يصف البروتوكول الحالي طريقة لحقن أجنة القراد. حقن الأجنة هو الأسلوب المفضل للتلاعب الجيني لتوليد خطوط معدلة وراثيا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقنية حقن الأجنة لتحرير الجينات في القراد ذو الأرجل السوداء ، Ixodes scapularis
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن للقراد أن ينقل العديد من مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والأولية ، وبالتالي يعتبر ناقلات ذات أهمية طبية وبيطرية. على الرغم من العبء المتزايد للأمراض التي تنقلها القراد ، فقد تخلفت الأبحاث على القراد عن ناقلات الأمراض الحشرية بسبب التحديات في تطبيق أدوات التحول الجيني للدراسات الوظيفية على البيولوجيا الفريدة للقراد. تحظى التدخلات الجينية بالاهتمام للحد من الأمراض التي ينقلها البعوض. ومع ذلك ، فإن تطوير مثل هذه التدخلات يتطلب تحولا مستقرا للخط الجرثومي عن طريق حقن الأجنة. مثل هذه التقنية لحقن الجنين غير موجودة في chelicerates ، بما في ذلك القراد. هناك عدة عوامل ، مثل طبقة الشمع السميكة الخارجية على أجنة القراد ، والمشيمية الصلبة ، والضغط العالي داخل البيضاوي ، هي بعض العقبات التي منعت سابقا تطور بروتوكول حقن الأجنة في القراد. لقد تغلب العمل الحالي على هذه العقبات ، ويتم وصف تقنية حقن الأجنة للقراد ذو الأرجل السوداء ، Ixodes scapularis ، هنا. يمكن استخدام هذه التقنية لتوصيل المكونات ، مثل CRISPR / Cas9 ، لتحويلات الخط الجرثومي المستقرة.
المقدمة
القراد هي ناقلات ذات أهمية طبية وبيطرية ، قادرة على نقل مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والبروتوزوان والديدان الخيطية1،2. في شرق الولايات المتحدة ، يعد القراد ذو الأرجل السوداء ، Ixodes scapularis ، ناقلا مهما لمرض لايم (LD) الممرض ، اللولبي Borrelia burgdorferi. يتم الإبلاغ عن أكثر من 400000 حالة من LD كل عام في الولايات المتحدة ، مما يجعلها أكبر الأمراض المعدية المنقولة بالنواقل في الولايات المتحدة1. بالإضافة إلى B. burgdorferi ، تنتقل ستة كائنات دقيقة أخرى بواسطة I. scapularis - بما في ذلك أربعة بكتيريا (Anaplasma phagocyto....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم شراء البالغين Ixodes scapularis إما من جامعة ولاية أوكلاهوما (OSU) أو تربيتهم في جامعة نيفادا ، رينو (UNR) (بروتوكول IACUC # 21-001-1118).
1. إعداد القراد الإناث لجمع الأجنة
ملاحظة: لجمع البيض من العمر المناسب ، من المهم مزامنة وضع البيض. على الرغم من أن إشارات وضع البيض في القراد لا تزال غير واضحة ، في ظل الظروف الحشرية القياسية (درجة حرارة 27 درجة مئوية ورطوبة نسبية >90٪ (RH)) ، تبدأ إناث I. scapularis في وضع البيض بعد حوالي 8 أيام من انفصال المضيف. يمكن إطالة هذا الجدول الزمني عن طريق تخزين الإناث المليئة عند 4 درجات مئوية. لقد قمنا بتخزين الإناث التي تتغذى على الدم في 4 در....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم وصف بروتوكول حقن الأجنة الناجح ل I. scapularis في هذه المقالة. تم الاحتفاظ بالإناث التي تضع البيض في رطوبة عالية لتجنب جفاف البيض المشمع جزئيا. تمت إزالة طبقة الشمع لحقن أجنة القراد عن طريق استئصال عضو الجين (غدة الشمع) للأنثى الجاذبة (الشكل 1A-E). استخدمنا إبر زجاجية من سيليكات الألومنيوم ذات رقبة أقصر (الشكل 2). كان هذا الشكل مثاليا لحقن بيض القراد لأنه يمكن أن يتحمل الضغط بشكل أفضل من الإبرة الطويلة (المدببة) المس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا هو البروتوكول الأول الذي تم تطويره لحقن أجنة القراد المبكرة بنجاح. تم تحقيق معدل البقاء على قيد الحياة ~ 4٪ -8٪ ، وهو ما يمكن مقارنته بحقن الجنين في نماذج الحشرات الراسخةالأخرى 5.
نظرا لأن هذا هو البروتوكول الأولي ، فمن المتوقع أن يتم تحسين هذا البروتوكول وتخصصه لأنواع القراد الفردية. على وجه الخصوص ، يختلف توقيت الحقن من نوع إلى آخر ، اعتمادا على التطور الجنيني ، وخاصة توقيت الخلوية. تشير البيانات الأولية إلى أن بيض I. scapularis لا يمر بتقسيم نووي سريع في.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يعترف المؤلفون ب Channa Aluvihare و Youns Gebermicale، ITF، UMD، للحصول على البصيرة والدعم خلال المرحلة الأولية من تطوير البروتوكول. كانت إبر التنغستن هدية سخية من ديفيد أوبروشتا، الITF، UMD. نحن ممتنون للدكتور لاديسلاف سيمو لاختبار هذا البروتوكول في I. ricinus وللمناقشات الثاقبة. تم تمويل هذا المشروع من قبل NIH-NIAID R21AI128393 ومؤسسة بليموث هيل ، نيويورك إلى MG-N ، وصناديق بدء التشغيل من جامعة نيفادا إلى AN، ومنحة المؤسسة الوطنية للعلوم رقم 2019609 إلى MG-N و AN، ومنحة نظير إلى نظير من IGTRCN إلى AS.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الشعيرات الدموية سيليكات الألومنيوم ، مع خيوط | أدوات Sutter | AF100-64-10 | حقن الأجنة |
| كلوريد البنزالكونيوم 50٪ في الماء ، 25 جم | TCI-America | B0414 | علاج الأجنة ، 25 جم حوالي 25 مل |
| ورق ترشيح | Whatman | 1001-090 | رعاية ما بعد الحقن |
| ملقط | توماس Scientific | 300-101 | عضو الجين مناديل |
| مختبر | Genesee Scientific | 88-115 | |
| نصائح Microloader | Eppendorf | 930001007 | تحميل الإبر المسحوبة |
| Micromanipulator | أدوات Sutter | ROE-200 | حقن الأجنة |
| شرائح مجهرية - عادي ، حواف أرضية | Genesee Scientific | 29-100 | محاذاة الأجنة ، يفضل استخدام الحواف الأرضية ، يمكن أن تكون الحواف المشطوفة حجب البيض من العرض |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | علاج الأجنة |
| مجتذب الإبرة | أدوات Sutter | P-1000 | |
| شريط دائم على الوجهين | سكوتش | 34-8716-3417-5 | محاذاة الأجنة |
| لوحات بتري | جينيسي العلمية | 32-107G | رعاية ما بعد الحقن |
| Tegaderm / شفاف خلع الملابس 3M | Healthcare | 1628 | محاذاة الأجنة |
| إبر التنغستن | أدوات العلوم الدقيقة | 10130-10 | التلاعب بأعضاء الجين |
| سلك التنغستن | Amazon | B08DNT7ZK3 | التلاعب بأعضاء الجين |
| XenoWorks Digital Microinquor | أدوات Sutter | حقن الأجنة | MPC-200 |
المراجع
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
