مقالة منهجية

تحديد فعالية التطهير الفيروسي لغسل الماء الساخن

3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64164

⸱

يونيو 21, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Office of Research and Development, Center for Environmental Solutions and Emergency Response, Homeland Security and Materials Management Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Jacobs Technology Inc., 3Science Systems and Applications Inc., 4CSS Inc.

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

استجابة لوباء فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة، تم تطوير بروتوكول مختبري لاختبار فعالية التطهير الفيروسي لغسل الماء الساخن لأغطية الوجه القماشية والدعك القطني والسراويل الدنيم. تم استخدام فيروس Phi6 (البكتيريا) ككائن حي لاختبار فعالية التطهير.

الملخص

ويقدم هذا البروتوكول مثالا على عملية مختبرية لإجراء دراسات غسل الأموال التي تولد بيانات عن التطهير الفيروسي. في حين تم تطوير البروتوكول للبحث خلال جائحة مرض الفيروس التاجي 2019 (COVID-19) ، إلا أنه يهدف إلى أن يكون إطارا قابلا للتكيف مع دراسات تطهير الفيروسات الأخرى. يوضح خطوات تحضير فيروس الاختبار ، وتطعيم مواد الاختبار ، وتقييم التغييرات البصرية والنزاهة في العناصر المغسولة بسبب عملية الغسيل ، وتحديد مقدار الانخفاض في الحمل الفيروسي. بالإضافة إلى ذلك، يحدد البروتوكول عينات مراقبة الجودة اللازمة لضمان عدم تحيز التجارب بسبب التلوث والقياسات / الملاحظات التي ينبغي تسجيلها لتتبع السلامة المادية لعناصر معدات الحماية الشخصية (PPE) بعد دورات غسيل متعددة. تستخدم النتائج التمثيلية المقدمة مع البروتوكول بكتيريا Phi6 الملقحة على مقشر القطن والدنيم ومواد تغطية الوجه القطنية وتشير إلى أن عملية غسل الماء الساخن وتجفيفه حققت أكثر من 3 سجلات (99.9٪) انخفاضا في الحمل الفيروسي لجميع العينات (تخفيض 3 سجلات هو مقياس أداء المطهر في المبدأ التوجيهي لاختبار أداء المنتج التابع لوكالة حماية البيئة الأمريكية 810.2200). كان الانخفاض في الحمل الفيروسي موحدا عبر مواقع مختلفة على عناصر معدات الوقاية الشخصية. يجب أن تساعد نتائج بروتوكول اختبار فعالية التطهير الفيروسي هذا المجتمع العلمي على استكشاف فعالية غسل المنازل لأنواع أخرى من فيروسات الاختبار وإجراءات الغسيل.

المقدمة

تسببت جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) في اضطراب عالمي غير مسبوق في سلسلة التوريد وأدت إلى نقص حاد في العديد من العناصر ، بما في ذلك معدات الحماية الشخصية الأساسية (PPE) 1،2،3. وكان على أولئك الذين يعملون في مهن عالية الخطورة أن يتكيفوا باستخدام استراتيجيات القدرة على الأزمات الموصى بها، واعتمد الجمهور استخدام مواد غير متخصصة مثل أغطية الوجه المصنوعة من مواد القماش في المقام الأول للتحكم في المصدر، ولكن أيضا لتوفير بعض الحماية التنفسية لمرتديها. في الولايات المتحدة ، تم حجز حماية الجهاز التنفسي المتخصصة (أي تصفية أجهزة التنفس (FFRs) مثل N95s) لبعض هذه المهن عالية الخطورة (مثل الرعاية الصحية) أثناء نقص الإمدادات4. عندما لم يكن يعرف سوى القليل عن انتقال فيروس كورونا 2 (SARS-Cov-2) المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة، اعتبرت مجموعة متنوعة من الأنواع الأخرى من مواد الملابس أيضا بمثابة حماية حاجزة في وقت مبكر من الجائحة5. مع تنوع الأقمشة المستخدمة لحماية مرتديها ، نشأت أسئلة حول استخدام هذه العناصر وإعادة استخدامها وتطهيرها / تطهيرها. وفي حين أنه في الولايات المتحدة كان من المقبول عموما أن الغسيل الروتيني للآلات المنزلية لأغطية الوجه وغيرها من الملابس يجعل الفيروسات على تلك الأسطح غير معدية، إلا أنه لا توجد سوى بيانات قليلة للتحقق من صحة هذا الادعاء، وكان هناك نقص في البروتوكولات المختبرية المنشورة للاختبار. الغرض من بروتوكول البحث المعروض هنا هو تقديم مثال على عملية مختبرية لإجراء دراسات غسل الأموال التي تولد بيانات عن التطهير الفيروسي. في حين تم تطوير البروتوكول للبحث خلال جائحة COVID-19 ، إلا أنه يهدف إلى أن يكون إطارا قابلا للتكيف مع دراسات تطهير الفيروسات الأخرى.

دور الملابس في انتقال الأمراض هو مفهوم يصعب تحديده كميا. حاول المنتدى العلمي الدولي المعني بالنظافة المنزلية هذه المهمة الصعبة من خلال إجراء مراجعة لدور الملابس في انتشار الأمراض المعدية إلى جانب تقييم مخاطر ممارسات النظافة المنزلية6. تضمن هذا العمل مراجعة العديد من الدراسات العلمية التي فحصت بقاء سلالات فيروسية مختلفة على أنواع مختلفة من الأقمشة مثل الصوف والقطن7،8،9،10،11. ركزت كل دراسة على نوع مختلف من الفيروسات بما في ذلك اللقاح وفيروس شلل الأطفال والفيروس المخلوي التنفسي وفيروس الهربس وفيروس الأنفلونزا. تراوحت أوقات بقاء الفيروسات المختلفة على الأقمشة من 30 دقيقة إلى 5 أشهر اعتمادا على مزيج المواد الفيروسية. كما أظهرت العديد من الدراسات نقل التلوث الفيروسي من المادة إلى اليدين. وكجزء من المنشور، نوقش غسل الأموال الفعال بوصفه أسلوبا إداريا هاما للحد من انتقال العدوى، ولكنه أقر بأن حجم أثر غسل الأموال على الحد من عبء المرض يعتمد على الملوثات الفيروسية المحددة ويصعب تحديده كميا7،8،9،10،11.

عملية الغسيل تدمر الكائنات الحية الدقيقة باستخدام عمليات المعالجة الكيميائية والفيزيائية والحرارية. على سبيل المثال ، يمكن للصابون والمنظفات فصل التربة وقد يضفي بعض الإجراءات المضادة للميكروبات بوساطة كيميائية. جسديا ، قد يساعد التخفيف والإثارة في تقليل الأحمال الفيروسية. وجدت دراسة فحصت استمرار فيروس كورونا البشري HCoV-OC43 على حوامل القطن باستخدام دورات الغسيل الصناعية والمنزلية مع وبدون درجة حرارة ومنظفات أنه لا يوجد فيروس يمكن اكتشافه عند الغسيل في ماء غير مدفأ بدون منظفات ، ولكن في وجود حمولة التربة (اللعاب الاصطناعي) ، تتطلب دورات الغسيل المنزلية منظفات للعينات حتى لا تحتوي على أحمال الفيروس غير المكتشفة12. الماء الساخن نفسه يمكن أن يوفر أيضا وسيلة فعالة لتدمير بعض الكائنات الحية الدقيقة13,14.

في منشور صدر مؤخرا يلخص حالة ممارسات الغسيل الحالية ، تم تحديد العديد من العوامل مثل تكوين النسيج ، وظروف التخزين ، وحمل الأوساخ ، ودرجة حرارة الغسيل والوقت ، ودرجة حرارة التجفيف على أنها متفاوتة في الممارسات العالمية لغسل الأموال15. في حين أن غسل الأموال هو طريقة تنظيف شائعة لنسبة كبيرة من السكان ، فإن هذا التباين الكبير في الممارسات الحالية يجعل إصدار إرشادات مفصلة حول كيفية القيام بذلك بأمان وفعالية ، عندما يكون العنصر ملوثا بفيروس ، أمرا صعبا ومتناثرا. خلال جائحة COVID-19 ، أصدرت مراكز الولايات المتحدة لمكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) إرشادات حول كيفية غسل العناصر لأصحاب المنازل16,17. استند جزء كبير من إرشادات الغسيل هذه إلى العديد من الدراسات القديمة حول التطهير البكتيري 18,19 وبدعم من العديد من الدراسات التي وجدت أن الفيروسات المغلفة معطلة في الماء مع المنظفات20,21. يمكن تلخيص الإرشادات على النحو التالي: 1) اتباع تعليمات الشركة المصنعة للمنظف ، 2) استخدام أحر إعداد مناسب للمياه ، و 3) تجفيف العناصر تماما. كان الأساس المنطقي لهذه التوصيات هو أن الغسيل في أحر دورة ممكنة باستخدام المنظفات جنبا إلى جنب مع التجفيف تماما (مع الحرارة إن أمكن) سيقتل فيروس SARS-CoV-2.

ويتطلب العدد الهائل من الاختلافات المحتملة في عملية غسل الأموال بروتوكولا موحدا، كما هو معروض هنا، للتمكن من عزل المتغيرات واختبار فعالية التطهير الفيروسي لعمليات محددة. الغرض من هذا البروتوكول إلى جانب فيديو تعليمي هو إظهار عملية غسل المياه الساخنة القائمة على المختبر لتكرارها في دراسات بحثية أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تبني نتائج اختبار فعالية التطهير الفيروسي هذا ثقة المستهلك في فعالية غسل المنازل أثناء الأوبئة الفيروسية.

البروتوكول

تم استلام Phi6 من مختبر متعاون كأليكوت مجمد ~ 1 مل وتم تخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم استخدامه في البداية لنشر المزيد من مخزونات الفيروسات التي تم تخزينها لاحقا عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم اختيار Phi6 كفيروس تجريبي لأنه يستخدم عادة كفيروس مغلف نموذجي ، ويمكن نشره إلى عيارات عالية ، ويتطلب مختبرا منخفض مستوى السلامة البيولوجية لإجراء الاختبار22،23،24.

1. إعداد حل مخزون الفيروسات

  1. نشر البكتيريا Phi6 في المضيف البكتيري Pseudomonas syringae باستخدام إعداد وسائط الصويا أجار المعدلة التربتيك وطريقة تراكب الأجار الناعمة كما هو موضح أدناه.
    1. تحضير أجار الصويا تريبتيك المعدل عن طريق وزن وخلط المكونات من الجدول 1 في الماء منزوع الأيونات.
    2. قم بإعداد ثقافة بين عشية وضحاها من P. syringae عن طريق إضافة 1 مل من P. syringae بكثافة بصرية (OD 600) بين 0.9 إلى 1.5 ، إلى 100 مل من مرق الصويا Tryptic المعدل (الجدول 1) واحتضانها في حاضنة اهتزاز عند ~ 260 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-26 درجة مئوية).
    3. تحضير أنابيب أجار لينة عن طريق وضع تريبتيك فول الصويا أجار المعدلة (~ 6 مل) في أنابيب الاختبار وتغطيتها بغطاء قابل للتعقيم. يحفظ على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. أنابيب الأجار الناعمة الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإذابة الأجار. امسك عند 48 درجة مئوية حتى الطلاء. التوازن عند 48 درجة مئوية مهم وإلا يمكن تعطيل الفيروس في الفحص.
    4. أضف 1 مل من أليكوت الفيروس المركز غير المخفف إلى الأجار الناعم و 100 ميكرولتر من مرحلة السجل (OD600 بين 0.9 إلى 1.5) P. syringae culture. صب أجار ناعم على سطح صفيحة أجار الصويا المتجمدة المعدلة قطرها 100 مم. لمنع الفقاعات و / أو الانسكاب ، تدور الألواح بلطف لتوزيع الأجار الناعم بالتساوي على سطح الآجار الصلب واحتضانه بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    5. كشط بلطف25 محتويات الألواح الثلاثة باستخدام موزع خلايا معقم في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل يحتوي على 15 مل من المخزن المؤقت SM. أنابيب دوامة في أقصى إعداد لمدة 1-2 دقيقة لتفتيت أجار ثم أجهزة الطرد المركزي في 7000 × غرام لمدة 15 دقيقة.
    6. قم بإزالة supernatant وتصفية من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. تخزين 1 مل aliquots في cryovials في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. إجراء تقييم بصري قبل الاختبار لعنصر معدات الوقاية الشخصية

  1. ضع كل عنصر من معدات الوقاية الشخصية على سطح نظيف وأملس (على سبيل المثال، مقعد مختبر مغطى ببطانة ورقية يمكن التخلص منها). تقييم كل عنصر من عناصر معدات الوقاية الشخصية في ثلاثة أضعاف.
  2. ضمان الإضاءة المناسبة أثناء فحص معدات الوقاية الشخصية. قياس وتسجيل طول وعرض المواد غير المغسولة في مواقع مختلفة (الشكل 1).

figure-protocol-1
الشكل 1. مواقع قياس تقييم معدات الوقاية الشخصية قبل الاختبار. مواقع الدنيم والفرك وتغطية الوجه حيث تم تسجيل الطول لتتبع التغيرات المادية الناتجة عن عملية الغسيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. إعداد كوبونات

  1. اصنع كوبونات اختبار 2 سم × 4 سم عن طريق قطع معدات الوقاية الشخصية ، وقم بإعداد قسيمتين لكل غطاء وجه (تم اختبار ثلاثة أغطية للوجه) ، وخمس كوبونات لكل بنطلون دنيم (تم اختبار ثلاثة سراويل دنيم) ، وثلاث كوبونات لكل قميص فرك (تم اختبار ثلاثة دعك).
  2. قم بإعداد مجموعة من كوبونات فارغة إجرائية مقاس 2 سم × 4 سم (مجموعة لعنصر واحد كامل الحجم من معدات الوقاية الشخصية) لكل نوع من أنواع المواد التي لن يتم تطعيمها ولكن سيتم غسلها. قم بإعداد قسيمتين لكل يوم من تجارب تغطية الوجه ، وخمس كوبونات لكل يوم من تجارب الدنيم ، وثلاث كوبونات لكل يوم من تجارب الفرك.
  3. قم بإعداد مجموعة من كوبونات التحكم الإيجابية 2 سم × 4 سم التي سيتم تلقيحها ، ولكن ليس غسلها. قم بإعداد قسيمتين لكل يوم من تجارب تغطية الوجه (تم اختبار ثلاثة أغطية للوجه) ، وخمس كوبونات لكل يوم من تجارب الدنيم (تم اختبار ثلاثة سراويل دنيم) ، وثلاث كوبونات لكل يوم من تجارب الفرك (تم اختبار ثلاثة دعك) ، وثلاث كوبونات من الفولاذ المقاوم للصدأ.
    ملاحظة: تم تحديد أعداد مختلفة من النسخ المتماثلة استنادا إلى حجم العنصر. على سبيل المثال ، من الصعب جسديا الالتزام بخمس كوبونات على غطاء الوجه ، وستمثل قسيمتان مساحة محدودة من سروال الدنيم. وقد اختيرت المواقع لتحقيق أقصى قدر من التغطية وفي المناطق التي قد تطوى أثناء غسل الأموال ويصعب تنظيفها.

4. إجراء التلقيح

  1. تحضير محلول مستخلص لحم البقر بنسبة 10٪ عن طريق إذابة 1 غرام من مستخلص اللحم البقري في حجم إجمالي قدره 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x. مرشح تعقيم الحجم بأكمله باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر.
  2. قم بإذابة محلول مخزون الفيروس المعد في القسم 1 في درجة حرارة الغرفة. في يوم الاستخدام ، أضف 100 ميكرولتر من مخزون Phi6 المذاب إلى 900 ميكرولتر من محلول مستخلص اللحم البقري بنسبة 10٪.
  3. قم بتلقيح كوبونات الاختبار وقسائم التحكم الإيجابية باستخدام ~ 107 PFU / عينة عن طريق سحب قطرة 10 ميكرولتر من المحلول على عنصر معدات الوقاية الشخصية ونشر القطرة باستخدام طرف الماصة. اعتمادا على مادة معدات الوقاية الشخصية ، سيتم فصل القطرات وإعادة تجميعها بشكل مختلف.
  4. اسمح للقسائم الملقحة أن تجف في خزانة السلامة الأحيائية. تحديد وقت (أوقات) الجفاف عن طريق مراقبة المواد المحددة الخاصة بك. بالنسبة للنتائج المعروضة هنا ، تم استخدام الأوقات التالية: الدعك = 30 دقيقة من وقت الجفاف. تغطية الوجه = 60 دقيقة من وقت الجفاف ؛ الدنيم = 30 دقيقة وقت الجفاف. الفولاذ المقاوم للصدأ = 120 دقيقة وقت الجفاف.
  5. قم بإرفاق كوبونات التطعيم بعناصر معدات الوقاية الشخصية كاملة الحجم وفقا للشكل 2 باستخدام دبابيس السلامة وتقنيات التعقيم.

figure-protocol-2
الشكل 2. اختبر مواقع الكوبونات على الدنيم والدعك وأغطية الوجه. تتوافق الحروف من A إلى D مع معرفات القسيمة الفريدة لجميع تجارب غسيل الأموال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. القيام بغسيل الملابس

  1. تحضير منظفات الغسيل على النحو التالي.
    1. تعقيم مياه الصنبور التي سيتم استخدامها في الغسالة وجمع 10 مل من المياه المعقمة لفحص العقم. بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بتعقيم 7 لتر من ماء الصنبور في دورة سائلة مدتها 60 دقيقة.
    2. قم بإعداد حل الغسيل وفقا لتوجيهات التخفيف الخاصة بالشركة المصنعة. لهذا البروتوكول ، قم بإذابة 1.54 مل من المنظفات في 3.5 لتر من ماء الصنبور المعقم. قم بتسخين محلول الغسيل إلى 50 درجة مئوية باستخدام صفيحة ساخنة وحرك الشريط. قياس وتسجيل درجة الحموضة ودرجة حرارة محلول الغسيل. جمع 10 مل من الحل لفحص العقم.
  2. صب محلول الغسيل في غسالة معقمة (3.25 لتر). قم بتعقيم الغسالات مسبقا باستخدام دورة 250 جزء في المليون-4 ساعات من بيروكسيد الهيدروجين البخاري بين الاختبارات.
  3. ضع عنصر (عناصر) معدات الوقاية الشخصية في غسالة معقمة. أضف بنطلون جينز واحد وقميص فرك واحد لكل غسالة. إضافة غطاء وجه واحد ملقح وأربعة أقنعة تعبئة غير ملوثة لكل غسالة ؛ أقنعة التعبئة لم يكن لديها كوبونات مرفقة.
  4. اغسل قطعة معدات الوقاية الشخصية لمدة 18 دقيقة (دورتا غسيل لمدة 9 دقائق مع الإثارة العادية). تصفى الغسالة وتشطف ثلاث مرات بماء الصنبور بدرجة حرارة الغرفة (5 لتر في كل مرة) لإزالة الرغوة. أضف ماء الصنبور المعقم بدرجة حرارة الغرفة إلى الغسالة (3.25 لتر) وقم بإجراء دورة شطف طويلة لمدة 9 دقائق.
  5. حرك عنصر (عناصر) معدات الوقاية الشخصية إلى جانب دوران الغسالة وقم بالدوران لمدة 5 دقائق. انقل عنصر (عناصر) معدات الوقاية الشخصية إلى المجفف وجففه لمدة 80 دقيقة على إعداد الحرارة العالية (93 درجة مئوية).
  6. انقل معدات الوقاية الشخصية من المجفف إلى مساحة العمل المعقمة وقم بإزالة القسائم من كل عنصر ووضعها في أنابيب مخروطية معقمة. املأ الأنابيب مسبقا ب 10 مل من 10٪ من المخزن المؤقت لاستخراج مرق Dey-Engley وقم بتغطيته بورق الألومنيوم.

6. استخراج وتعداد الأحمال الفيروسية على القسائم

  1. استخراج كوبونات في 10 مل من 10٪ Dey-Engley تحييد مرق عن طريق دوامة لمدة 2 دقيقة في أقصى إعداد لمعداتك.
  2. مستخلصات اللوحة باستخدام طريقة تراكب الأجار العلوية الناعمة التقليدية26.
    1. قم بإعداد أنابيب من أجار الصويا ثلاثي الصويا المعدل الناعم وثقافة P. syringae كما هو موضح في القسم 1. في يوم الاختبار ، قم بتعقيم أنابيب الأجار الناعمة عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإذابة الأجار. امسك الأجار الناعم عند 48 درجة مئوية حتى الطلاء. التوازن عند 48 درجة مئوية مهم وإلا يمكن تعطيل الفيروس حراريا في الفحص.
    2. قم بإعداد سلسلة تخفيف عشرة أضعاف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x لكل عينة اختبار مستخدمة في دراسة الغسيل. استخدم كلا من الأليكوتات المخففة بشكل متسلسل (100 ميكرولتر) وغير المخففة (1 مل و 100 ميكرولتر) للطلاء.
    3. أضف أليكوتات عينة الاختبار إلى أنبوب الأجار الناعم الذي يحتوي على 6 مل من الأجار الناعم و 100 ميكرولتر من مزرعة المحاقن P . مرحلة السجل (OD600 بين 0.9-1.5). صب الأجار الناعم على سطح صفيحة أجار الصويا المعدلة بالتربتيك. قم بتوزيع الأجار الناعم بالتساوي على سطح الأجار الصلب عن طريق تدوير اللوحة.
    4. احتضان اللوحات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة وتعداد اليوم التالي يدويا عن طريق حساب وحدات تشكيل البلاك على كل لوحة.

7. إجراء تقييم مرئي بعد الاختبار لعنصر (عناصر) معدات الوقاية الشخصية

  1. توثيق ما يلي في مختلف عناصر معدات الوقاية الشخصية المستخدمة للاختبار: علامات التلاشي وتغير اللون و / أو التلف (على سبيل المثال ، التمزق ، التمدد) ؛ الروائح; ثقوب صغيرة أو جروح أو دموع (استخدم مصباح يدوي صغير للبحث عن الضرر) ؛ فصل الطبقات ، والخيوط المفقودة ، والمناطق التي يتلف فيها الربط ؛ الأضرار التي لحقت طبقات أو سحابات. قياس وتسجيل تمدد المرنة.

النتائج

يتم إنشاء عدة أنواع مختلفة من بيانات ونتائج مراقبة الجودة بعد الانتهاء من هذا البروتوكول. يتيح عدد لوحات وحدة تشكيل البلاك (PFU) إلى جانب حجم العينة المستخرجة حساب عدد PFU لكل قسيمة اختبار. الجدول 2 هو مثال على ورقة تسجيل البيانات لنتائج التخفيف/الطلاء التسلسلي. باستخدام عامل التخفيف وحجم العينة وعدد الصفائح من الجدول 1 ، يوضح الجدول 3 نتائج الاسترداد الفيروسي التمثيلية لاختبار تغطية الوجه. لاحظ أن هذه البيانات تشمل كوبونات الاختبار وعينات مراقبة الجودة للتطعيم والقسائم ومياه الغسيل (مع وبدون منظف). تعتبر عينات مراقبة الجودة الفارغة والعقيمة الإجرائية مهمة للتأكد من أن محاليل المياه ومواد معدات الوقاية الشخصية لم تكن ملوثة ب Phi6. ومن شأن الإشارة إلى التلوث أن تتسبب في حسابات خاطئة لفعالية التطهير وتتطلب تكرار الاختبار. والغرض من عينات المراقبة الإيجابية هو التحقق من أن محلول مخزون الفيروس لم يتحلل بيئيا/طبيعيا أثناء التجارب، مما أدى إلى تضخيم تأثير عملية الغسيل في الحد من الحمل الفيروسي. يجب أن تبقى هذه العينات ضمن 1 سجل PFU من ضوابط التطعيم لقبول نتائج قسيمة الاختبار. يشير الانخفاض الكبير في PFU لعينات التحكم الإيجابية أيضا إلى أنه يجب مراجعة جميع خطوات تلقيح القسيمة بعناية للتأكد من أن المحلل ينفذ البروتوكول باستخدام تقنيات السحب والنشر المناسبة.

ويوفر هذا البروتوكول أيضا معلومات لتقييم التغيرات التي تطرأ على الخصائص المادية لأصناف الملابس بسبب غسل الأموال ومعلومات مراقبة الجودة المتعلقة بالبروتوكول (الجدول 4 والشكل 3). هذه البيانات مفيدة لعدة أسباب. يسمح تسجيل الاتجاهات في قياسات عناصر معدات الوقاية الشخصية بتحديد عنصر به عيب تصنيعي. قد يساعد هذا التحديد في شرح البيانات الميكروبية الشاذة ووضع التباين في سلوك المنتج في سياقه. قد يوفر تدوين ملاحظات الروائح أو التلف أيضا مؤشرا على ما إذا كانت الغسالة أو المجفف تعمل على النحو الأمثل أثناء التجربة وما إذا كان يجب تكرار الاختبارات أو صيانة المعدات. بالإضافة إلى ذلك، إذا كانت خطة الاختبار تتطلب دورات غسيل متعددة لنفس عنصر معدات الوقاية الشخصية، فقد تساعد البيانات في تحديد المدة التي تحافظ فيها عناصر معدات الوقاية الشخصية على سلامتها للاستخدام عند غسل الأموال. يوفر الاحتفاظ بسجل للدرجة الهيدروجينية لمحلول المنظفات تنبيها للتغيرات في مصدر المياه أو منتج المنظفات. يضمن الاحتفاظ بسجل زمني لخطوات الغسيل أن المؤقت الموجود على الغسالة والمجفف لا يسبب اختلافات في البروتوكول التجريبي.

في نهاية المطاف ، يتم استخدام هذه البيانات للإبلاغ عن فعالية التطهير لإجراء غسل الماء الساخن ضد بديل لمسببات الأمراض الفيروسية. يتم حساب فعالية تطهير الغسيل (Eqn. 1) عن طريق طرح متوسط استرداد فيروس السجل 10 من قسيمة اختبار معدات الوقاية الشخصية من متوسط استرداد فيروس السجل10 من نتائج التحكم الإيجابية لمعدات الوقاية الشخصية (الشكل 4). بالنسبة لنتائج قسيمة الاختبار التي لا يتم اكتشافها ، يتم استخدام السجل10 من حد الكشف في حساب فعالية التطهير. من الشائع الإبلاغ عن فعالية التطهير كقيم سجل للمقارنة مع تقنيات ومعايير التطهير الفيروسي الأخرى.

فعالية التطهير = متوسط السجل 10 (الضوابط الإيجابية) - متوسط السجل10 (كوبونات الاختبار) (Eqn. 1)

figure-results-1
الشكل 3. التغيير في أبعاد معدات الوقاية الشخصية حسب الموقع. Δ = قياس ما قبل الاختبار - قياس ما بعد الاختبار. تتوافق قيمة Δ السالبة مع تمدد العنصر في الموقع المحدد وتتوافق القيمة الموجبة مع الانكماش. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 4. فعالية غسل الماء الساخن في تطهير أغطية الوجه والدنيم ومواد معدات الوقاية الشخصية المقشر من Phi6. تشير النجوم إلى حدوث تطهير كامل (لا يتم اكتشافه على كوبونات الاختبار). تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (n = 3). تتوافق رسائل الموقع مع الموضع المبين في الشكل 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. وصفات الحل. المكونات والكميات اللازمة لإعداد أجار الصويا التربتيك ، مرق الصويا التربتيك ، ومحاليل مستخلص اللحم البقري. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2. مثال على جزء من ورقة نتائج التخفيف/الطلاء التسلسلي. نموذج للإبلاغ عن البيانات الميكروبية الخام. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3. تغطية الوجه النتائج الميكروبية. مثال على ورقة ملخص لبيانات وحدة تشكيل اللويحات المعالجة (PFU). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4. فرك مراقبة الجودة وسجل تقييم المواد. نموذج للإبلاغ عن معايرة مسبار الأس الهيدروجيني ، والرقم الهيدروجيني لمحلول المنظفات ، وقياسات ما قبل وبعد الغسيل ، وأوقات دورات الغسيل. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

تم تطوير هذا البروتوكول لتنفيذ اختبارات معملية منهجية لتقييم فعالية غسل التطهير الفيروسي من معدات الوقاية الشخصية / الملابس كاملة الحجم. وتحدد الإجراءات الخطوات الحاسمة لإعداد الفيروس، وتلقيح مواد الاختبار، وتقييم التغييرات التي تطرأ على المواد بسبب عملية الغسيل، وتحديد مقدار الانخفاض في الحمل الفيروسي نتيجة لعملية الغسيل (الغسيل والتجفيف في الغسالة). بالإضافة إلى ذلك، يحدد البروتوكول عينات مراقبة الجودة اللازمة لضمان عدم تحيز التجارب بسبب التلوث والقياسات/الملاحظات التي ينبغي تسجيلها لتتبع السلامة المادية لبنود معدات الوقاية الشخصية بعد دورات غسيل متعددة. تشير النتائج باستخدام Phi6 إلى أن عملية غسل الماء الساخن المستخدمة في هذا البروتوكول حققت انخفاضا أكبر من 3 سجلات في الحمل الفيروسي لجميع العينات (تغطية الوجه ، والدعك ، وسراويل الدنيم). كان تخفيض الحمل الفيروسي موحدا أيضا عبر مواقع مختلفة على معدات الوقاية الشخصية / عناصر الملابس. لإثبات تقليل 3 سجلات ، يتطلب هذا البروتوكول استخدام حمولة فيروسية عالية وعامل استقرار (مستخلص لحم البقر) قد لا يكون ممثلا لحمل التربة لجميع الحالات.

تم اختيار الغسالات الصغيرة والمجففات المدمجة لتحسين عدد التجارب المكررة التي يمكن إجراؤها في بيئة محدودة المساحة والحفاظ على تعقيم المعدات وحجم المياه المستخدمة أثناء التجارب التي يمكن لموظفي المختبر التحكم فيها. نتيجة لاستخدام الغسالة الصغيرة ، كانت خطوات الشطف يدوية مقارنة بمعظم تطبيقات غسيل المنازل المؤتمتة بالكامل. من المهم أيضا أن نتذكر أن غسل الغسالة هو السائد في البلدان المتقدمة ، ولكن غسل اليدين لا يزال يمارس في جميع أنحاء العالم15. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يتمكن البعض من الوصول إلى الماء الساخن للغسيل ، والبعض الآخر يدويا تجفيف الملابس بالهواء بدلا من التجفيف في الماكينة. لم يتم تناول هذه الاختلافات في ممارسات غسل الأموال في هذا البروتوكول الحالي ولكن يمكن التحقيق فيها بسهولة مع تعديلات طفيفة مثل استبدال خطوات الغسيل والتجفيف باستخدام دلو وخط قريب.

كان هناك تركيز ضئيل على تنظيف/تطهير أغطية الوجه الملوثة فيروسيا وملابس الشوارع في الأدبيات العلمية على نطاق واسع. أكثر شيوعا ، تقيم الدراسات أداء الترشيح لأغطية الوجه بعد الغسيل والتجفيف المتكرر ولكنها لا تقيم فعالية التطهير الفيروسي27,28. على سبيل المثال ، قام Clapp et al. بتقييم كفاءة الترشيح المجهزة للأقنعة القماشية وأقنعة الإجراء المعدلة ووجدوا تباينا واسعا في الأداء ، مع تعديلات بسيطة توفر زيادة في الملاءمة وكفاءة الترشيح29. نظرت دراسة أخرى في كفاءة الترشيح لأربعة أقنعة قماشية من مواد مختلفة30 ، مع التركيز مرة أخرى على التحكم في المصدر أو الحماية الشخصية. قد يكون هذا بسبب نقص التخصص لكل من الجزء الميكروبي والاختبارات الميكانيكية في نفس المختبر. يوفر البروتوكول المعروض هنا تقييما لفعالية التطهير وكذلك تدهور المواد.

كان هناك عدد من طرق إزالة التلوث / التطهير لحماية الجهاز التنفسي التي يمكن التخلص منها (في المقام الأول N95s) التي نشرت مؤخرا في الأدبيات العلمية31،32،33. ويرجع التركيز الأساسي على FFRs (على سبيل المثال ، N95s) إلى الحماية التنفسية الحرجة التي توفرها للعاملين في مجال الرعاية الصحية وغيرها من المهن في الخطوط الأمامية. وشملت التكنولوجيات الأولية لإزالة التلوث من أجهزة التنفس التنفس تبخير بيروكسيد الهيدروجين (VHP)، والأشعة فوق البنفسجية المبيدة للجراثيم (UVGI)، والحرارة الرطبة (البخار) لتعطيل الفيروس. وقام فيسكوسي وآخرون بتقييم خمس طرق لإزالة التلوث من أجل FFRs وUVGI؛ تم العثور على أكسيد الإيثيلين و VHP لتكون أكثر طرق إزالة التلوث الواعدة31. قام فيشر وآخرون بتقييم أربع طرق مختلفة لإزالة التلوث - ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، والحرارة الجافة ، والإيثانول بنسبة 70٪ ، و VHP - لقدرتها على تقليل التلوث باستخدام SARS-CoV-2 وتأثيرها على وظيفة جهاز التنفس N9532. هناك العديد من الدراسات الإضافية حول تقنيات إزالة التلوث الفعالة ل FFRs التي تم تلخيصها ونشرها في 202033. ومع ذلك ، لا يمكن الوصول إلى هذه الأساليب المتخصصة أو تصميمها لاستخدامها بأمان من قبل صاحب المنزل العادي أو الأعمال الصغيرة.

تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام Phi6 ، وهي بكتيريا مغلفة تشبه SARS-CoV-2 ، وتحتوي على بروتينات سبايك ، وهي ذات حجم مماثل (80-100 نانومتر)34 ، لجميع الاختبارات. نظرا لأن Phi6 ليس من مسببات الأمراض المعروفة ، فيمكن التلاعب به في مختبر عام للسلامة البيولوجية البيولوجية من المستوى 1 (BSL-1). قد تشير الفعالية ضد Phi6 إلى فعالية الفيروسات الأخرى المغلفة ، ومع ذلك ، فإن التحقق التجريبي لكل فيروس ذي أهمية ضروري35. وباستخدام عامل فيروسي مماثل غير مسبب للأمراض، من المأمول أن يتكرر هذا البروتوكول في مكان آخر وأن يستخدم لدراسة الأوبئة/الجوائح الفيروسية في المستقبل. قد تشمل الأبحاث المستقبلية استخدام المطهرات (مثل المبيضات) بالإضافة إلى المنظفات وبروتوكول موحد لغسل اليدين وتجفيف الخطوط.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب معروف في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

قامت وكالة حماية البيئة الأمريكية (EPA) من خلال مكتبها للبحث والتطوير بتوجيه البحث الموصوف هنا تحت EP-C-15-008 مع شركة Jacobs Technology Inc. وقد استعرضته الوكالة ولكنه لا يعكس بالضرورة آراء الوكالة. ولا ينبغي الاستدلال على أي تأييد رسمي. لا تصادق وكالة حماية البيئة على شراء أو بيع أي منتجات أو خدمات تجارية. يود المؤلفون أن يشكروا مقاولي وكالة حماية البيئة دينيس أسليت على الإشراف على علم الأحياء الدقيقة التابع لوكالة حماية البيئة RTP ، وبراين فورد ، وراشيل بارتمانز ، وليزلي منديز ساندوفال على عملهم في هذا المشروع في مختبر علم الأحياء الدقيقة التابع لوكالة حماية البيئة RTP ، ورامونا شيرمان لتوفير مراجعة ضمان الجودة لوكالة حماية البيئة ، وورث كالفي وشانون سيري لتقديم مراجعات فنية لوكالة حماية البيئة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  الفريزر (- 80 درجة ؛ ج)ThermoFisher ScientificFDE30086FA
  لوحة ساخنةVWR97042-714
  دبابيس الأمان (الصلب)Singer319921
  شاكر لاب لاين إنسترومنتس، إنك.3525
  SM bufferTeknova,  هوليستر ، كاليفورنياS0249
  ؛ مرشح الحقنة (0.2 & mu; م)Corning ، Corning ، NYPES ، 431229
1X فوسفات مخزن محلول ملحيTeknova ، Hollister ، CAP0196 ، حل 10X PBS
AgarBecton Dickinson214010
أغطية قابلة للتعقيمDWK Life Sciences ، ميلفيل ، نيوجيرسيKIM-KAP Caps ، 73663-18
AutoclaveSterisAMSCO 250LS معقم بالبخار موديل 20VS
مستخلص لحم البقرسيجما ألدريتش ، ميليبور سيجما ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةP / N B4888-100 جرام
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتشموزعات
مستهلكات مستشفى23600894
الطرد المركزيThermoFisher Scientific75004271Heraeus MegaFuge 16R مؤقت معتمد
للطرد المركزيhttps://nist.time.gov/غير قابلة للتطبيق
(50 مل)كورنينج لعلوم الحياة352098فالكون 50 مل أنابيب طرد مركزي مخروطية عالية الوضوح من مادة البولي بروبيلين
CryovialsThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MAAY509X33
DenimWranglerRustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean مع جيوب أمامية مغرفة ، PN: 87619PW
منظفاتبروكتور آند جامبلتايد منظف غسيل سائل برائحة أصلية رقم المنتج (PN): 003700023068
سكر العنبفيشرBP350
مرق معادلة دييDF0819172بيكتون ديكنسون
MCSDRY15W
أغطية الوجه من القطنفيلينا، PN: 990121P4
حاضنة (أعلى أجار)Symphony414004-596
دفتر مختبردفتر علمي Company2001
كلوريد المغنيسيومSigma-AldrichM9272
نظام تعقيم وتوزيع الوسائطIntegraMedia Clave / Media Jet
Petri Dishes (100 مم)VWR25384-342
مقياس الأس الهيدروجينيOrion / OaktonSTARA1110 / EW-35634-35
مسبار الأس الهيدروجينيOrion8157BNUMD
معايير الأس الهيدروجينيأوكتون00654- (00/04/08)
Phi 6 و Pseudomonas syringaeمعهد باتيل التذكاري ، كولومبوس ، أوهايوغير قابل للتطبيق
الماصة & نصائحRainin(Pipettes) 17014391 ، 17002921 ؛ (أطراف الماصة) 30389239 ، 17014382
ثلاجةحقيقية للتصنيع المحدودة ، Inc.GDM-33
الدعكGogreen باردPN: WS19100PT
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش57656
شريط التحريكفيشربراند16-800-512
شريط قياسLufkinPS3425
أنابيب اختبار لأجار ناعم (14 مل)حرارة
Fisherbrand14-983-19B
TryptoneSigma-AldrichT9410
أكياس تعقيم بيروكسيد الهيدروجين البخاريSTERIS62020TW
Vortex (أثناء عملية الطلاء)Daigger Scientific، Inc3030AVortex Genie 2
Vortex (لاستخراج العينة)برانسون الموجات فوق الصوتية58816-115دوامة متعددة الأنابيب
غسالةKuppetKP1040600A
غسالة التعقيمSterisSTERIS VHP ED1000 مولد
الخميرة مستخلصGibco212750
مرشحات حقنة الخلايا 793639 بوس أجهزة أنابيب مخروطية إنجلي مجفف مجفف العضوي ميزان Corning ، Corning ، NY 352059

المراجع

  1. Emanuel, E. J., et al. Fair allocation of scarce medical resources in the time of Covid-19. The New England Journal of Medicine. 382 (21), 2049-2055 (2020).
  2. Cohen, J., van der Meulen Rodgers, Y. Contributing factors to personal protective equipment shortages during the COVID-19 pandemic. Preventive Medicine. 141, 106263(2020).
  3. Burki, T. Global shortage of personal protective equipment. The Lancet Infectious Diseases. 20 (7), 785-786 (2020).
  4. Optimizing Personal Protective Equipment (PPE) Supplies. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/ppe-strategy/index.html (2020).
  5. Livingston, E., Desai, A., Berkwits, M. Sourcing personal protective equipment during the COVID-19 pandemic. Jama. 323 (19), 1912-1914 (2020).
  6. Bloomfield, S. F., Exner, M., Signorelli, C., Nath, K. J., Scott, E. A. The infection risks associated with clothing and household linens in home and everyday life settings, and the role of laundry. International Scientific Forum on Home Hygiene. , (2011).
  7. Hall, C. B., Douglas, R. G., Geiman, J. M. Possible transmission by fomites of respiratory syncytial virus. Journal of Infectious Diseases. 141 (1), 98-102 (1980).
  8. Turner, R., Shehab, Z., Osborne, K., Hendley, J. O. Shedding and survival of herpes simplex virus from 'fever blisters'. Pediatrics. 70 (4), 547-549 (1982).
  9. Bean, B., et al. Survival of influenza viruses on environmental surfaces. Journal of Infectious Diseases. 146 (1), 47-51 (1982).
  10. Brady, M. T., Evans, J., Cuartas, J. Survival and disinfection of parainfluenza viruses on environmental surfaces. American Journal of Infection Control. 18 (1), 18-23 (1990).
  11. Sidwell, R. W., Dixon, G. J., Mcneil, E. Quantitative studies on fabrics as disseminators of viruses: I. Persistence of vaccinia virus on cotton and wool fabrics. Applied Microbiology. 14 (1), 55-59 (1966).
  12. Owen, L., Shivkumar, M., Laird, K. The stability of model human coronaviruses on textiles in the environment and during health care laundering. Msphere. 6 (2), 00316-00321 (2021).
  13. Sehulster, L., et al. Guidelines for environmental infection control in health-care facilities. Recommendations from CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (HICPAC). American Society for Healthcare Engineering/American Hospital Association. , (2004).
  14. Chen, H., et al. Influence of different inactivation methods on severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA copy number. Journal of Clinical Microbiology. 58 (8), e00958(2020).
  15. Abney, S. E., Ijaz, M. K., McKinney, J., Gerba, C. P. Laundry hygiene and odor control-state of the science. Applied and Environmental Microbiology. 87 (14), 0300220(2021).
  16. COVID-19 Cleaning and Disinfecting Your Home. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/disinfecting-you-home.html (2021).
  17. COVID-19 Your Guide to Masks - How to select, properly wear, clean, and store masks. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/about-face-coverings.html (2021).
  18. Walter, W. G., Schillinger, J. E. Bacterial survival in laundered fabrics. Applied Microbiology. 29 (3), 368-373 (1975).
  19. Blaser, M. J., Smith, P. F., Cody, H. J., Wang, W. -L. L., LaForce, F. M. Killing of fabric-associated bacteria in hospital laundry by low-temperature washing. Journal of Infectious Diseases. 149 (1), 48-57 (1984).
  20. Gerhardts, A., et al. Testing of the adhesion of herpes simplex virus on textile substrates and its inactivation by household laundry processes. Journal of Biosciences and Medicines. 4 (12), 111(2016).
  21. Heinzel, M., Kyas, A., Weide, M., Breves, R., Bockmühl, D. P. Evaluation of the virucidal performance of domestic laundry procedures. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 213 (5), 334-337 (2010).
  22. Casanova, L. M., Weaver, S. R. Inactivation of an enveloped surrogate virus in human sewage. Environmental Science & Technology Letters. 2 (3), 76-78 (2015).
  23. Aquino de Carvalho, N., Stachler, E. N., Cimabue, N., Bibby, K. Evaluation of Phi6 persistence and suitability as an enveloped virus surrogate. Environmental Science & Technology. 51 (15), 8692-8700 (2017).
  24. Ye, Y., Chang, P. H., Hartert, J., Wigginton, K. R. Reactivity of enveloped virus genome, proteins, and lipids with free chlorine and UV254. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7698-7708 (2018).
  25. Bacteriology Culture Guide. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/resources/culture-guides/bacteriology-culture-guide (2022).
  26. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Bacteriophages. , Springer. 69-76 (2009).
  27. Sankhyan, S., et al. Filtration performance of layering masks and face coverings and the reusability of cotton masks after repeated washing and drying. Aerosol and Air Quality Research. 21 (11), 210117(2021).
  28. Kumar, A., Bhattacharjee, B., Sangeetha, D., Subramanian, V., Venkatraman, B. Evaluation of filtration effectiveness of various types of facemasks following with different sterilization methods. Journal of Industrial Textiles. , (2021).
  29. Clapp, P. W., et al. Evaluation of cloth masks and modified procedure masks as personal protective equipment for the public during the COVID-19 pandemic. JAMA Internal Medicine. 181 (4), 463-469 (2021).
  30. Lu, H., Yao, D., Yip, J., Kan, C. -W., Guo, H. Addressing COVID-19 spread: development of reliable testing system for mask reuse. Aerosol and air quality research. 20 (11), 2309-2317 (2020).
  31. Viscusi, D. J., Bergman, M. S., Eimer, B. C., Shaffer, R. E. Evaluation of five decontamination methods for filtering facepiece respirators. Annals of Occupational Hygiene. 53 (8), 815-827 (2009).
  32. Fischer, R. J., et al. Effectiveness of N95 respirator decontamination and reuse against SARS-CoV-2 virus. Emerging Infectious Diseases. 26 (9), 2253(2020).
  33. Derraik, J. G., Anderson, W. A., Connelly, E. A., Anderson, Y. C. Rapid review of SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 viability, susceptibility to treatment, and the disinfection and reuse of PPE, particularly filtering facepiece respirators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (17), 6117(2020).
  34. Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T., Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva microdroplets deposited on glass surfaces. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Calfee, M. W., et al. Virucidal efficacy of antimicrobial surface coatings against the enveloped bacteriophage Φ6. Journal of Applied Microbiology. 132 (3), 1813-1824 (2022).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

فعالية الغسيلمعدات الوقاية الشخصيةالعاثية Phi6مقايسة اللويحاتسلامة الموادالتقنية العقيمخفض الحمل الفيروسيعينات ضبط الجودة
تحديد فعالية التطهير الفيروسي لغسل الماء الساخن
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.