مقالة منهجية

نموذج العلاج المناعي التجريبي للورم الميلانيني باستخدام التطعيم ضد الورم باستخدام السيتوكين المكونة للدم

DOI:

10.3791/64082

⸱

فبراير 24, 2023

 ,  ,  , 
1La Jolla Institute for Immunology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم البروتوكول نموذجا للعلاج المناعي للسرطان باستخدام التطعيم ضد الورم القائم على الخلايا مع سرطان الجلد B16-F10 المعبر عن Flt3L. يوضح هذا البروتوكول الإجراءات ، بما في ذلك تحضير الخلايا السرطانية المستزرعة ، وزرع الورم ، وتشعيع الخلايا ، وقياس نمو الورم ، وعزل الخلايا المناعية داخل الورم ، وتحليل قياس التدفق الخلوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التيروزين كيناز 3 ليجند الشبيه ب Fms (Flt3L) هو سيتوكين مكون للدم يعزز بقاء وتمايز الخلايا المتغصنة (DCs). تم استخدامه في لقاحات الأورام لتنشيط المناعة الفطرية وتعزيز الاستجابات المضادة للأورام. يوضح هذا البروتوكول نموذجا علاجيا باستخدام لقاح الورم القائم على الخلايا الذي يتكون من خلايا الورم الميلانيني B16-F10 المعبرة عن Flt3L جنبا إلى جنب مع التحليل الظاهري والوظيفي للخلايا المناعية في البيئة المكروية للورم (TME). يتم وصف إجراءات تحضير الخلايا السرطانية المستزرعة ، وزرع الورم ، وتشعيع الخلايا ، وقياس حجم الورم ، وعزل الخلايا المناعية داخل الورم ، وتحليل قياس التدفق الخلوي. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير نموذج العلاج المناعي للورم الصلب قبل السريري ، ومنصة بحثية لدراسة العلاقة بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية المتسللة. يمكن دمج بروتوكول العلاج المناعي الموصوف هنا مع طرق علاجية أخرى ، مثل حصار نقاط التفتيش المناعية (الأجسام المضادة ل CTLA-4 ، والأجسام المضادة ل PD-1 ، والأجسام المضادة ل PD-L1) أو العلاج الكيميائي من أجل تحسين التأثير العلاجي للسرطان لسرطان الجلد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التعرف على العلاج المناعي للسرطان كاستراتيجية علاجية واعدة بناء على آثاره الجانبية الأقل سمية والاستجابات الأكثر ديمومة. تم تطوير عدة أنواع من العلاجات المناعية ، بما في ذلك علاجات فيروس الأورام ، ولقاحات السرطان ، وعلاجات السيتوكين ، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، ونقل الخلايا بالتبني (خلايا CAR-T أو CAR-NK) ، وحصار نقطة التفتيش المناعية1.

بالنسبة للقاحات السرطان ، هناك أشكال مختلفة من اللقاحات العلاجية ، مثل اللقاحات القائمة على الخلايا الكاملة ، ولقاحات البروتين أو الببتيد ، ولقاحات الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي. يعتمد التطعيم على قدرة الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) على معالجة مستضدات الورم ، بما في ذلك المستضدات الخاصة بالورم ، وتقديمها في شكل مناعي للخلايا التائية. من المعروف أن الخلايا المتغصنة (DCs) هي أقوى APCs ويعتقد أنها تلعب دورا مهما في المناعة المضادة للأورام 2,3. تمتص هذه الخلايا مستضدات الورم وتعالجها ، ثم تهاجر إلى الغدد الليمفاوية المستنزفة (dLN) لتجهيز وتنشيط خلايا المستجيب التائية الخاصة بالورم (Teff) من خلال إشراك مستقبلات الخلايا التائية (TCR) والجزيئات المكلفة. ينتج عن هذا تمايز وتوسع الخلايا التائية السامة للورم (CTL) ، والتي تتسلل إلى الورم وتقتل الخلايا السرطانية4. وبالتالي ، فإن تنشيط ونضج DCs يمثلان استراتيجيات جذابة لتحفيز المناعة ضد مستضدات الورم.

من المعروف أن Flt3L يعزز نضوج وتوسع DCs الناضجة وظيفيا التي تعبر عن بروتينات MHC من الفئة II و CD11c و DEC205 و CD865. ثبت أن الإدارة داخل الورم ، ولكن ليس عن طريق الوريد ، لناقل الفيروس الغدي الذي يتضمن جين Flt3L (Adv-Flt3L) تعزز النشاط العلاجي المناعي ضد أورام الخصية6. كما تم استخدام Flt3L في اللقاحات القائمة على الخلايا السرطانية التي تتكون من خلايا B16-F10 المشععة التي تعبر بثبات عن Flt3L المحول بالفيروسات القهقرية كوسيلة لتعزيز العرض المتقاطع لمستضدات الورم بواسطة DCs ، وبالتالي زيادة الاستجابات المضادة للأورام. يعتمد بروتوكول التطعيم ضد الورم B16-Flt3L الموصوف هنا على دراسة نشرتها مجموعة الدكتور جيمس أليسون7. في هذه الورقة ، أفادوا أن لقاح B16-Flt3L جنبا إلى جنب مع حصار CTLA-4 أدى بشكل تآزري إلى رفض سرطان الجلد الثابت ، مما أدى إلى زيادة البقاء على قيد الحياة.

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نموذج العلاج المناعي قبل السريري لسرطان الجلد. هنا ، يتم وصف الإجراءات التفصيلية لكيفية تحضير وزرع لقاحات الورم ، وكيفية تحليل تكوين ووظيفة الخلايا المناعية داخل الورم من الورم الصلب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحفاظ على جميع الفئران المستخدمة في الدراسة وإيوائها في حظيرة معهد لا جولا لعلم المناعة (LJI) في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض مع التحكم في درجة الحرارة والرطوبة. تم إجراء تجارب على الحيوانات مع إناث الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8-14 أسبوعا وفقا للإرشادات والبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوان LJI.

1. تحضير الخلايا السرطانية المستزرعة للزرع

  1. خلايا سرطان الجلد B16-F10 في وسط دولبيكو المعدل من Iscove (IMDM) يحتوي على 10٪ FBS المعطل بالحرارة ، و 2 mM الجلوتامين ، و 1 mM من بيروفات الصوديوم ، و 1 mM MEM من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 100 وحدة / مل من كل من البنسلين والستربتومايسين. الحفاظ على خط الخلية عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  2. البذور 1.5-2 × 106 خلايا B16-F10 في قارورة 175T وثقافة لمدة يومين. حصاد الخلايا عندما تكون 75٪ -80٪ متقاربة.
  3. قم بإزالة وسط الثقافة واغسل القارورة مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. نضح برنامج تلفزيوني وأضف 5 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA متبوعا بالنقر بقسوة على حافة قارورة الثقافة.
  4. أضف 15 مل من وسط الاستزراع لتحييد التربسين-EDTA وصب محتويات القارورة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. اغسل سطح الطبق ب 10 مل من PBS واسكبه في نفس الأنبوب سعة 50 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 200 × جم. تخلص من المادة الطافية وكسر حبيبات الخلية عن طريق النقر بالإصبع على قاع الأنبوب.
  6. أضف 10 مل باردة من PBS وقم بسحب تعليق الخلية برفق ؛ بعد ذلك ، عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم. الحفاظ على الخلايا على الجليد قبل الحقن.

2. زرع الورم

  1. تخدير الفئران بالغاز بنسبة 5٪ إيزوفلوران بمعدل تدفق غاز يبلغ 1.0 لتر في الدقيقة في غطاء الدخان. قم بتغيير معدل التدفق إلى جرعة الصيانة البالغة 2٪ إيزوفلوران بمجرد تخدير الفئران بالكامل. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم إجراء التخدير من قبل الطبيب البيطري باتباع إرشادات رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية.
  2. حلق الشعر على الجانب الأيسر من الفئران وتعقيم موقع الحقن باستخدام مناديل الكحول. داخل الأدمة (i.d.) زرع الخلايا السرطانية B16-F10 في 5 × 105 خلايا في 50 ميكرولتر من PBS الباردة في الجانب الأيسر باستخدام إبرة 30 G.
    ملاحظة: قد تحتاج إلى تعديل جرعة الخلايا السرطانية المزروعة B16-F10 في حدود 0.5-5 × 105 خلايا لتطوير الورم بنجاح.
  3. بعد الزرع ، قم بقياس طول الورم وعرضه ثلاث مرات في الأسبوع باستخدام الفرجار الرقمي الإلكتروني. احسب حجم الورم (مم3) باستخدام الصيغة:
    حجم الورم (مم3) = العرض2 × الطول × 0.5
    علاج الفئران بلقاح الورم عندما تصل الأورام إلى حجم ≥2 ملم.
    ملاحظة: يمكن قياس الأورام عادة في اليوم 3 بعد زرع 5 × 105 خلايا ورمية. لوحظ معدل نمو أسرع للورم B16-F10 في ذكور C57BL / 6 أو Rag1-/- أو Rag2-/-γc-/-الفئران. تم وصف ملاحظة مماثلة في دراسات أخرى8. يوصى بالحفاظ على اتساق جنس الفئران. ومع ذلك ، لاحظ أن المعاهد الوطنية للصحة تركز على الجنس كمتغير بيولوجي مهم في البحوث الطبية الحيوية.

3. تحضير اللقاح وحقن خلايا B16-F10 (B16-Flt3L) المعبرة عن Flt3L

  1. الحفاظ على خلايا B16-Flt3L في DMEM التي تحتوي على 8٪ FBS المعطل بالحرارة ، و 2 mM الجلوتامين ، و 100 وحدة / مل لكل من البنسلين والستربتومايسين عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  2. البذور 1 × 106 B16-Flt3L الخلايا في قارورة 175T وثقافة لمدة 2 أيام. حصاد الخلايا عندما تكون 75٪ -80٪ متقاربة كما هو موضح في الخطوات من 1.3 إلى 1.6 وتعليقها في 1 مل من PBS البارد.
  3. تشعيع الخلايا بجرعة 150 جراي من أشعة جاما باستخدام الأشعة السينية Irradiator مع إعداد معلمة 160 كيلو فولت و 25 مللي أمبير. عد وتحقق من صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ تريبان الأزرق قبل الحقن.
  4. تخدير الغاز الفئران كما هو موضح سابقا وتعقيم موقع الحقن باستخدام مناديل الكحول. حقن الفئران داخل الأدمة بخلايا B16-Flt3L المشععة 1 × 10 6 في 50 ميكرولتر من PBS البارد على نفس الجناح مثل زرع الورم الأصلي ، ~ 1 سم بعيدا عن موقع الورم الرئيسي في الأيام 3 و6 و 9 بعد زرع الخلية الأولي.
  5. ضع علامة على مواقع حقن اللقاح بقلم ملون لتمييزه عن الورم الرئيسي.
    ملاحظة: إذا تم زرع 0.5 × 105 خلايا B16-F10 في البداية ، فمن المستحسن إجراء علاج اللقاح في الأيام 8 و 11 و 14.

4. عزل الخلايا المناعية داخل الورم

  1. التضحية الفئران باستخدام CO2 وخلع عنق الرحم في غطاء الدخان في نهاية التجربة (في اليوم 15 بعد زرع الورم; الشكل 1).
  2. قم بإزالة الورم جراحيا مع الجلد من كل فأر ووضعه في لوحة 24 بئر مع 1 مل 10٪ FBS / RPMI-1640 المتوسطة. جفف الأورام باستخدام منشفة ورقية قبل وزنها.
  3. قطع الأورام إلى قطع صغيرة. أضف 2 مل من محلول الهضم (100 ميكروغرام / مل TL Liberase و 200 ميكروغرام / مل DNase I في وسط RPMI-1640) واحتضانه لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. أضف 10 مل من 10٪ FBS / RPMI-1640 متوسطة لوقف عملية الهضم. انقل الخلايا باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل واستخدم مكبس حقنة سعة 1 مل لطحن الأنسجة على مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
  5. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من وسط محدد التدرج بكثافة 40٪ في PBS ، مخفف إلى تركيز 1x).
  6. أضف معلق الخلية ببطء فوق 5 مل من وسط خاص بتدرج الكثافة بنسبة 80٪ يحتوي على PBS. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 325 × جم مع ضبط فرامل منخفض لمدة 23 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  7. بعد الطرد المركزي ، اجمع بعناية طبقة الكريات البيض عند الواجهة بين 40٪ و 80٪ وسط خاص بتدرج الكثافة ومررها عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. احتضان الحبيبات في 2 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) لمدة 5 دقائق في RT. بعد الحضانة ، أضف 10 مل من وسيط FBS / RPMI-1640 بنسبة 10٪ لإخماد مخزن تحلل كرات الدم الحمراء.
  9. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من وسيط FBS / RPMI-1640 بنسبة 10٪ واحسب العدد الإجمالي للخلايا قبل الاستخدام لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: اجمع الطحال أو dLN كعناصر تحكم لاستراتيجية بوابة مجموعات فرعية من الخلايا المناعية عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. اتبع طريقة عزل الخلية كما هو موضح أعلاه مع التغييرات التالية: استخدم مكبس حقنة سعة 1 مل لطحن الأنسجة على مرشح شبكي 70 ميكرومتر. اغسل المنديل بوسط FBS / RPMI-1640 بنسبة 10٪ للحصول على معلقات أحادية الخلية. Lyse RBC كما هو موضح.

5. تحليل التدفق الخلوي

ملاحظة: تحتوي الخلايا التي تم جمعها من طبقة الكريات البيض على خلايا مناعية وخلايا ورمية. يوصى باستخدام لوحين تلطيخ مستقلين.

  1. تلطيخ السطح
    1. انقل الخلايا إلى لوحة سفلية على شكل حرف V 96 بئرا. اغسل الخلايا باستخدام PBS وقم بتلطيخها بصبغة صلاحية الخلية (50-100 ميكرولتر / بئر) لمدة 15 دقيقة في RT.
    2. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتلطيخ علامات السطح بأجسام مضادة مختلطة (يتم توفير التخفيف التفصيلي في جدول المواد) في مخزن FACS المؤقت (1٪ FBS و 0.05٪ NaN3 في PBS) لمدة 30 دقيقة على الجليد (50-100 ميكرولتر / بئر).
    3. قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 500 × جم لمدة 5 دقائق واغسلها باستخدام مخزن FACS مرتين.
    4. ثبت الخلايا بمخزن مؤقت لتثبيت الخلايا (50-100 ميكرولتر / بئر) لمدة 35 دقيقة على الثلج. قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 500 × جم لمدة 5 دقائق واغسلها مرتين باستخدام مخزن FACS.
    5. قم بتخزين العينات في مخزن FACS (150-200 ميكرولتر / أنبوب) عند 4 درجات مئوية وحمايتها من الضوء. الحصول على العينات على مقياس التدفق الخلوي. بالنسبة لسكان الخلايا التائية والخلايا التائية ، اتبع استراتيجيات البوابات الواردة في الشكل 2B والشكل 3A.
      ملاحظة: لتلطيخ DCs النخاعية ، يوصى باحتضان حاصرات FC (الفئران المضادة للفأر CD16 / CD32) لمدة 15 دقيقة على الجليد قبل حضانة الأجسام المضادة السطحية (الخطوة 5.1.2).
  2. تحليل السيتوكين عند إعادة التحفيز خارج الجسم الحي
    1. قم بطلاء الخلايا في وسط كامل (RPMI-1640 مكمل ب 10٪ FBS ، 10 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.2-7.6 ، 0.1 mM من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 1 mM من بيروفات الصوديوم ، 100 وحدة / مل لكل من البنسلين والستربتومايسين ، 50 ميكرومتر 2-mercaptoethanol ، و 2 mM L-glutamine) وتحفيز مع 50 نانوغرام / مل من PMA بالإضافة إلى 1 ميكرومتر أيونوميسين في وجود مثبط نقل البروتين لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
    2. قم بإجراء تلطيخ السطح لعلامات السطح كما هو موضح أعلاه في الخطوة 5.1.
    3. أضف محلول النفاذية (50-100 ميكرولتر / بئر) واحتضانه لمدة 5 دقائق في RT للتلطيخ داخل الخلايا. احتضان الخلايا بأجسام مضادة خاصة بالسيتوكينات أو البروتينات النووية في محلول نفاذية (50-100 ميكرولتر / بئر) لمدة 60 دقيقة على الجليد أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    4. قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 500 × جم لمدة 5 دقائق واغسلها باستخدام مخزن FACS مرتين. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية وحمايتها من الضوء. الحصول على العينات على مقياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: قد يلزم تعديل تخفيف الأجسام المضادة حسب الضرورة لتحقيق التلوين الأمثل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عادة ما يتم ملاحظة نقطة سوداء مرئية لخلايا B16-F10 المزروعة على سطح الجلد ~ 3 أيام بعد زرع الورم. يتم علاج الفئران بلقاح الورم بعد 3 و 6 و 9 أيام من وصول العقيدة الورمية إلى حجم ≥2 مم. لاحظنا انخفاضا كبيرا في نمو الورم في مجموعة الفئران الملقحة ~ 2 أسابيع بعد زرع الورم (الشكل 1). في نهاية التجربة ، قمنا بعزل الخلايا المناعية داخل الورم وتحليل عددها وتعبير علامة سطح الخلية ، وكذلك إنتاج السيتوكين بعد تحفيز قصير في المختبر كما هو موضح أعلاه. لا تزال الخلايا التي تم جمعها من طبقة الكري...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد البروتوكول الموصوف هنا على الدراسة التي أجرتها مجموعة أليسون. لقد أظهروا أن الجمع بين لقاح B16-Flt3L مع حصار CTLA-4 أظهر تأثيرا تآزريا على معدل البقاء على قيد الحياة ونمو الورم ، في حين لم يلاحظ أي انخفاض في نمو الورم في الفئران التي تتلقى لقاح B16-Flt3L أو علاج الأجسام المضادة ل CTLA-4 وحده7. كشفت الدراسات الحديثة عن مسار إشارات CTLA4-PKCη الجديد Treg-intrinsic الذي يلعب دورا إلزاميا مهما في تنظيم النشاط القمعي المعتمد على الاتصال ل Treg11. أدى كل من علاج لقاح B16-Fl...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور ستيفن شوينبيرجر على توفير خلايا B16-Flt3L وموظفي مرافق قياس الحيوان والتدفق الخلوي LJI للحصول على دعم ممتاز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تريبسين-EDTA Gibco25200-056
10٪ معطل بالحرارة FBSأوميغا ScientificFB-02 & nbsp ؛الكثير # 209018
إبرة 30GBD Biosciences305106
96 بئر صفيحة قافلة على شكل حرف VSARSTEDT83.3926.500
B16 خط خلية يعبر عن التيروزين كيناز الشبيه ب FMS 3 ligand (B16-Flt3L)هدية من الدكتور ستيفن شوينبرجر ، LJI & nbsp ؛تم استنساخ الحمض النووي (cDNAs) Flt3L في ناقل الفيروسات القهقرية pMG-Lyt2 ، كما هو الحال في المرجع 5 ، الشكل التكميلي 1
خطوط الخلايا B16-F10ATCCCRL-6475
أجهزة الطرد المركزي 5810REppendorf
Cytofix التثبيت المؤقت   ؛BD BiosciencesBDB554655المخزن المؤقت لتثبيت الخلايا (4.2٪ PFA)  
مجموعة Cytofix / Cytoperm Biosciences554714مجموعة حلول التثبيت / النفاذية
DNase ISigma11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM) Corning10013CV
الفرجار الرقمي الإلكترونيFisherbrand14-648-17
برنامج FlowJo تحليل بيانات مقياس التدفق الخلويلشجرة ستار
GolgiStop (مثبط نقل البروتين)BD Biosciences5547241: 1500 تخفيف
HEPES (1M)Gibco15630-080
IonomycinSigmaI0634
Iscove ' s Dulbecco المعدل s متوسط (IMDM)Thermo Fisher12440053
مقاييس الخلوي LSR-II BD Biosciencesمقياس التدفق
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسيةGibco11140-050
البنسلين والستربتومايسين   ؛Gibco15140-122
Percoll GE Healthcare Life SciencesGE17-0891-02كثافة التدرج المتوسط المحدد
PMASigmaP1585
خلايا الدم الحمراء عازلة Hybri-Max السائلSigmaR7757-100ML
RPMI 1640 متوسطCorning10-040-CV
RS2000 تقنيات مصدر الأشعة السينية RadSource Technologies بيروفات
الصوديومGibco11360-070
مصفاة خلية معقمة 40 مو ؛ مفيشربراند22-363-547
مصفاة خلية معقمة 70 مو ؛ mFisherbrand22-363-548
TL LiberaseRoche477530
Zombie Aqua قابلة للإصلاح مجموعة قابلية للإصلاحBioLegend423101
الأجسام
المضادة المضادة ل mCD45BioLegend103135استنساخ: 30-F11
Fluorophore: BV570
التخفيف: 1: 200
Anti-mCD3 & epsilon;BioLegend100327استنساخ: 145-2C11
الفلوروفور: PerCP-Cy5.5
التخفيف: 1: 200
Anti-mCD8BioLegend100730
100724		استنساخ: 53-6.7
الفلوروفور: Alexa Fluor 700 ، Alexa Fluor 647
التخفيف: 1: 200
Anti-mCD4BioLegend100414استنساخ: GK1.5
الفلوروفور: APC-Cy7
التخفيف: 1:200
Anti-mFoxp311577382 Thermo Fisher Scientific: FJK-16s
الفلوروفور: FITC
التخفيف: 1:100
Anti-m / hGzmBBioLegend372208استنساخ: QA16A02
الفلوروفور: PE
التخفيف: 1:100
Anti-mIFNgBioLegend505826استنساخ: XMG1.2
الفلوروفور: PE-Cy7
التخفيف: 1:100
Anti-mCD19BioLegend115543استنساخ: 6D5
الفلوروفور: BV785
التخفيف: 1:100
Anti-mGr1BioLegend108423استنساخ: RB6-8C5
Fluorophore: APC / Cy7
التخفيف: 1: 200
Anti-mCD11bBioLegend101223استنساخ: M1 / 70
الفلوروفور: أزرق المحيط الهادئ
التخفيف: 1:100
Anti-mF4 / 80BioLegend123114استنساخ: BM8
الفلوروفور: PECy7
التخفيف: 1:100
Anti-mCD11cBioLegend117328استنساخ: N418
الفلوروفور: PerCP Cy5.5
التخفيف: 1: 100
Anti-mMHCIIBioLegend107622استنساخ: M5 / 114.15.2
الفلوروفور: AF700
التخفيف: 1: 400
Anti-mCD103BioLegend121410استنساخ: 2E7
الفلوروفور: Alexa Fluor 647
التخفيف: 1: 200
Anti-mCD86BioLegend105007استنساخ: GL-1
Fluorophore: PE
التخفيف: 1: 200
FC-blocker (الفئران المضادة للفأر CD16 / CD32) BDBiosciences553141استنساخ: 2.4G2
التخفيف: 1: 200
BD الخلوي محلول استنساخ

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  4. Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
  5. Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
  6. Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280(2004).
  7. Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
  8. Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
  9. Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938(2014).
  10. Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
  11. Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792(2021).
  12. Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Flt3L B16 F10

مقالات ذات صلة