Method Article

التحضير والتقييم الهيكلي للطبقات الأحادية للخلايا الظهارية في جهاز زراعة الموائع الدقيقة بحجم فسيولوجي

DOI:

10.3791/64148

⸱

July 1st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول المقدم تطوير واستخدام تقنية تلطيخ الأكتين الخيطي القائم على الفالويدين مع مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM) لتصور بنية طبقة الخلية الملتصقة في قنوات الثقافة الديناميكية للسوائع الدقيقة وغرف الاستزراع الثابتة التقليدية للبئر الثابت. يساعد هذا النهج في تقييم التقاء طبقة الخلية ، وتكوين الطبقة الأحادية ، وتوحيد سمك الطبقة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحمل تجارب الموائع الدقيقة في المختبر إمكانات كبيرة للكشف عن العديد من الأفكار حول الظواهر الفسيولوجية الدقيقة التي تحدث في حالات مثل متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) وإصابة الرئة التي يسببها جهاز التنفس الصناعي (VILI). ومع ذلك ، فإن الدراسات في قنوات الموائع الدقيقة ذات الأبعاد الفسيولوجية ذات الصلة بالقصيبات الطرفية للرئة البشرية تواجه حاليا العديد من التحديات ، خاصة بسبب الصعوبات في إنشاء ظروف زراعة الخلايا المناسبة ، بما في ذلك معدلات تدفق الوسائط ، داخل بيئة مزرعة معينة. يصف البروتوكول المقدم نهجا قائما على الصور لتقييم بنية الخلايا الظهارية الرئوية البشرية NCI-H441 المزروعة في قناة الموائع الدقيقة غير المنفذة للأكسجين بأبعاد ذات صلة فسيولوجية بالقصيبات الطرفية للرئة البشرية. باستخدام تلطيخ الأكتين الخيطي القائم على الفالويدين ، يتم الكشف عن الهياكل الهيكلية الخلوية للخلايا بواسطة الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر ، مما يسمح بتصور الخلايا الفردية وكذلك الطبقات. يحدد القياس الكمي اللاحق ما إذا كانت ظروف زراعة الخلايا المستخدمة تنتج طبقات أحادية موحدة مناسبة لمزيد من التجارب. يصف البروتوكول زراعة الخلايا وطرق تقييم الطبقة في قنوات الموائع الدقيقة وبيئات الآبار الثابتة التقليدية. وهذا يشمل بناء القناة ، وزراعة الخلايا والظروف المطلوبة ، والتثبيت ، والنفاذية والتلوين ، والتصوير المجهري متحد البؤر ، ومعالجة الصور ، وتحليل البيانات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) هي حالة حادة تنشأ عن إهانة وانتشار الإصابة في حمة الرئة ، مما يؤدي إلى وذمة رئوية في الحويصلات الهوائية ، وعدم كفاية تبادل الغازات ، ونقص الأكسجة اللاحق1. هذا يبدأ دورة من إطلاق السيتوكين المؤيد للالتهابات ، وتجنيد العدلات ، وإطلاق الوسيط السام ، وتلف الأنسجة ، والذي يؤدي في حد ذاته إلى مزيد من الاستجابة الالتهابية2. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم تعطيل الفاعل بالسطح الرئوي ، الذي يعمل على استقرار الشعب الهوائية ويمنع الضرر الناجم عن التوظيف / إلغاء التوظيف المتكرر (R / D) ، أو جعله مختلا وظيفيا بسبب العمليات الكيميائية التي تحدث أثناء متلازمة الضائقة التنفسية الحادة ، مما يؤدي إلى مزيد ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام خط خلايا الرئة الظهارية البشرية NCI-H441 في الدراسة الحالية (انظر جدول المواد).

1. زراعة الخلايا في قناة الموائع الدقيقة

  1. قم بتصنيع قناة الموائع الدقيقة وقم بإجراء المعالجة المسبقة باتباع الخطوات أدناه.
    1. احصل على صفيف تدفق أحادي القناة (انظر جدول المواد) وافصل الجزء العلوي عن لوحة قاعدة البولي كربونات.
    2. احصل على غطاء زجاجي مستطيل # 1.5 (سمك 0.17 مم) بأبعاد 60 مم × 22 مم. نظف أسطح الغطاء الزجاجي في حمام بالموجات فوق الصوتية وعالج جانبا واحدا بمحلول 0.1 مجم / مل من Poly-D-Lysine في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل التجفيف عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح الطريقة المقدمة بتصور طبقات الخلايا الظهارية المستزرعة في قنوات استزراع الموائع الدقيقة وتستخدم عرضا توضيحيا في بيئات زراعة الخلايا التقليدية ذات الآبار الثابتة للتحقق من الصحة. ستكون الصور التي تم الحصول عليها موجودة على طيف من الجودة وشدة الإشارة وخصوصية الهدف الخلوي. ستظهر الصور الناجحة تباينا عاليا ، مما يسمح بتحليل الصور والقياس الكمي للبيانات للتقييم الإحصائي اللاحق. ستكون الصور غير الناجحة قاتمة أو غامضة أو ضبابية أو غير قابلة للاستخدام بطريقة أخرى للتقييم الذاتي أو الكمي. قد تكون بعض الصور مناسبة لتحديد خصائ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول المقدم الثقافة ، والتثبيت المتشابك ، والتلوين ، والنفاذية ، والتصور المجهري متحد البؤر للخلايا الظهارية الرئوية البشرية NCI-H441 في البيئة الديناميكية لمجموعة تدفق الموائع الدقيقة أحادية القناة ، وكذلك في البيئة الثابتة لغطاء زجاجي تقليدي من ثماني غرف جيدا. مع أي بروتوكول لثقافة خلايا الموائع الدقيقة ، فإن ظروف تدفق وسائط زراعة الخلايا لها أهمية قصوى ، حيث أن التدفق عالي المعدل لديه القدرة على غسل الخلايا أو التدخل في التجميع الطبيعي للطبقة الأحادية للخلية. وفي الوقت نفسه ، فإن التدفق منخفض المعدل لديه الق.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف المؤلفون بآلان شيباردسون لتصميمه نمط القطع لورقة 3M اللاصقة والمايلر المستخدمة في بناء قناة الموائع الدقيقة ولاختبار معدل تدفق وسائط زراعة الخلايا وبرمجة مضخة الحقنة. تم توفير التمويل من قبل NIH R01 HL0142702 ، و NSF CBET 1706801 ، ومنحة عميد كلية نيوكومب تولين.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A1R HD25 نظام المجهر متحد البؤرنيكونA1R HD25https://www.microscope.healthcare.nikon.
com / products / confocal-magovers / a1hd25-a1rhd25 / specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin)InvitrogenR37110https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
شريط نقل لاصق مزدوج بطانة3M468 ميجابكسلhttps://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite   HSW Soft-Ject محاقن يمكن التخلص منهاAir-Tite RL514-817-53https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 مل (0.1 مم) ورقة مايلر سميكةBAISDYAS022https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
برانسون الموجات فوق الصوتية   ؛ M سلسلة بالموجات فوق الصوتية تنظيف حمامبرانسون الموجات فوق الصوتية15-336-100https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning  Fibronectin ، HumanFisher ScientificCB-40008https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS والكالسيوم والمغنيسيومGibco14040133https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware مصفوفات القطب الكهربائي القابل للتصرف 8 × 10 مصفوفة تدفق ECISالتطبيقية BioPhysics1F8x10E PChttps://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
حلول تكنولوجيا المؤسسات خزانة التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية ، حلول تكنولوجيا المؤسسة البيضاء50-211-1163https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
مصل الأبقار الجنيني (FBS)جيبكو26140079https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 متغير الحجم PipettesThermo Scientific4642090https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Plastic Centrifuge TubesFisher Scientific06-443-21https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand  نظارات الغطاء: مستطيلات (# 1.5)فيشر Scientific12-544-GPhttps://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand   ؛ محاقن معقمة للاستخدام الفرديفيشر Scientific14-955-458https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 MediumGibco11875093https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4٪ فورمالديهايد ، خالي من الميثانول)InvitrogenFB002https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ فيجيImageJImageJ فيجيhttps://imagej.net/downloads
الغمر Oil F 30 سم مكعبنيكونMXA22168https://www.microscope.healthcare.nikon.
com / products / accessories / immersion-oil / specifications
Large-Capacity Reach-In CO2< / sub>  حاضنة ، 821 لتر ، مصقول من الفولاذ المقاوم للصدأThermo Scientific3950https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series نظام المجهر المركب BrightfieldLaxcoLMC3BF1https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting ، نايلون ، مستقيم ، ذكر قفل لور إلى محولات خرطوم شائكة ، 1/16 "معرف ؛ 25 / PKMasterflexZY-45505-31https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid = Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft ExcelMicrosoft0016https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target جميع المحاقن البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدةThermo Scientific03-377-24https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 خلايا الرئة الظهارية البشرية مجموعةالثقافة من النوع الأمريكي (ATCC)HTB-174https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 مضخة حقنة قابلة للبرمجة سداسية القنواتأنظمة مضخات عصر جديدNE-1600https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS عناصر ARنيكونNIS عناصر ARhttps://www.microscope.healthcare.nikon.
com / products / software / nis-elements / nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)InvitrogenR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered CoverglassThermo Scientific155411https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping FilmFisher ScientificS37441https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock ، Polysulfone ، ذكر / أنثى Luer Inlet x أنثى فرع LuerPendoTechZY-19406-49https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
محلول الفوسفات المخزن (PBS) ، الرقم الهيدروجيني 7.4Gibco10010023 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-LysineGibcoA3890401https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
رينولدز ألومنيوم التفاف رقائقرينولدز458742928317https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
سابونينميليبور سيجما (سيجما ألدريتش)47036https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass ناعم مجموعة مضادة للتلاشي MountantInvitrogenS36917-5X2MLhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II ، حزمة خزانة السلامة البيولوجية من النوع A2Thermo Scientific13-100-752PMhttps://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing ، سيليكون BioPharm المعالج بالبلاتين ، 1/16"معرف × 1/8" OD ؛ 50 قدمكول بارمرEW-95702-01https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18(2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial Cell MonolayerMicrofluidic Culture DeviceHuman Lung EpithelialConfocal MicroscopyPhalloidin StainingCell Layer EvaluationMicrofluidic Channel ConstructionCell Culture ConditionsActin Cytoskeleton ImagingTransepithelial Electrical Resistance

Related Articles