الجهاز الهضمي هو واحد من أكثر الأعضاء حساسية للإصابة عند علاجات السرطان الإشعاعية. إنه في نفس الوقت نظام عضوي يتمتع بواحدة من أعلى قدرات التجدد بعد مثل هذه الإهانات. يصف البروتوكول المقدم طريقة فعالة لدراسة القدرة التجديدية للظهارة المعوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الجهاز الهضمي هو واحد من أكثر الأعضاء حساسية للإصابة عند علاجات السرطان الإشعاعية. إنه في نفس الوقت نظام عضوي يتمتع بواحدة من أعلى قدرات التجدد بعد مثل هذه الإهانات. يصف البروتوكول المقدم طريقة فعالة لدراسة القدرة التجديدية للظهارة المعوية.
تتكون ظهارة الأمعاء من طبقة واحدة من الخلايا ولكنها تحتوي على أنواع متعددة من الخلايا المتمايزة نهائيا ، والتي يتم إنشاؤها عن طريق الانتشار النشط للخلايا الجذعية المعوية الموجودة في الجزء السفلي من الخبايا المعوية. ومع ذلك ، خلال أحداث الإصابة المعوية الحادة ، تخضع هذه الخلايا الجذعية المعوية النشطة لموت الخلايا. تشعيع جاما هو علاج لسرطان القولون والمستقيم يستخدم على نطاق واسع ، والذي ، على الرغم من فعاليته العلاجية ، له تأثير جانبي يتمثل في استنفاد تجمع الخلايا الجذعية النشط. في الواقع ، يعاني المرضى في كثير من الأحيان من متلازمة الإشعاع المعدي المعوي أثناء خضوعهم للعلاج الإشعاعي ، ويرجع ذلك جزئيا إلى نضوب الخلايا الجذعية النشطة. يؤدي فقدان الخلايا الجذعية المعوية النشطة في الخبايا المعوية إلى تنشيط مجموعة من الخلايا الجذعية المعوية الاحتياطية الهادئة عادة ويؤدي إلى إلغاء تمايز الخلايا الأولية الإفرازية والخلايا المعوية. إن لم يكن لهذه الخلايا ، فإن ظهارة الأمعاء ستفتقر إلى القدرة على التعافي من العلاج الإشعاعي وغيرها من الإهانات الأنسجة الرئيسية. تسمح التطورات الجديدة في تقنيات تتبع النسب بتتبع تنشيط الخلايا وتمايزها وهجرتها أثناء التجديد وقد تم استخدامها بنجاح لدراسة ذلك في القناة الهضمية. تهدف هذه الدراسة إلى تصوير طريقة لتحليل الخلايا داخل ظهارة الأمعاء للفأر بعد الإصابة الإشعاعية.
ستغطي ظهارة الأمعاء البشرية سطح نصف ملعب كرة الريشة تقريبا إذا تم وضعها بشكل مسطح تماما1. بدلا من ذلك ، يتم ضغط طبقة الخلية المفردة هذه التي تفصل البشر عن محتويات أمعائهم في سلسلة من الإسقاطات الشبيهة بالأصابع ، والزغابات ، والمسافات البادئة ، وهي خبايا تزيد من مساحة سطح الأمعاء. تتمايز خلايا الظهارة على طول محور الزغابات المشفرة. تتكون الزغابات بشكل أساسي من الخلايا المعوية الممتصة للمغذيات ، والخلايا الكأسية المفرزة للمخاط ، وخلايا الغدد الصماء المعوية المنتجة للهرمونات ، بينما تتكون الخبايا بشكل أساسي من خلايا بانيث المنتجة للدفاع ، والخلايا الجذعية النشطة والاحتياطية ، والخلايا السلفية2،3....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم إيواء جميع الفئران في قسم الموارد الحيوانية المختبرية (DLAR) في جامعة ستوني بروك. وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان بجامعة ستوني بروك (IACUC) على جميع الدراسات والإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية. أجريت التجارب التي شملت مواضيع حيوانية بدقة وفقا لبروتوكول التعامل مع الحيوانات المعتمد (IACUC # 245094).
ملاحظة: تم الحصول على سلالات الماوس B6 ؛ 129-Bmi1 tm1 (cre / ERT) Mrc / J (Bmi1-Cre ER) و B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sortm1 (EYFP) Cos / J (Rosa26eYFP) تجاريا (انظر جدول المواد) وتم عبورها للحصول على Bmi1-Cre ER ؛ Rosa2....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يسمح استخدام تشعيع الجسم الكلي 12 جراي (TBI) بالاشتراك مع تتبع النسب الوراثية للفئران بإجراء تحليل شامل لعواقب الإصابة الإشعاعية في الأمعاء. للبدء ، Bmi1-CreER ؛ تلقت فئران Rosa26eYFP حقنة واحدة من عقار تاموكسيفين ، مما يؤدي إلى تعزيز تعبير البروتين الفلوري الأصفر (EYFP) داخل مجموعة الخلايا الجذعية الاحتياطية Bmi1 + . بعد يومين من حقن عقار تاموكسيفين ، خضعت الفئران للإشعاع أو التشعيع الوهمي. قبل ثلاث ساعات من القتل الرحيم ، تم حقن الفئران ب EdU. بعد القتل الرحيم ، تم جمع عينات ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يصف هذا البروتوكول نموذجا قويا وقابلا للتكرار للإصابة الإشعاعية. يسمح بالتحليل الدقيق للتغيرات في ظهارة الأمعاء على مدار 7 أيام بعد الإصابة. الأهم من ذلك ، أن النقاط الزمنية المختارة تعكس المراحل الحاسمة من الإصابة وتتميز بتغيرات مميزة في الأمعاء (الإصابة ، موت الخلايا المبرمج ، التجديد ، ومراحل التطبيع)60. تم إنشاء هذا النموذج من التشعيع وتقييمه بعناية ، مما يدل على مظهر مناسب للإصابة لتقليد تلك التي يعاني منها المرضى الذين يخضعون للعلاج الإشعاعي61. يخضع أكثر من نصف مرضى س.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
يرغب المؤلفون في الاعتراف بمركز أبحاث الأنسجة في مركز ستوني بروك للسرطان للحصول على مساعدة الخبراء في إعداد عينات الأنسجة وقسم الموارد الحيوانية المختبرية في جامعة ستوني بروك للمساعدة في رعاية الحيوانات والتعامل معها. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة DK124342 الممنوحة ل Agnieszka B. Bialkowska و DK052230 للدكتور فنسنت دبليو يانغ.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 مل حقنة | BD | ||
| 309659-16G إبر تغذية الصغيرة القابلة لإعادة الاستخدام: مستقيم | VWR | 20068-630-27G | |
| × 1/2 "إبرة | BD | ||
| 305109-28G × 1/2 "Monoject 1 مل حقنة الأنسولين | Covidien | ||
| & Prime ؛ -deoxyuridine (EdU) | سانتا كروز التكنولوجيا | الحيويةsc284628A | 10 مجم / مل في DMSO المعقم: الماء (1: 4 V / V) ، aliquot وتخزينه في -20 درجة ؛ ج |
| عازر العلمية 10٪ محايد مخزن الفورمالين | فيشر Scientific | 22-026-213-B6.129X1-GT | |
| (ROSA) 26Sortm1 (EYFP) Cos / J | سلالة مختبر جاكسون | #: 006148 | |
| B6 ؛ 129-Bmi1tm1 (cre / ERT) Mrc / J | سلالة مختبر جاكسون | #: 010531 | |
| مصل الأبقار الألبومين الجزئي V ، صدمة حرارية | Millipore-Sigma | 3116956001 | |
| الدجاج المضاد ل GFP | Aves | GFP-1020 | |
| Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 مجموعة التصوير ، Invitrogen | Thermo Fisher Scientific | C10638-زيت | |
| الذرة | Millipore-Sigma | C8267-Decloaking | |
| Chamber | Biocare Medical | DC2012-ثنائي | |
| ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | كواشف فيشر الحيوية | BP231-100 | |
| بروتيناز خال من DNase حساس | للضوء | Invitrogen | مخفف 25x في DPBS |
| Donkey Anti Chicken AF647 | Jackson ImmunoResearch | 703-605-155 | |
| DPBS | Fisher Scientific | 21-031-CV-Eosin | |
| Fisher Scientific | S176 | ||
| مجهر مضان نيكون Eclipse 90i ضوء ساطع وذو انزال ، مع الأهداف: 10X ، 20X | نيكون | ||
| Fluoromount تركيب مائي متوسط | Millipore-Sigma | F4680-25ML | |
| Gamma Cell 40 Exactor | Best Theratronics Ltd. | - | 0.759 Gy دقيقة -1< / sup> |
| الماعز المضادة للأرانب AF488 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| محلول الهيماتوكسيلين ، الخياشيم رقم 3 | Millipore-Sigma | GHS332 | |
| HM 325 Microtome الروتاري من Thermo Scientific | Fisher Scientific | 23-900-668 | |
| Hoechst 33258 ، Pentahydrate (bis-Benzimide) | Thermo Fisher Scientific | H3569 | التخفيف 1: 1000 |
| محلول بيروكسيد الهيدروجين ، ACS ، 29-32٪ ، الطيف الكيميائي | فيشر العلمي | 18-603-252-في | |
| الموقع للكشف عن موت الخلايا ، الفلورسين (Roche) | Millipore-Sigma | 11684795910 | |
| مانع السائل Super PAP PEN ، ميني | فيشر Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| كربونات الليثيوم (مسحوق / ACS معتمد) ، فيشر كيماويكال | فيشر ساينتفيك | L119-500 | 0.5 جم / 1 لتر dH2O |
| Luer-Lok حقنة معقمة ، للاستخدام مرة واحدة ، 10 مل | VWR | 89215-218-Methanol | |
| VWR | BDH1135-4LP | ||
| منتجات Pharmco ؛ الكحول الإيثيلي ، 200 PROOF | فيشر Scientific | ||
| NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT حمض الخليك ACS الصف | Capitol Scientific | AAP-281000ACSCSLT-Rabbit | |
| anti-Ki67 | BioCare Medical | CRM325 | |
| ريتشارد آلان Scientific Cytoseal XYL تصاعد متوسط | فيشر Scientific | 22-050-262 | |
| حاضنة الصناعات العلمية - جيني لشرائح الخبز عند 65 درجة | فيشر سيانتيفيك | 50-728-103 | |
| سترات الصوديوم ثنائي هيدرات | فيشر Scientific | S279-500 | |
| طقم تشريح الفولاذ المقاوم | VWR | 25640-002 | |
| Superfrost Plus شرائح صغيرة [الحجم: 25 × 75 × 1 مم] | VWR | & nbsp ؛ 48311-703 | |
| تاموكسيفين | Millipore-Sigma | T5648 | 30 مجم / مل في زيت الذرة المعقم ، ويفضل أن يكون التخزين الطازج أو قصير المدى في -20 درجة ؛ C ، حاملات |
| Tissue-Tek 24-Slide الحساسة للضوء بمقبض قابل للفصل | Sakura | 4465 | |
| Tissue-Tek & nbsp ؛ أكيو-إيدج شفرات منخفضة | الأنظار Sakura | 4689 | |
| Tissue-Tek طقم تلطيخ منزلق يدوي | ساكورا | 4451 | |
| طبق تلطيخ مناديل تيك ، أخضر مع غطاء | ساكورا | 4456 | |
| طبق تلطيخ مناديل تيك ، أبيض مع غطاء | ساكورا | 4457 | |
| توين 20 | ميليبور سيجما | P7949 | |
| كاسيت معالجة يونيسيت | VWR | 87002-292-VWR | |
| غطاء مايكرو | VWR | 48393-081 | |
| زيلين | فيشر العلمي | X5P-1GAL |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.