Method Article

تحليل ضعف انقباض القلب و Ca2+ عابر في الخلايا العضلية القوارض

DOI:

10.3791/64055

⸱

May 25th, 2022

 , 
1Department of Cardiac Surgery, Michigan Medicine, University of Michigan, Ann Arbor

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم مجموعة من البروتوكولات التي تصف قياس وظيفة الانقباض عن طريق الكشف عن طول القطعة العضلية جنبا إلى جنب مع قياس الكالسيوم (Ca2+) العابر في الخلايا العضلية للفئران المعزولة. كما يتم تضمين تطبيق هذا النهج للدراسات في النماذج الحيوانية لفشل القلب.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما يتم تحليل ضعف الانقباض و Ca2+ العابر على المستوى الخلوي كجزء من تقييم شامل للإصابة الناجمة عن القلب و / أو إعادة البناء. يستخدم أحد الأساليب لتقييم هذه التعديلات الوظيفية تقصير غير محمل وتحليلات عابرة Ca2+ في الخلايا العضلية القلبية الأولية للبالغين. لهذا النهج ، يتم عزل الخلايا العضلية البالغة عن طريق هضم الكولاجيناز ، وجعلها متسامحة مع Ca2+ ، ثم تلتصق بأغطية مغلفة باللامينين ، تليها سرعة كهربائية في وسائط خالية من المصل. يستخدم البروتوكول العام الخلايا العضلية القلبية للفئران البالغة ولكن يمكن تعديلها بسهولة للخلايا العضلية الأولية من الأنواع الأخرى. يمكن مقارنة التغيرات الوظيفية في الخلايا العضلية من القلوب المصابة بالخلايا العضلية الوهمية و / أو العلاجات العلاجية في المختبر . تتضمن المنهجية العناصر الأساسية اللازمة لسرعة الخلايا العضلية ، جنبا إلى جنب مع غرفة الخلية ومكونات المنصة. يتضمن البروتوكول التفصيلي لهذا النهج خطوات قياس التقصير غير المحمل عن طريق الكشف عن طول القطعة العضلية وعابرات Ca2+ الخلوية المقاسة بمؤشر القياس النسبي Fura-2 AM ، وكذلك لتحليل البيانات الأولية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما يتطلب تحليل وظيفة مضخة القلب مجموعة من الأساليب لاكتساب رؤية كافية ، خاصة بالنسبة للنماذج الحيوانية لفشل القلب (HF). يوفر تخطيط صدى القلب أو قياسات الدورة الدموية نظرة ثاقبة على الخلل الوظيفي القلبي في الجسم الحي 1 ، بينما غالبا ما يتم استخدام الأساليب في المختبر لتحديد ما إذا كان الخلل الوظيفي ينشأ عن التغيرات في الخيوط العضلية و / أو Ca2+ العابر المسؤول عن إثارة الاقتران ، أو جهد الفعل ، مع وظيفة انقباض (على سبيل المثال ، اقتران الإثارة والانكماش [E-C]). توفر الأساليب في المختبر أيضا فرصة لفحص الاستجابة الوظيفية للهرمونات العصبية ، والتغيرات الجينية التي يسببها النواقل ، بالإضافة إلى العوامل العلاجية المحتملة2 قبل متابعة استراتيجيات العلاج المكلفة و / أو الشاقة في الجسم الحي.

تتوفر عدة طرق للتحقيق في وظيفة الانقباض في المختبر ، بما في ذلك قياسات القوة في الترابيق السليم 3 أو الخلايا العضلية4 ، بالإضافة إلى التقصير غير المحمل و Ca2+ العابر في الخلاياالعضلية السليمة في وجود وغياب HF 5,6. يركز كل من هذه الأساليب على وظيفة انقباض الخلايا العضلية القلبية ، المسؤولة مباشرة عن وظيفة مضخة القلب 2,7. ومع ذلك ، غالبا ما يتم إجراء تحليل كل من الانكماش واقتران E-C معا عن طريق قياس تقصير طول العضلات و Ca 2+ عابرة في الخلايا العضلية البالغة المعزولة والمتسامحة مع Ca2+. يستخدم المختبر بروتوكولا منشورا مفصلا لعزل الخلايا العضلية من قلوب الفئران لهذه الخطوة8.

يساهم كل من Ca2+ العابر والخيوط العضلية في تقصير وإعادة إطالة الخلايا العضلية السليمة ويمكن أن يساهم في اختلال وظيفي مقلص 2,7. وبالتالي ، يوصى بهذا النهج عندما يتطلب التحليل الوظيفي في المختبر خلية عضلية سليمة تحتوي على آلات ركوب الدراجات Ca2+ بالإضافة إلى خيوط العضلات. على سبيل المثال ، الخلايا العضلية المعزولة السليمة مرغوبة لدراسة وظيفة الانقباض بعد تعديل الخيوط العضلية أو وظيفة ركوب الدراجات Ca2+ عبر نقل الجينات9. بالإضافة إلى ذلك ، يقترح نهج الخلايا العضلية السليمة لتحليل التأثير الوظيفي للهرمونات العصبية عند دراسة تأثير مسارات إشارات المصب الثاني و / أو الاستجابة للعوامل العلاجية2. غالبا ما يتم إجراء قياس بديل للقوة المعتمدة على الحمل في الخلايا العضلية المفردة بعد نفاذية الغشاء (أو السلخ) في درجات حرارة منخفضة (≤15 درجة مئوية) لإزالة المساهمة العابرة Ca2+ والتركيز على وظيفة الخيوط العضلية10. يعد قياس القوة المعتمدة على الحمل بالإضافة إلى Ca2+ العابرة في الخلايا العضلية السليمة أمرا نادرا إلى حد كبير بسبب التحدي المعقد والتقني للنهج11 ، خاصة عند الحاجة إلى إنتاجية أعلى ، مثل قياس الاستجابات لإشارات الهرمونات العصبية أو كشاشة للعوامل العلاجية. يتغلب تحليل التربيق القلبي على هذه التحديات التقنية ولكنه قد يتأثر أيضا بالخلايا غير العضلية والتليف و / أو إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية2. يتطلب كل نهج من الأساليب الموضحة أعلاه إعدادا يحتوي على خلايا عضلية بالغة لأن الخلايا العضلية الوليدية والخلايا العضلية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) لا تعبر بعد عن المكمل الكامل لبروتينات الخيوط العضلية البالغة وعادة ما تفتقر إلى مستوى تنظيم الخيوط العضلية الموجودة في الخلية العضلية البالغة على شكل قضيب2. حتى الآن ، تشير الأدلة في iPSCs إلى أن الانتقال الكامل إلى الأشكال المتساوية للبالغين يتجاوز أكثر من 134 يوما في الثقافة12.

بالنظر إلى تركيز هذه المجموعة على HF ، تتضمن البروتوكولات مناهج وتحليلات للتمييز بين وظيفة الانقباض في الخلايا العضلية السليمة الفاشلة مقابل الخلايا العضلية السليمة غير الفاشلة. يتم تقديم أمثلة تمثيلية من الخلايا العضلية للفئران التي تمت دراستها بعد 18-20 أسبوعا من التضيق فوق الكلوي ، الموصوف سابقا5،13. ثم يتم إجراء مقارنات مع الخلايا العضلية من الفئران المعالجة بالخداع.

يتم استخدام البروتوكول ومنصة التصوير الموصوفة هنا لتحليل ومراقبة التغيرات في التقصير و Ca2+ العابرة في الخلايا العضلية القلبية على شكل قضيب أثناء تطور HF. لهذا التحليل ، يتم طلاء الخلايا العضلية على شكل قضيب 2 × 104 Ca 2+ على شكل قضيب على أغطية زجاجية مطلية بالصفيحة مقاس 22 مم2 (CSs) ويتم زراعتها طوال الليل ، كما هو موضح سابقا8. يتم توفير المكونات المجمعة لمنصة التصوير هذه ، جنبا إلى جنب مع الوسائط والمخازن المؤقتة المستخدمة للتصوير الأمثل ، في جدول المواد. يتم أيضا توفير دليل لتحليل البيانات باستخدام برنامج والنتائج التمثيلية هنا. يتم تقسيم البروتوكول العام إلى أقسام فرعية منفصلة ، حيث تركز الأقسام الثلاثة الأولى على الخلايا العضلية للفئران المعزولة وتحليل البيانات ، تليها تجارب Ca2+ الخلوية العابرة وتحليل البيانات في الخلايا العضلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اتبعت الدراسات التي أجريت على القوارض سياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ميشيغان. في هذه الدراسة ، تم عزل الخلايا العضلية من الفئران Sprague-Dawley و F344BN البالغة من العمر 3-34 شهرا والتي تزن ≥ 200 جم5. تم استخدام كل من معدلات الذكور والإناث.

1. سرعة الخلايا العضلية لدراسات وظيفة انقباض

  1. اصنع وسائط جديدة قائمة على M199 لكل مجموعة من الخلايا العضلية المعزولة (جدول المواد). 1 يوم قبل السرعة ، لوحة 2 × 104 Ca 2+ - خلايا عضلية على شكل قضيب على 22 مم2 أغطية زجاجية مطلية باللامينين (CSs) ، كما هو موضح سابقا8.
  2. لتحضير الغرف ، انقع كل غرفة في مبيض 10٪ لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، اغسل الغرف بماء الصنبور الجاري لمدة 30-45 دقيقة ، متبوعا بالماء المقطر الذي يتم استبداله كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة ، يليه الماء منزوع الأيونات الذي يتم استبداله كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة ، والشطف النهائي بالماء منزوع الأيونات.
  3. جفف الغرف على سطح نظيف لمدة 20-30 دقيقة (الشكل التكميلي 1A-C). بعد ذلك ، عالج الأشعة فوق البنفسجية الغرف في خزانة السلامة الحيوية لمدة 5 دقائق في كل اتجاه (المجموع = 20 دقيقة). ليست هناك حاجة لهذه الخطوة للغرف المعقمة مسبقا.
    تنبيه: اترك المنطقة لتقليل التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
  4. قم بإزالة الغطاء من الغرفة ، وأضف 3 مل من الوسائط القائمة على M199 (انظر جدول المواد) إلى كل بئر (الشكل التكميلي 1B) ، واستبدل الغطاء ، وقم بتسخين الغرفة مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 20٪ O2.
  5. تعقيم ملقط في معقم حبة ساخنة على حرارة 250 درجة مئوية لمدة 20-25 ثانية. انقل غرفة التحفيز المسخنة مسبقا من الحاضنة إلى خزانة السلامة البيولوجية.
  6. انقل كل غطاء (CS) يحتوي على خلايا عضلية قلبية إلى آبار فردية في غرفة التحفيز باستخدام ملقط معقم. انقل CSs أربعة في كل مرة ، متبوعا بالتسخين لمدة 10 دقائق قبل نقل CSs الأربعة المتبقية للحفاظ على درجة حرارة الوسائط.
  7. قم بتوصيل رافعات الموز بغرفة التحفيز من أحد طرفيها (الشكل التكميلي 1C) وبالمحفز على الطرف الآخر (الشكل التكميلي 1D).
  8. اضبط تردد المحفز على 0.2 هرتز واضبط الجهد (~ 12 فولت) لتحقيق الانكماش في ~ 10٪ -20٪ من جميع الخلايا العضلية القلبية على شكل قضيب داخل البئر. لتحديد عدد الخلايا العضلية المتعاقدة، ضع الغرفة تحت مجهر مقلوب مع تكبير من 4x إلى 10x.
  9. ضع غرفة التحفيز في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 (الشكل التكميلي 1E). قم بتغيير الوسائط كل 12 ساعة باستخدام وسائط مسخنة مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20-25 دقيقة. استمر في التحفيز الكهربائي لمدة تصل إلى 3 أيام مع تغيير الوسائط كل 12 ساعة.

2. تحليل وظيفة انقباض الخلايا العضلية القلبية الفئران البالغة

  1. سخن عبوة جل ووسائط في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل التجربة.
  2. قم بتشغيل مكونات منصة وظيفة الانقباض المدرجة في جدول المواد والموضحة في الشكل التكميلي 2 ، مع إيلاء اهتمام خاص للمكونات الرئيسية ، والتي تشمل جدولا مضادا للاهتزاز (الشكل التكميلي 2A-1) مع مجهر مقلوب مع مرشح أحمر غامق (590 نانومتر) (الشكل التكميلي 2A-2,3) وكاميرا CCD (الشكل التكميلي 2A-4) متصلة بوحدة تحكم CCD (الشكل التكميلي 2A-5 و الشكل التكميلي 2C-5) ومتكامل مع جهاز كمبيوتر (الشكل التكميلي 2B-14).
  3. تجميع الأنابيب في المضخة التمعجية (الشكل التكميلي 2A-8 ؛ الشكل التكميلي 2A-8) ، انقل عبوة الجل المسخنة مسبقا إلى حامل الأنبوب (الشكل التكميلي 2A-9) ، وقم بتشغيل الفراغ (الشكل التكميلي 2A-11) والطاقة إلى محفز الخلية (الشكل التكميلي 2B-13).
  4. ضع أنبوبا سعة 50 مل مع وسائط في حامل الأنبوب المعزول (الشكل التكميلي 2A-9) وابدأ التروية عند ~ 0.5 مل / دقيقة من خلال أنبوب المضخة التمعجية (الشكل التكميلي 2E-8).
  5. أضف كمية صغيرة من الوسائط المسخنة مسبقا إلى قارب وزن صغير (~ 2 مل). انقل CS واحدا يحتوي على خلايا عضلية من غرفة التحفيز إلى قارب الوزن. أعد غرفة التحفيز إلى 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
  6. قم بإزالة CS من وعاء الوزن وامسح الجانب السفلي برفق. انقل CS إلى غرفة CS مدهونة حديثا (الشكل التكميلي 2A ، F-10 ؛ السهم الأسود) وأضف قطرة من الوسائط برفق (~ 200 ميكرولتر) إلى CS.
  7. ضع حامل قطب كهربائي بلاتيني فوق CS (الشكل التكميلي 2F ؛ سهم رمادي) وضع CS جديدا فوق الجزء العلوي باستخدام ملقط. ضع حاملا علويا (الشكل التكميلي 2F ؛ السهم الأبيض) فوق شطيرة CS ثم قم بتثبيت اثنين أو أربعة مسامير # 0 ذات رأس عموم لإنهاء تجميع الغرفة.
  8. بمجرد وجود الوسائط في جميع أنحاء أنبوب المضخة ، قم بتوصيل الأنبوب بالتسخين المسبق ، ثم قم بتوصيل التسخين الأولي بغرفة CS المجمعة في الخطوة 2.7. ابدأ التروية بمعدل 0.5 مل / دقيقة وضع منديل منديل أسفل الحجرة للتأكد من عدم وجود تسرب.
  9. ضع حجرة CS في محول المسرح. يتم جمع الوسائط المتدفقة في الطرف الآخر من الغرفة مع أنابيب متصلة بنظام فراغ. قم بتشغيل نظام التسخين (الشكل التكميلي 2A ، D-7) وقم بموازنة الغرفة والهدف والتسخين المسبق لمدة ~ 5-10 دقائق لتحقيق درجة حرارة وسائط ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية. تصور الخلايا العضلية مع هدف الغمر في الماء 40x على المجهر خلال وقت التوازن هذا.
  10. قم بتنشيط محفز السرعة (الشكل التكميلي 2B-13) عن طريق ضبط الجهد على 1.5x الإعداد اللازم لتقلص 80٪ من الخلايا على شكل قضيب ، والتي عادة ما تكون 35-40 فولت. اضبط تردد التحفيز على 0.2 هرتز لتحسين وظيفة الانقباض وبقاء الخلايا العضلية.
  11. جمع آثار تقصير مقلص وإعادة إطالة من الخلايا العضلية المنتشرة والمتقلبة باستمرار. لجمع قياسات التقصير ، استخدم كاميرا CCD (الشكل التكميلي 2A-4) متصلة بوحدة تحكم CCD (الشكل التكميلي 2B-5 ، C) وجهاز كمبيوتر مخصص مع لوحة تحكم إدخال / إخراج (الشكل التكميلي 2B-14 ؛ انظر جدول المواد). تقيس المنصة تقصير القطعة العضلية في الخلايا العضلية للفئران ، على الرغم من الحصول على نتائج مماثلة من قياسات الخلايا العضلية التي تم جمعها من الحواف الطولية للخلايا العضلية (انظر Ecklerle et al.14).
  12. لجمع آثار تقصير القطعة العضلية، افتح البرنامج على الكمبيوتر، وحدد موافق، ثم قم بتقديم ملف > جديد. قم بإعداد قالب شاشة عن طريق تحديد عمليات التتبع > تحرير حدود المستخدم > طول القطعة العضلية ثم تعيين القيم القصوى والدنيا ، والتي تتراوح عادة بين 2.0 ميكرومتر و 1.5 ميكرومتر. قم بمعايرة كاميرا CCD ب 0.01 مم graticule قبل إجراء القياسات في الخلايا العضلية (الشكل 1D).
  13. لتسجيل آثار طول القطعة العضلية، اختر ملف > جديد. حدد الخلية العضلية المنقبضة وضع الخلية العضلية على طول المحور الطولي للكاميرا بحيث يكون نمط التشقق رأسيا (الشكل 1 ب).
  14. استخدم فأرة الكمبيوتر لوضع مربع منطقة الاهتمام (ROI) (المربع الوردي) فوق الخلية العضلية (الشكل 1C). حدد تجميع وابدأ لتسجيل وظيفة الانقباض. سجل تقصيرا لمدة 60 ثانية من كل خلية عضلية بترددات تحفيز منخفضة (≤0.5 هرتز).
  15. سجل تقصير القطعة العضلية من 5-10 خلايا لكل CS. قم بإجراء القياسات في 1 خلية / CS إذا كانت الدراسات تشمل العلاج بمنبهات / مضادات. قم بإعداد وسائط منفصلة مسبقة التسخين وقطعة مختلفة ومخصصة من أنابيب التروية المحملة في مضخة تمعجية متعددة القنوات واتبع الخطوات 2.9.-2.14. لقياس تأثير توصيل الدواء أو الهرمونات العصبية على وظيفة انقباض الخلايا العضلية.
  16. لقياس التقصير على نطاق من الترددات ، قم بتسريع الخلايا العضلية عند كل تردد للحصول على تقصير الحالة المستقرة قبل التسجيل5. بالنسبة لهذه الدراسات ، ضاعف معدل التروية وابدأ في تسجيل 15-20 ثانية بعد التحفيز بتردد جديد للحصول على استجابات انقباضية ثابتة الحالة للترددات في نطاق 0.2 هرتز و 2 هرتز. عادة ، لا تسجل أكثر من 2 خلية عضلية / CS للتقصير عبر نطاق معين من ترددات التحفيز.
  17. سجل ما لا يقل عن 7 انقباضات / خلية للحصول على بيانات موثوقة بمتوسط الإشارة عند تحليل التسجيلات (انظر الخطوة 3.).

3. تحليل بيانات وظيفة انقباض في الخلايا العضلية المعزولة

  1. للبدء، حدد ملف، واختر تتبعا مسجلا، ثم حدد فتح. حدد علامة التبويب 1 (الجانب الأيسر) من التتبع الأساسي ثم اضبط اللوحة الصفراء في أعلى التتبع على Sarc-Length. حدد عمليات التتبع وقالب الشاشة المعد في الخطوة 2.12.
  2. لإعداد قالب تحليل، حدد العمليات، خيارات التحليل العابر الأحادي، علامة حدث TTL في المربع تعريف t0، بالإضافة إلى الخيارات التالية من القائمة: خط الأساس (طول القطعة العضلية أثناء الراحة) ، سرعة المغادرة بالنسبة إلى t0 (dep v) ، الذروة (ارتفاع الذروة و٪ ارتفاع الذروة / خط الأساس أو bl٪ الذروة h) ، سرعة العودة بالنسبة إلى tPeak (ret v) ، الوقت إلى الذروة 50٪ (TTP 50٪) باستخدام t0 ، والوقت إلى خط الأساس 50٪ (TTR50٪) باستخدام tPeak. احفظ خيارات التحليل هذه عن طريق تحديد القوالب > حفظ قالب التحليل بمعرف. قم بتحميل قالب التحليل هذا قبل تحليل كل تتبع.
  3. لبدء تحليل البيانات، حدد العلامات > البوابة > إضافة > عابرة تحويل من علامة الحدث > نطاق التحليل. الآن اضبط النطاق الزمني من -0.01 ثانية إلى 1.20 ثانية للخلايا العضلية التي تسير بسرعة 0.2 هرتز (الشكل 2 أ ، علامات حمراء على الجزء السفلي من التتبع الخام). حدد نطاقا زمنيا أقصر للخلايا العضلية المحفزة بترددات أعلى.
  4. قم بإنشاء تتبع متوسط الإشارة عن طريق تحديد العمليات > متوسط الأحداث. يظهر تسجيل متوسط الإشارة أسفل تتبع القاعدة الأصلي.
  5. حدد علامة التبويب 1 من تتبع متوسط الإشارة (الجانب الأيسر من الشاشة)، ثم حدد علامات في القائمة العلوية، متبوعة بإضافة عابر. حدد العمليات من القائمة العلوية والتحليل العابر الأحادي لعرض القيم المتوسطة للإشارة لطول القطعة العضلية الأساسية وارتفاع الذروة و bl٪ peak h و dep v و ret v و TTP50٪ و TTR50٪ في لوحة العرض ذات متوسط الإشارة.
  6. انقل كل تحليل عابر للقطعة العضلية إلى جدول بيانات للتحليل المركب للخلايا العضلية المتعددة عن طريق تحديد تصدير > تحليل عابر أحادي > تيار الحافظة. الصق هذه البيانات في جدول البيانات لكل تتبع.
  7. لنسخ تتبع متوسط الإشارة، حدد تصدير > التتبع الحالي > خيارات الحافظة > واضبط المنازل العشرية على 5، ثم حدد محدد علامات الجدولة، وانقر فوق موافق وموافق. الصق آثار متوسط الإشارة لكل تسجيل خلية عضلية في جدول بيانات ثان.

4. تسجيل Ca2+ عابرين في الخلايا العضلية القلبية البالغة للفئران

  1. قبل قياس Ca2+ العابرين ، قم بتشغيل مكونات النظام الأساسي الموضحة في الخطوة 2.2 ، جنبا إلى جنب مع مكونات التصوير الفلوري الإضافية (انظر المكونات الإضافية لتحليل التصوير Ca2 + في جدول المواد ؛ الشكل التكميلي 2A-5,6 ؛ 2B-12).
  2. تحضير محلول مخزون Fura-2AM يحتوي على 1 mM Fura-2AM بالإضافة إلى 0.5 M بروبينسيد في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يقلل Probenecid من تسرب Fura-2AM15.
  3. قم بتخفيف محلول المخزون إلى 5 ميكرومتر Fura-2AM و 2.5 mM probenecid في 2.5 مل من الوسائط (انظر جدول المواد) في بئر واحد من لوحة 6 آبار. أضف وسائط سعة 2.5 مل وحدها (بدون Fura-2AM) إلى ثلاثة آبار إضافية في اللوحة ، وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم ، وقم بتسخين الوسائط مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
  4. انقل CS الذي يحتوي على الخلايا العضلية من غرفة السرعة إلى البئر الذي يحتوي على Fura-2AM ، وقم بتغطيته ، وأعد اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 4 دقائق. قم بتركيب الأنابيب في مضخة التروية واستخدمها مع الوسائط أثناء فترة تحميل Fura-2AM ، كما هو موضح في الخطوة 2.4.
  5. قم بإيقاف تشغيل أو تقليل مصابيح الغرفة لتقليل التبييض الضوئي الفلوري ولتحسين إشارة التألق. قم بإزالة اللوحة المكونة من 6 آبار من الحاضنة ، ثم اغسل CS لمدة 10 ثوان في كل من الآبار الثلاثة التي تحتوي على وسائط وحدها. انقل CS إلى قارب وزن صغير يحتوي على وسائط مسبقة التسخين (بدون إضافة Fura-2AM).
  6. قم بتركيب CS على حجرة CS مدهونة حديثا بعد مسح الجانب السفلي من CS برفق. أضف قطرة من الوسائط برفق إلى CS ، ثم قم بتجميع حامل القطب فوق CS ، متبوعا ب CS ثان والحامل العلوي. استخدم مسامير #0 ذات الرأس لإنهاء تجميع حجرة الخلية ، كما هو موضح في الخطوات 2.6.-2.7.
  7. قم بتوصيل أنبوب المضخة المملوء بالوسائط بالتسخين الأولي ، وقم بتوصيل التسخين الأولي بحجرة CS ، وضعه في محول مرحلة ، كما هو موضح في الخطوة 2.8. اجمع الوسائط باستخدام نظام الأنابيب المفرغة وقم بتشغيل نظام التسخين (الشكل التكميلي 2A ، D-7) لموازنة الغرفة إلى 37 درجة مئوية ، كما هو موضح في الخطوات 2.8.-2.9.
  8. قم بتنشيط محفز السرعة (الشكل التكميلي 2B-13) المضبوط على 35-40 فولت و 0.2 هرتز ، كما هو موضح في الخطوة 2.10.
  9. قبل تسجيل Ca2+ عابر ، قم بتشغيل مصباح يدوي صغير أو مصباح كتب مثبت بالقرب من لوحة مفاتيح الكمبيوتر للمساعدة في رؤية لوحة المفاتيح. بالإضافة إلى ذلك ، سجل خلفية مضان في منطقة خالية من الخلايا العضلية القلبية. للبدء، حدد ملف > ابدأ > جديد، كما هو موضح في الخطوة 2.12.
  10. حدد عائد استثمار، وقم بتعيين علامة تبويب واحدة (أو شريط تتبع، الجانب الأيسر) للبسط الأولي وعلامة تبويب ثانية للمقام الخام، محددة في أعلى منتصف كل علامة تبويب. سجل الخلفية لمدة 10-20 ثانية. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس واسحب فوق لوحة شريط تتبع واحدة للحصول على قيم البسط والمقام بمتوسط الإشارة الأولية. أدخل هذه القيم عن طريق تحديد العمليات > الثوابت، وأدخل القيم الأولية.
  11. قم بإعداد قالب شاشة جديد لجمع كل من التقصير و Ca2+ العابرين. بالنسبة لطول القطعة العضلية، حدد علامة التبويب 1 واستخدم العملية نفسها الموضحة في الخطوة 2.13. بالنسبة للتصوير ب Ca2+ ، حدد نسبة > Tab 2 (أعلى منتصف علامة التبويب) > عمليات التتبع > تحرير حدود المستخدم لتعيين الحد الأدنى والحد الأقصى لمستويات النسبة، والتي يتم تعيينها عادة بين 1 و5. استخدم نفس العملية لتحديد نطاقات البسط والمقام لعلامات التبويب 3 و 4 (الجانب الأيسر).
  12. ضع مربع عائد استثمار فوق صورة خلية عضلية، كما هو موضح في الخطوة 2.14. حدد ملف > تجميع > جديد. الآن حدد ابدأ لجمع بيانات Ca2+ القصيرة والتناسبية. سجل ≥7 انقباضات / خلية لتحليل متوسط الإشارة.
  13. كرر تسجيل تتبع الخلفية الموضح في الخطوة 4.10. بعد تسجيل 2-4 خلايا عضلية. عادة ، سجل 4-5 خلايا عضلية / CS أو عدد أقل من الخلايا العضلية إذا كانت هناك تغييرات كبيرة في قراءة الخلفية.

5. تحليل بيانات Ca2+ العابرين في الخلايا العضلية المعزولة.

  1. افتح الملف المطلوب للتحليل وحدد قوالب > قالب الشاشة للتقصير بالإضافة إلى Ca2+ العابرين. بعد ذلك ، حدد علامات التبويب 1 و 2 (يسار) لإظهار طول القطعة العضلية ونسبة Ca2+ ، على التوالي. حدد العمليات > الثوابت وأدخل قيم البسط والمقام من تتبع الخلفية Ca2+ .
  2. قم بإعداد قوالب التحليل لتقصير البيانات العابرة بالإضافة إلى Ca2+ . حدد علامة التبويب 1 (الجانب الأيسر) واستخدم نفس العملية كما هو موضح في الخطوة 3.2. لتعيين قالب تحليل طول القطعة العضلية.
  3. حدد علامة التبويب 2 (الجانب الأيسر)، وحدد العمليات، وخيارات التحليل العابر الأحادي، وعلامة الحدث TTL في المربع تعريف t0، والخيارات التالية من القائمة: خط الأساس (النسبة الأساسية)، سرعة المغادرة بالنسبة إلى t0 (dep v)، الذروة (ارتفاع الذروة و٪ ارتفاع الذروة / خط الأساس أو bl٪ الذروة h) ، سرعة الاضمحلال بالنسبة إلى tPeak (ret v) ، الوقت إلى الذروة 50٪ (TTP 50٪) باستخدام t0 ، والوقت إلى خط الأساس 50٪ (TTR50٪) باستخدام tPeak. احفظ خيارات التحليل هذه عن طريق تحديد القوالب وحفظ قالب التحليل باستخدام اسم معرف جديد. قم بتحميل قالب التحليل هذا قبل تحليل كل تتبع.
  4. استخدم نفس العملية كما هو موضح في الخطوات 3.3.-3.6. لحساب متوسط الإشارة ثم تحليل طول القطعة العضلية، متبوعا بنفس الخطوات لعابري Ca2+ . ضع علامات منفصلة لطول القطعة العضلية ولتتبع النسبة العابرة Ca2+ .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إجراء دراسات وظيفة انقباض على الخلايا العضلية الفئران بدءا من اليوم التالي للعزل (اليوم 2) حتى 4 أيام بعد العزلة. على الرغم من أنه يمكن تسجيل الخلايا العضلية في اليوم التالي للعزل (أي اليوم 2) ، إلا أن أوقات الاستزراع الأطول غالبا ما تكون مطلوبة بعد نقل الجينات أو العلاجات لتعديل وظيفة الانقباض8. بالنسبة للخلايا العضلية المستزرعة لأكثر من 18 ساعة بعد العزل ، يساعد بروتوكول السرعة الموصوف في القسم 1 في الحفاظ على الأنابيب التائية ونتائج التقصير وإعادة الإطالة المتسقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعمل بروتوكول السرعة المزمن الموضح في الخطوة 1 على إطالة الوقت المفيد لدراسة الخلايا العضلية المعزولة وتقييم تأثير العلاجات الأطول. في مختبرنا ، تم الحصول على نتائج متسقة تصل إلى 4 أيام بعد العزل عند قياس وظيفة الانقباض باستخدام طول القطعة العضلية على الخلايا العضلية ذات الخطى المزمنة. ومع ذلك ، تتدهور وظيفة انقباض الخلايا العضلية بسرعة عند استخدام الوسائط التي يزيد عمرها عن 1 أسبوع لتسريع الخلايا العضلية.

بالنسبة لدراسات وظيفة الانقباض ، يتم جمع البيانات عند 37 درجة مئوية ، وهي قريبة من درجة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 HL144777 (MVW).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي> الوسائط < / قوي >
ألبومين مصل الأبقارسيجما (روش)3117057001التركيز النهائي = 0.2٪ (وزن / حجم)
الجلوتاثيونسيجماG-6529التركيز النهائي = 10 ملي مولار
HEPESSigmaH-7006التركيز النهائي = 15 ملي
M199سيجماM-2520زجاجة واحدة تصنع 1 لتر ؛ الرقم الهيدروجيني 7.45
NaHCO3< / sub>SigmaS-8875التركيز النهائي = 4 ملي مولار
البنسلين / الستربتومايسينفيشر15140122التركيز النهائي = 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 مو ؛ جم / مل من الستربتومايسين
< قوي > الكواشف خصيصا ل Ca2 + < / SUP > التصوير < / قوي >
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما & nbsp ؛D2650
Fura-2AMInvitrogen (المجسات الجزيئية)F122150 & ز / قارورة.   تحضير محلول مخزون 1 ملي مولار Fura-2AM + 0.5 M المحترف في DMSO ؛   التركيز النهائي Fura2-AM في وسائل الإعلام هو   5 & مو M
ProbenicidInvitrogen (فيشر)P36400أضف 7.2 ملغ محترف (0.5 م) إلى 1 ملي مولار من مخزون Fura-2AM ؛ التركيز النهائي في الوسائط هو 2.5 ملم
< قوي > مواد لسرعة الخلايا العضلية للفئران < / قوي >
# 1 22 &NBSP ؛ مم < sup > 2 < / sup> أغطية زجاجية Corning2845-22
3 × 36 بوصة مع مقابس الموزPomona ElectronicsB-36-2الشكل التكميلي 1 ، اللوحة C
37oC حاضنة  مع 95٪ O2:5٪ CO2 Forma3110الشكل التكميلي 1 ، اللوحة E. & nbsp ؛ نماذج متعددة مناسبة
من الفئة الثانية A / B3 خزانة السلامة الحيوية مع مصباح الأشعة فوق البنفسجيةForma1286نماذج متعددة مناسبة
ملقط - Dumont # 5 5/45أدوات العلوم الدقيقة11251-35
معقم الخرز الساخنأدوات العلوم الدقيقة1800-45
مجهر مقلوب منخفض التكبيرLeicaDM-IL & nbsp ؛ضع هذا المجهر بجوار الحاضنة لمراقبة الخلايا العضلية التي يسير بخطى سريعة للانقباض في بداية السرعة وبعد تغيرات الوسائط ؛   ؛ 4X و 10X الأهداف الموصى
غرفة السرعةالمخصصةالشكل 1 ، اللوحة أ. نظام Ionoptix C-pace هو بديل متاح تجاريا أو انظر 22< / sup>
StimulatorIonoptixMyopacerSupplemental الشكل 1 ، اللوحة D.
<مواد قوية > لوظيفة الانقباض و / أو Ca2 + < / sup> تحليل التصوير < / strong>ID في الشكل التكميلي 2 & البدائل / الخيارات الموصى بها
مكونات إضافية ل Ca2 + < / sup> تحليل التصويرIonoptixمكونات النظام الأساسية: - نظام عد الفوتون   ؛                     --  مصدر طاقة زينون مع مصدر ضوء الإثارة المزدوج                       --  واجهة الفلورة - يحتوي نظام عد الفوتون على أنبوب مضاعف ضوئي (PMT) ومرآة ثنائية اللون ويتم تثبيته بجوار كاميرا CCD  (لوحة A # 4).                                                                                                                                          - تم دمج مصدر الطاقة لمصدر ضوء لمبة الزينون (انظر اللوحة A # 5 واللوحة C ، على اليسار) مع واجهة إثارة مزدوجة (340/380 نانومتر & nbsp ؛ الإثارة وانبعاث 510 نانومتر) كما هو موضح في اللوحة A # 6.  ؛                                                                                                                                                                                                                                                               - واجهة التألق بين الكمبيوتر و   ؛ يظهر مصدر الضوء في اللوحة B ، # 12.
كاميرا CCD مع الحصول على الصور   الأجهزة والبرمجيات (240 إطارات / ثانية)Ionoptix Myocam مع وحدة تحكم CCD يتم عرض Myocam ووحدة التحكم CCD في الشكل التكميلي 2 ، اللوحة A # 4 & nbsp ؛ و   ؛ اللوحة A # 5 & لوحة C # 5 (يمين) ، على التوالي. تم دمج وحدة التحكم مع نظام كمبيوتر للكمبيوتر الشخصي (لوحة B # 14).                                                                                                                                                                                           
  محفز الغرفةIonoptix قصرالعضل ب ، # 13 ؛ البديل:  نموذج العشب S48
غرفة التروية المثبتة على Coverslipغرفة مخصصة لغطاء 22 مم < سوب > 2 < / sup > مع محول سيليكون و 2-4 براغي فيليبس عموم الرأس # 0   ؛ (السهم، اللوحة F)اللوحة A # 10 واللوحة F ؛     تتم معايرة درجة حرارة الغرفة إلى 37o< / sup>C باستخدام مسبار TH-10Km وجهاز التحكم في درجة الحرارة TC2BIP (انظر جهاز التحكم في درجة الحرارة).  البدائل التجارية:  Ionoptix FHD أو C-stim cell  الدوائر; نظام تحفيز ثقافة Cell MicroControls
كمبيوتر وبرامج مخصصة لجمع البيانات وتحليلها للوظيفة / Ca2 + عابرينIonoptixPC مع لوحة الكمبيوتر Ionwizardوالبرامج لوحة B ، # 14 ؛ يتم قياس وظيفة الانقباض باستخدام وحدات اكتساب SarcLen (طول الساركمير) أو SoftEdge (طول الخلايا العضلية) لبرنامج IonWizard. يتضمن برنامج Ionwizard أيضا برنامج اكتساب PMT لقياس النسبة  Ca2 + < / sup> التصوير في Fura-2AM-loaded myoyctes.
- يوصى باستخدام خزانة ورفوف إلكترونية ذات 4 أعمدة لإيواء جهاز التحكم في الحشرات ومحفز الخلية. توجد أيضا واجهة التألق للتصوير Ca2 + < / sup> في هذه الخزانة (انظر أدناه).
ملقط - Dumont # 5 TIأدوات العلوم الدقيقة11252-40لوحة F
حامل أنبوب معزول للوسائطلوحة مخصصةA # 9 ؛ يتم تجميع هذا الحامل بسهولة باستخدام الستايروفوم و حزمة جل مسخنة مسبقا للحفاظ على دفء الوسائط
مجهر المجال الساطع المقلوبنيكونTE-2000Sتركيب برج دوار للتألق epi (اللوحة A #2) للتصوير Ca2+.    يوصى أيضا باستخدام مرشح مكثف أحمر غامق (590 نانومتر) لتقليل التبييض الفلوري أثناء تصوير Ca2 + < / sup>.
طاولة عازلTMC التحكم في الاهتزاز30 × 36 بوصةلوحة A ، # 1 ؛ مرغوب فيه:  رفوف مرتفعة ، درع فاراداي   ؛  
العدسات المجهرية والهدفمن نيكون10X CFI العدسات 40X المياه CFI خطة الفلور الهدفلوحة A #3; 40X الهدف:  n.a. 0.08; w.d. 2mm.  يتم تركيب سخان موضوعي Cell MicroControls HLS-1 حول الهدف (انظر وحدة التحكم في درجة الحرارة أدناه).                 ملاحظة:  موزعات الغمر المائي متاحة الآن أيضا للأهداف القائمة على الماء.  
مضخة تمعجيةGilsonMinipuls 3Panel A # 8 ولوحة E
قارب وزن صغيرFisher & nbsp ؛08-732-112
تحكم في درجة الحرارةخلية MicroControlsTC2< / sup>BIPلوحة A # 7 ؛ اللوحة دال. يقوم جهاز التحكم في درجة الحرارة هذا بتسخين غرفة الغطاء إلى 37oC.      يوصى باستخدام جهاز التسخين المسبق والسخان الموضوعي لهذه المنصة. A خلية MicroControls HPRE2 التسخين المسبق و  يتم التحكم في سخان الهدف HLS-1   ؛ بواسطة وحدة التحكم في درجة الحرارة TC2< / sup>BIP لدراساتنا.
تحت ضوء LED للخزانة مع مستشعر الحركة   ؛سيلفانيا# 72423 ضوء LEDموصى به لجمع البيانات أثناء التصوير العابر Ca2 + < / sup> تحت الحد الأدنى من إضاءة الغرفة.   البديل:  مقطع على مصباح يدوي / ضوء كتاب برقبة مرنة - يتوفر العديد من الموردين.
خط فراغ مع قارورة Ehrlenmeyer في الخط وفلتر واقيأنابيب فيشرTygon - E363 ؛   قارورة البولي بروبيلين إيرلينماير - 10-182-50B ؛ مرشح فراغ - 09-703-90لوحة A # 11
بها التكميلية لوحة وحدة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reihle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
  2. Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
  3. Rossman, E. I., et al. Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).
  4. McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts. Frontiers in Physiology. 11, 468(2020).
  5. Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).
  6. Chaudhary, K. W., et al. Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).
  7. Walker, C. A., Spinale, F. G. The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).
  8. Lang, S. E., Westfall, M. V. Gene transfer into cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).
  9. Davis, J., et al. Designing heart performance by gene transfer. Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).
  10. Sweitzer, N. K., Moss, R. L. Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin. Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).
  11. Yasuda, S., et al. Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).
  12. Racca, A. W., et al. Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle. The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).
  13. Kim, E. H., et al. Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure. Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).
  14. Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e4237(2013).
  15. Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).
  16. Sakthivel, S., et al. In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).
  17. Qi, M., et al. Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy. The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).
  18. Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume. American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).
  19. Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).
  20. Zak, R. Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart. Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).
  21. Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats. Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac Contractile DysfunctionCalcium TransientsRodent MyocytesSarcomere ShorteningMyocyte IsolationCollagenase DigestionElectrical PacingFura 2 AMSarcomere Length DetectionHeart Failure Model

Related Articles