تم استزراع نباتات الشبكية التي تم الحصول عليها من المكاك البرية في المختبر. تم تحفيز تنكس الشبكية ومسار إشارات cGMP-PKG باستخدام مثبط PDE6 zaprinast. تم التحقق من تراكم cGMP في النباتات بتركيزات مختلفة من zaprinast باستخدام التألق المناعي.
مقالة منهجية
مزارع زراعة الشبكية ذات النمط العضوي من المكاك
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتميز تنكس الشبكية الوراثي (RD) بموت الخلايا المستقبلة للضوء التدريجي. يؤدي الإفراط في تنشيط مسار بروتين كيناز (PKG) المعتمد على الغوانوزين الدوري (cGMP) في الخلايا المستقبلة للضوء إلى موت الخلايا المستقبلة للضوء ، خاصة في النماذج التي تؤوي طفرات فوسفوديستراز 6b (PDE6b). استخدمت الدراسات السابقة على RD بشكل أساسي نماذج الفئران مثل الفئران rd1 أو rd10 . بالنظر إلى الاختلافات الجينية والفسيولوجية بين الفئران والبشر ، من المهم أن نفهم إلى أي مدى يمكن مقارنة شبكية العين من الرئيسيات والقوارض. تشترك المكاك في مستوى عال من التشابه الجيني مع البشر. لذلك ، تم اختيار المكاك من النوع البري (الذين تتراوح أعمارهم بين 1-3 سنوات) للاستزراع في المختبر لنباتات الشبكية التي تضمنت مركب ظهارة الشبكية والشبكية (RPE) - المشيمية. تمت معالجة هذه النباتات بتركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast للحث على مسار إشارات cGMP-PKG ومحاكاة التسبب في RD. تم التحقق لاحقا من تراكم cGMP وموت الخلايا في نباتات شبكية الرئيسيات باستخدام التألق المناعي ومقايسة TUNEL. قد يعمل نموذج شبكية العين الرئيسيات الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة على الدراسات ذات الصلة والفعالة في آليات RD المعتمدة على cGMP-PKG ، وكذلك لتطوير مناهج العلاج المستقبلية.
المقدمة
يتميز تنكس الشبكية الوراثي (RD) بموت الخلايا المستقبلة للضوء التدريجي وينتج عن طفرات في مجموعة واسعة من الجينات المسببة للأمراض1. النتيجة النهائية ل RD هي فقدان البصر وفي الغالبية العظمى من الحالات لا يزال المرض غير قابل للعلاج حتى يومنا هذا. لذلك ، من المهم دراسة الآليات الخلوية التي تؤدي إلى موت المستقبلات الضوئية باستخدام نماذج تمثل بأمانة حالة المرض البشري. هنا ، تعتبر النماذج القائمة على الرئيسيات ذات أهمية خاصة بسبب قربها من البشر. والجدير بالذكر أن مثل هذه النماذج قد تعزز تطوير التدخلات العلاجية المناسبة التي يمكن أن توقف أو تؤخر موت الخلايا المستقبلة للضوء.
أظهرت الأبحاث السابقة حول آليا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت مراجعة الدراسة على الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات التابعة لمعهد علم الحيوان ، والأكاديمية الصينية للعلوم (IACUC-PE-2022-06-002) ، ومراجعة أخلاقيات الحيوان وبروتوكول الحيوان بجامعة يونان (YNU20220149).
1. تحضير نباتات الشبكية
- احصل على مقل عيون الرئيسيات من المكاك البرية ، التي تتراوح أعمارها بين 1 و 3 سنوات ، وتخزينها في محلول تخزين الأنسجة ، ونقلها على الجليد في غضون 3 ساعات من الاستئصال بعد التضحية بالقرود أو بعد الموت الطبيعي.
- لإعداد محلول البروتيناز K ، قم بإذابة 25 ملغ من البروتيناز K في 250 ميكرولتر من الماء المقطر ، ثم أضف 225 ميكرولتر من المحلول إلى 18.5 مل من الوسط ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذه الدراسة ، تم إجراء زراعة شبكية المكاك باستخدام نباتات تحتوي على مركب شبكية العين RPE-choroid (الشكل 1 ، الشكل التكميلي S1). بالمقارنة مع الثقافة المختبرية لخلايا الشبكية التي تستخدم شبكية العين بدون RPE المرفقة والمشيمية ، فإن ثقافتنا المزروعة تسهل بقاء الخلايا بشكل أفضل وبالتالي تطيل بقاء الخلايا المستقبلة للضوء.
استخدمنا تركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast (100 μM ، 200 μM ، و 400 μM; الشكل التكميلي S2) للحث عل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يشير النقل الضوئي البصري إلى العملية البيولوجية التي يتم من خلالها تحويل الإشارات الضوئية إلى إشارات كهربائية بواسطة خلايا مستقبلات ضوئية داخل شبكية العين. الخلايا المستقبلة للضوء هي خلايا عصبية مستقطبة قادرة على الانتقال الضوئي، وهناك نوعان مختلفان من المستقبلات الضوئية تسمى القضبان والأقماع بعد أشكال أجزائها الخارجية. القضبان مسؤولة عن الرؤية السكوبية والأقماع مسؤولة عن الرؤية الضوئية والحدة العالية. يتعلق RD الوراثي بالأمراض التنكسية العصبية التي تتميز بموت الخلايا المستقبلة للضوء الشبكيةالتدريجي 15<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذه الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81960180) ، ومؤسسة تراث زينكي ، ومؤسسة شارلوت وتيستو كيرستان ، ومركز يونان الطبي السريري لأمراض العيون (ZX2019-02-01). نشكر البروفيسور Longbao Lv (معهد علم الحيوان ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، كونمينغ ، الصين) لمشاركة مقل عيون القرد المستخدمة في هذه الدراسة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | محلول حجب سيجما | B2064 | |
| مكملات الكورتيكوستيرون | سيجما | C2505 | مكملات كاملة متوسطة |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | مكملات الحمار المتوسطة الكاملة |
| المضادة للأغنام ، Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | الجسم المضاد الثانوي ل cGMP |
| محلول حمض الإيثانول الخليك | Shyuanye | R20492 | تحديد مصل |
| الأبقار السائل للجنين | الجوزاء | 900-108 | محلول حجب |
| مجهر مضان | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | تصوير التألق المناعي |
| الجلوتامين | سيجما | G8540 | مكملات الجلوتاثيون سيجما |
| G6013 | المتوسطة الكاملةمكملات كاملة متوسطة | ||
| في الموقع للكشف عن موت الخلايا ، TMR الأحمر | Roche | 12156792910 | TUNEL فحص |
| الأنسولين | Sigma | 16634 | مكملات |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | المكملات الغذائية الكاملة |
| لحمض اللينوليك | الكامل Sigma | L1012 | لتخزين أنسجة MACS المتوسط الكامل |
| الحل | Miltenyi | 130-100-008 | التخزين الأمثل لعينات الأعضاء والأنسجة الطازجة |
| مصل الحمار | العادي Solarbio | SL050 | محلول حجب |
| بارافورمالدهايد (PFA) | Biosharp | BL539A | عامل تثبيت |
| القلم. / STREP. 100 مرة ؛ | Millipore | TMS-AB2-C | البنسلين / الستربتومايسين المضادات الحيوية |
| عازلة الفوسفات (PBS) | محلول عازلة Solarbio | P1010 | |
| بوفيدون اليود | Shanghailikang | عامل | مطهر |
| 310411 البروجسترون | سيجما | P8783 | مكملات البروتيناز المتوسط |
| الكامل K | Millpore | 539480 | تكسير البروتين |
| R16 شركة | تقنيات الحياة | المتوسطة 074-90743A | مكملات |
| الريتينول | الأساسية Sigma | R7632 | مكملات كاملة |
| الريتينيل | أسيتات Sigma | R7882 | مكملات الأغنام المتوسطة الكاملة |
| المضادة ل cGMP | جان دي فينتي ، جامعة ماستريخت ، هولندا | الجسم المضاد الأساسي للسكروز | |
| cGMPGHTECH | 57-50-1 | عامل تجفيف | |
| T3 | Sigma | T6397 | مكملات من |
| وسط الأنسجة المتوسطة الكاملة (مركب OCT) | SAKURA | 4583 | تضمين مكملات |
| توكوفيريل أسيتات | متوسطة Sigma | T1157 | ترانسفيرين سيجما |
| T1283 | المتوسطة الكاملة | ||
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | زراعة الخلايا / الأنسجة |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking Buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | العامل النشط السطحي |
| VECTASHIELD Medium مع DAPI | Vector | H-1200 | متوسط |
| فيتامين B1 | Sigma | T1270 | مكملات كاملة متوسطة |
| فيتامين B12 | سيجما | V6629 | مكملات فيتامين سي متوسطة كاملة |
| سيجما | A4034 | مكملات ثاقب | |
| زابريناست | متوسط كامل سيجما | Z0878 | PDE6 |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss ، Oberkochen ، ألمانيا | مجهر مستقيم | |
| LSM 900 Airyscan | مجهر المسح الضوئي بالليزر عالي الدقة | ||
| Zeiss Axiocam | & nbsp ؛ زايس ، أوبركوتشين ، ألمانيا | الكاميرا الرقمية | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) | |||
| مقل العيون الرئيسية من المكاك من النوع البري | معهد كونمينغ لعلم | SYXK ( ) K2017 -0008 | |
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker ، Diado ، 0010 ، حل مجموعة TUNEL الياباني | |||
| (REF12156792910 ، روش ، ألمانيا) ، |
المراجع
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772(2020).
- Paquet-Durand, F.,....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن