدأ نظارات

المراجع

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithel....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تجدد الأمعاءالتشعيع بغاماالخلايا الجذعية المعويةتتبع السلالةنموذج الإصابة الإشعاعيةالخلايا الجذعية الاحتياطيةخبيئات الأمعاءصبغ EdUصبغ TUNELتسلسل الخلية الواحدة