تقنية التقشير هي طريقة تحضير شبكة cryo-EM التي تسمح بفصل العينات البيولوجية متعددة الطبقات والمركزة إلى طبقات مفردة لتقليل السماكة وزيادة تركيز العينة وتسهيل معالجة الصور.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تقنية تحضير شبكة التقشير والبقع cryo-EM هي طريقة حقن عكسي معدلة بشكل كبير بهدف تحقيق تقليل في طبقات العينات متعددة الطبقات. يمكن أن تساعد إزالة الطبقات قبل التجميد بالغطس في تقليل سمك العينة إلى مستوى مناسب لجمع بيانات cryo-EM ، وتحسين تسطيح العينة ، وتسهيل معالجة الصور. تسمح تقنية التقشير بفصل الأغشية متعددة الصفائح إلى طبقات مفردة ، وبلورات 2D ذات الطبقات إلى بلورات فردية ، وهياكل مكدسة تشبه الصفيحة من البروتينات القابلة للذوبان ليتم فصلها بالمثل إلى طبقات مفردة. غالبا ما يطرح سمك العينة العالي لهذه الأنواع من العينات مشاكل لا يمكن التغلب عليها لجمع بيانات cryo-EM ومعالجة صور cryo-EM ، خاصة عندما يجب إمالة مرحلة المجهر لجمع البيانات. علاوة على ذلك ، يمكن إعداد شبكات ذات تركيزات عالية من أي من هذه العينات لجمع البيانات بكفاءة حيث يمكن زيادة تركيز العينة قبل إعداد الشبكة وتعديل تقنية التقشير لطخة لتؤدي إلى توزيع كثيف للعينة أحادية الطبقة.
المقدمة
تم تطوير تقنية التقشير من أجل فصل البلورات ثنائية الأبعاد المكدسة من البروتينات الغشائية إلى طبقات مفردة للحصول على عينات رقيقة مناسبة لجمع البيانات cryo-EM 2D و 3D وتسهيل معالجة الصور1. البروتوكول مناسب بالمثل لأنواع أخرى من العينات متعددة الصفائح وكذلك لتحقيق تركيزات عالية للعينات من أي نوع عينة على الشبكة دون زيادة السماكة في Z.
يتم تقليل طبقات العينة إلى طبقة واحدة من خلال تطبيق مزيج من الضغط الشعري وقوى القص في بروتوكول يمتد بشكل كبير ويعدل طريقة الحقن الخلفي2. تؤدي خطوة النشاف الأولى إلى شطيرة ضيقة والالتزام بفيلم الكربون وشريط شبكي على جانبي العينة متعددة الطبقات أثناء النشاف على الميكرون الفرعي بدلا من حجم مسام ورق الترشيح 20-25 ميكرومتر في طريقة الحقن الخلفي. يحدث فصل أو تقشير طبقة فردية عند فرض فصل الطبقات المحصورة بمجرد ضغط الشبكة عموديا على قطرة تريهالوز ، مما يجبر فيلم الكربون بعيدا عن شريط الشبكة (الشكل 1). يحدث تغيير موضع فيلم الكربون بعيدا عن نقطة الاتصال الأصلية مع شريط الشبكة في الخطوة التالية ، عندما يتم مسح الشبكة مرة أخرى على ورق ترشيح submicron. يمكن تحسين عدد التكرارات لهذه الخطوات لعينات محددة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام البروتوكول لزيادة تركيزات العينات مع تجنب التجميع في Z. نظرا للاعتماد على الالتزام بشريط الشبكة وفيلم الكربون بالإضافة إلى الفصل القسري ، قد لا يكون هذا النهج مناسبا للجزيئات شديدة الهشاشة مثل بعض البروتينات الحساسة و / أو غير المستقرة ومجمعات البروتين.
لا تتطلب تقنية التقشير معدات متخصصة ولا إمدادات باهظة الثمن. غير أن قابلية التطبيق على عينات محددة ستتطلب اعتبارات متأنية للبارامترات البيولوجية. القرار أسهل بالنسبة لبلورات 2D حيث أن فيلم الكربون مطلوب لضمان التسطيح ، ومع ذلك فإن التلاعب عبر تقنية التقشير قد يؤثر على السلامة البيولوجية للعينة أو الترتيب البلوري. تقتصر ملاءمة تقنية التقشير واللطخة للجسيمات المفردة على تلك التي تتطلب طبقة كربونية ومستقرة للتلاعب. قد لا تكون العينات ذات التفاعلات البيولوجية الحرجة بين الطبقات مناسبة للتوصيف بمساعدة تقنية التقشير بسبب تعطيل مثل هذه التفاعلات.
يتم تحسين تقنية التقشير ("التقشير اللطخ") بسرعة أكبر عن طريق الاختبار والفحص باستخدام البقع السلبية أو العينات غير الملوثة بواسطة TEM في درجة حرارة الغرفة. بمجرد تحديد العدد الأمثل لتكرارات التقشير ، يمكن تحديد وقت التحكم في السماكة قبل التزجيج.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خطوات التحضير لتقنية التقشير
ملاحظة: يتطلب التحضير وضع العناصر التالية بجوار بعضها البعض.
- قم بتكديس قطعتين من ورق الترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
- ضع فيلم بارافين بطول ~ 8 سم × 10 سم بجوار ورق الترشيح بحيث يكون الورق متجها لأعلى.
- ضع قطعة من ورق الترشيح submicron فوق قطعتين إضافيتين من ورق الترشيح # 4 (الشكل 1-1).
- ضع الملقط المضاد للشعيرات الدموية بحيث تكون الساق المثنية متجهة لأعلى والساق المستقيمة متجهة لأسفل. بعد ذلك ، حدد شبكة 600 شبكة مع الجانب الأملس / اللامع لأعلى. ضع الملقط على طبق بتري أو أي سطح مرتفع آخر لتجنب ملامسة الشبكة النظيفة مع العناصر الأخرى.
- قم بإزالة الورق من فيلم البارافين واسحب الجوانب (~ 5 مم) لإنشاء حافة صغيرة. ماصة قطرتان 150 ميكرولتر من محلول تريهالوز 4٪ ~ 1-2 سم من جانب قصير من فيلم البارافين و ~ 1 سم على فيلم البارافين.
- على مقعد منفصل أو على الأرض ، صب النيتروجين السائل في وعاء صغير من رغوة البوليسترين (انظر جدول المواد).
تنبيه: تلقي التدريب على التعامل السليم باستخدام القفازات ودرع الوجه من أجل تجنب لدغة الصقيع. - ضع حاوية شبكة cryo-EM صغيرة في النيتروجين السائل وقم بتغطية حاوية رغوة البوليسترين بمناديل خالية من النسالة.
2. وضع فيلم الكربون على الشبكة
- استخدم ملقط Dumont # 5 (انظر جدول المواد) لتعويم فيلم الكربون من الميكا عن طريق لمس جانب واحد من الميكا بزاوية طفيفة لأسفل (~ 20 درجة -40 درجة) على إحدى قطرات محلول تريهالوز واترك توتر الماء يرفع ببطء فيلم الكربون عن طريق تحريك الميكا لأسفل. حرر الميكا بمجرد أن يطفو فيلم الكربون على سطح القطرة.
- افحص بصريا فيلم الكربون لتجنب استخدام الكربون مع تلف في شكل كسور.
- أدخل الشبكة التي يحملها الملقط المضاد للشعيرات الدموية بزاوية (~ 20 درجة -30 درجة) في قطرة تريهالوز في موضع مجاور ، ثم تركزت تحت فيلم الكربون. التقط فيلم الكربون (الشكل 1-2).
- حافظ على الشبكة في نفس الاتجاه وقم بخفضها ببطء على سطح القطرة الثانية من trehalose دون كسر التوتر السطحي للقطرة لإزالة فيلم الكربون غير الضروري الذي قد يكون ملفوفا حول حافة الشبكة إلى الجانب الخشن.
3. فصل بلورات 2D متعددة الطبقات إلى طبقات واحدة
- قم بتدوير الملقط المضاد للشعيرات الدموية (انظر جدول المواد) وضعه على طبق بتري بحيث يكون الجانب الكربوني للشبكة متجها لأسفل (الشكل 1-3).
- ماصة 1.3 ميكرولتر من العينة في الغضروف المفصلي trehalose طفيف على قمة الشبكة. ماصة الحل ~ 8-10 مرات لخلط وتوزيع trehalose والعينة على جانبي الشبكة.
- أثناء احتضان المحلول لمدة دقيقة واحدة ، ماصة واحدة أو أكثر من قطرات 1.7 ميكرولتر من محلول تريهالوز على فيلم البارافين.
- قم بتدوير الشبكة مرة أخرى إلى موضعها الأصلي مع توجيه فيلم الكربون لأعلى.
- استخدم الملقط المضاد للشعيرات الدموية للضغط على الشبكة على ورقة الترشيح تحت الميكرون (الشكل 1-4). بمجرد امتصاص المحلول بواسطة ورقة الترشيح ويكون فيلم الكربون مسطحا ، انتظر لمدة 3 ثوان قبل رفع الشبكة وتحريكها عموديا على قطرة 1.7 ميكرولتر من محلول تريهالوز (الشكل 1-5).
ملاحظة: كرر هذه الخطوة عدة مرات للعينات المكدسة للغاية، أو يتم إعداد الشبكة للتزجيج في الخطوات التالية. - امسح الشبكة على قطعتي ورق الترشيح ، ثم ارفع الشبكة من ورق الترشيح (الشكل 1-6). بعد حوالي 13 ثانية ، اعتمادا على الرطوبة والمخزن المؤقت للعينة ، قم بغمر الشبكة في النيتروجين السائل في حاوية الستايروفوم الصغيرة ووضع الشبكة في حاوية شبكة cryo-EM أو نقلها مباشرة لفحص cryo-EM أو جمع البيانات.
ملاحظة: من أجل تحسين البروتوكول بسرعة ، قم بتلطيخ الشبكة المقشرة بشكل سلبي في هذه الخطوة بدلا من إغراقها في النيتروجين السائل. قم بتلطيخ العينة سلبا عن طريق تطبيق 3 ميكرولتر من أسيتات اليورانيل بنسبة 1٪ على الشبكة ، واحتضان الشبكة لمدة 30 ثانية ، وصمة عار بقطعة ممزقة من ورق ترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر. يتم غمر شبكات بلورات ثنائية الأبعاد المزججة في التريهالوز أو التانين أو الجلوكوز يدويا بشكل روتيني للتزجيج حيث يمنع التريهالوز والتانين والجلوكوز تكوين الجليد البلوري بمعدلات تستخدم للغطس اليدوي2.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ستؤدي تجربة التقشير الناجحة إلى طبقات مفردة من العينات بتركيزات عالية في كثير من الأحيان. من المتوقع أن تظل بعض المناطق في معظم مربعات الشبكة تحتوي على طبقات متعددة ، خاصة عند عدد أقل من التكرارات لخطوات التقشير. ومع ذلك ، فإن غالبية مربعات الشبكة ستحتوي على مناطق واسعة من الطبقات المفردة كما لوحظ لبلورات ثنائية الأبعاد من سينسيز الليكوترين C4 البشري (الشكل 2) والليبوزومات (المضافة في الخطوة 3.2 ، الشكل 3). قد يلزم اختبار خطوات إضافية لمسح التقشير للع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تعد لطخة التقشير طريقة قوية للتغلب على تكديس وسمك بلورات 2D متعددة الطبقات وعينات مماثلة لجمع بيانات cryo-EM ومعالجة الصور. سيعتمد قرار استخدام لطخة التقشير على المعلمات البيولوجية للعينة وسيتطلب أيضا تقييما بمجرد توفر نموذج 3D cryo-EM. وستكون الأهمية البيولوجية للمخالطين والمرونة المحتملة لمناطق الاتصال ذات أهمية خاصة في هذا التقييم.
سيتم تحديد عدد بقع التقشير في البداية عن طريق الملاحظة بعد إعداد شبكة البقع السلبية القياسية ، حيث تتطلب الطبقات أو السمك المفرط استراتيجيات بديلة لإعدا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.
شكر وتقدير
تم دعم جزء من هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة HL090630 (ISK).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 600 شبكة شبكات | SPI | 2060-C-XA | |
| ملقط مضاد للشعيرات الدموية | تيد بيلا | 510-5 | |
| الكربون لطلاء الميكا | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM عند 120 كيلو فولت أو 200 كيلو فولت. يتم جمع البيانات عالية الدقة عند 300 كيلو فولت. | ||
| Dumpont # 5 ملقط | Ted Pella | 5622 | |
| صندوق شبكي لتخزين التبريد | Ted Pella | 160-40 | |
| مناديل كيم المبللة | |||
| النيتروجين | |||
| ميكا | تيد بيلا | 56 | الميكا مغلفة بالكربون ومقطعة إلى مربعات أكبر بكثير من شبكة TEM. قد يتطلب سمك الكربون تحسينا لتجنب الكربون الرقيق الذي ينكسر بسهولة على بقع التقشير المتعددة. |
| وصمة عار | 1-2٪ أسيتات اليورانيل مناسبة للعديد من العينات. يمكن استبدال البقع الأخرى مثل حمض الفوسفوتونغستيك. | ||
| بارافيلم | |||
| يمكن إعادة تدوير حاوية شحن البوليسترين لهذا الغرض ومبطنة بورق الألمنيوم. | |||
| ورق ترشيح Submicron | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| مجهر إلكتروني ناقل | الحركة JEOL | JEM-1400 | أي TEM يعمل بجهد متسارع من 80-120 كيلو فولت سيكون مناسبا لفحص الشبكات الملطخة سالبا. |
| تريهالوز | تحضير محلول تريهالوز بنسبة 4٪. | ||
| Whatman # 4 ورق الترشيح | MilliporeSigma | WHA1004150 | هذا يتوافق مع 20-25 & ورق ترشيح بحجم المسام في البروتوكول. |
المراجع
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
