Method Article

تشريح وظيفة الخلية المستقلة لبروتين التخلف العقلي X الهش في دائرة سمعية بواسطة التثقيب الكهربائي في Ovo

DOI:

10.3791/64187

⸱

July 6th, 2022

 ,  ,  , 
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام التثقيب الكهربائي للبويضات ، ابتكرنا طريقة لنقل الأذن الداخلية السمعية ونواة القوقعة بشكل انتقائي في أجنة الدجاج لتحقيق ضربة قاضية خاصة بمجموعة الخلايا لبروتين التخلف العقلي X الهش خلال فترات منفصلة من تجميع الدائرة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتين التخلف العقلي X الهش (FMRP) هو بروتين مرتبط بالحمض النووي الريبوزي المرسال ينظم ترجمة البروتين المحلي. يؤدي فقدان FMRP أو اختلاله الوظيفي إلى أنشطة عصبية ومشبكية شاذة في متلازمة X الهشة (FXS) ، والتي تتميز بالإعاقة الذهنية والتشوهات الحسية ومشاكل التواصل الاجتماعي. أجريت دراسات على وظيفة FMRP والتسبب في FXS في المقام الأول مع Fmr1 (الجين المشفر FMRP) بالضربة القاضية في الحيوانات المعدلة وراثيا. هنا نبلغ عن طريقة في الجسم الحي لتحديد وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP خلال فترة تجميع الدائرة والتكوين المشبكي باستخدام أجنة الدجاج. تستخدم هذه الطريقة التثقيب الكهربائي الخاص بالمرحلة والموقع والاتجاه لنظام ناقل محفز للدواء يحتوي على الحمض النووي الريبي الصغير Fmr1 (shRNA) ومراسل EGFP. باستخدام هذه الطريقة ، حققنا ضربة قاضية انتقائية FMRP في العقدة السمعية (AG) وفي أحد أهداف جذع الدماغ ، النواة المغنطيسية (NM) ، وبالتالي توفير معالجة خاصة بالمكونات داخل دائرة AG-NM. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح نمط الفسيفساء للنقل بضوابط داخل الحيوان ومقارنات الخلايا العصبية / الألياف المجاورة لتعزيز الموثوقية والحساسية في تحليل البيانات. يوفر نظام الناقل المحرض تحكما زمنيا في بداية تحرير الجينات لتقليل التأثيرات التنموية المتراكمة. يوفر الجمع بين هذه الاستراتيجيات أداة مبتكرة لتشريح وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP في تطوير المشبكي والدوائر.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

متلازمة X الهشة (FXS) هي اضطراب في النمو العصبي يتميز بالإعاقة الذهنية والتشوهات الحسية وسلوكيات التوحد. في معظم الحالات ، يحدث FXS بسبب فقدان عالمي لبروتين التخلف العقلي X الهش (FMRP ؛ مشفر بواسطة جين Fmr1) بدءا من المراحل الجنينية المبكرة1. FMRP هو بروتين ملزم للحمض النووي الريبي يتم التعبير عنه عادة في معظم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الدماغ ، وكذلك في الأعضاء الحسية2،3،4. في أدمغة الثدييات ، من المحتمل أن يرتبط FMRP بمئات من mRNAs التي تشفر البروتينات المهمة لمختلف الأنشطة العصبية5. أظهرت الدراسات التي أجريت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التعامل مع البيض وأجنة الدجاج بعناية واحترام وفقا لبروتوكولات الحيوانات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة جينان.

1. إعداد البيض والبلازميد

  1. تحضير البيض
    1. احصل على بيض الدجاج الطازج المخصب (جالوس غالوس) من جامعة جنوب الصين الزراعية وخزنه في درجة حرارة 16 درجة مئوية قبل الحضانة. للحصول على الجدوى المثلى ، ضع كل البيض للحضانة في غضون أسبوع من الوصول.
    2. ضع البيض أفقيا واحتضانه عند 38 درجة مئوية لمدة 46-48 ساعة حتى مرحلة هامبرغر وهاملتون (HH) 1225 لنقل الأنبوب العصبي ، أو لمدة 54-56 ساعة حتى HH13 لنقل الكيسة الأذنية. نظرا لأن القطب الحيواني للبيضة أخف من....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من خلال إجراء التثقيب الكهربائي للبيض في مواقع مختلفة وفي مراحل نمو مختلفة ، حققنا ضربة قاضية انتقائية FMRP إما في المحيط السمعي أو في جذع الدماغ السمعي.

ضربة قاضية FMRP في NM
تم تصميم الحمض النووي الريبي الصغير (shRNA) ضد الدجاج Fmr1 واستنساخه في نظام ناقل Tet-On كما هو موضح سابقا20. يظهر الإعداد للتثقيب الكهربائي في ovo في الشكل 1A. تم حقن الحمض النووي البلازميد الملون باللون الأخضر السريع في.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحديد وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP ، من الضروري معالجة تعبيرها في مجموعات الخلايا الفردية أو أنواع الخلايا. نظرا لأن إحدى الوظائف الرئيسية ل FMRP هي تنظيم التكوين المشبكي واللدونة ، فإن المعالجة الانتقائية لكل مكون متشابك لدائرة معينة هي شرط أساسي لفهم كامل لآلية FMRP في الاتصال المشبكي. باستخدام التثقيب الكهربائي للبيض لأجنة الدجاج ، أظهرنا طريقة لاستهداف تعبير FMRP في دائرة AG-NM ، إما في الخلايا العصبية AG قبل المشبكية أو الخلايا العصبية NM بعد المشبكي. لتحقيق ذلك ، يعد اختيا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ودعمت هذه الدراسة كل من: منحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 32000697)؛ ومنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم )؛ ومنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم )؛ ومنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم برنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (202102080139) ؛ مؤسسة قوانغدونغ للعلوم الطبيعية (2019A1515110625 ، 2021A1515010619) ؛ صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (11620324)؛ منحة بحثية من المختبر الرئيسي للطب التجديدي ، وزارة التربية والتعليم ، جامعة جينان (رقم. ZSYXM202107); صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية في الصين (21621054) ؛ ومؤسسة البحوث العلمية الطبية في مقاطعة قوانغدونغ الصينية (201911181427....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>حضانة البيض
16 درجة ؛ ثلاجة CMAGATتستخدم لتخزين البيض المخصب.
حاضنة البيضSHANGHAI BOXUNGZX-9240MBE
يجب استخدام البيض المخصبفي مزرعة جامعةفي أسبوع واحد للحصول على الجدوى المثلى.
<قوي > تحضير البلازميد < / قوي >
طرد مركزيسيجما10016
سريع أخضرSolarbioG1661اصنع محلول عمل بنسبة 0.1٪ في الماء المقطر والأوتوكلاف.
طقم الإعداد ماكسي للبلازميدQIAGEN12162قم بإذابة الحمض النووي البلازميد في المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE) ؛ طقم تحضير خال من السموم
الداخلية أسيتات الصوديومسيجما-ألدريتشS2889اصنع محلول عمل 7.5 متر في ماء خال من النوكلاز.
<قوي> التثقيب الكهربائي وإدارة الدوكسيسيكلين < / قوي>
المثقبالكهربائي BTXECM399
1 مل / 5 مل حقنةقوانغتشو كانغفولاي
تشريح المجهرCNOPTECSZM-42
DoxcyclineSigma-AldrichD9891استخدم كميات طازجة لكل جرعة وتخزينها في -20 & درجة ؛ ج.
الشعيرات الدموية الزجاجيةBEIBOBOMEIRD09100.9-1.1 مم * 100 مم
مختبر parafilmPARAFILMPM996فيلم شفاف
مجتذب الماصةمصنع أدوات تشنغدوWD-2حالة السحب: 500 درجة ؛ C ل 15 ثانية
من البلاتين elctrodesمحلية الصنعبقطر 0.5 مم ، فاصل زمني 1.5 مم.
أنبوب مطاطيسيجما ألدريتشA5177
< قوي > تشريح الأنسجة وتثبيتها < / قوي >
ملقطRWDF11020-11حجم الحافة: 0.05 * 0.01 مم
أدوات الجراحة الأخرىRWD
بارافورمالدهيدسيجما ألدريتش158127يمكن تخزين محلول PFA الطازج 4٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات في 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
SYLGARD 184 سيليكون المطاط الصناعي كيتDOW01673921بالنسبة لألواح الخلفية السوداء ، يتم تطبيق مسحوق الكربون المخصص للطعام.
<قوي> التقطيع < / قوي> Cryostat
LEICACM1850
الجيلاتينسيجما-ألدريتشG9391من جلد البقر.
انزلاق ميكروتومLEICASM2010
<قوي > تلطيخ مناعي < / قوي > Alexa
Fluor 488 الماعز المضاد للفأرAbcamab1501131: 500 التخفيف ، RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 الماعز المضاد للأرانبAbcamab1500781: 500 التخفيف ، RRID: AB_2722519
DAPIAbcamab2853901: 1000 التخفيف
Fluoromount-G تصاعد المتوسطةالجنوبية & nbsp ؛ التكنولوجيا الحيويةSb-0100-01
الجسم المضاد FMRPY. وانغ ، جامعة ولاية فلوريدا# 82631: 1000 التخفيف ، RRID: AB_2861242
الأجسام المضادة Islet-1DSHB39.3F71: 100 التخفيف ، RRID: AB_1157901
لوحة NetwellCorning3478
الأجسام المضادة للخيوط العصبيةSigma-AldrichN41421: 1000 التخفيف ، RRID: AB_477272
الأجسام المضادة بارفالبومينسيجما ألدريتشP30881: 10000 التخفيف ، RRID: AB_477329
الجسم المضاد SNAP25Abcamab660661: 1000 التخفيف ، RRID:
AB_2192052<قوي>التصوير< / قوي>
أدوبي فوتوشوببرنامجتحرير الصور
مجهر متحد البؤرLEICASP8
مجهر مجهر فلوريأوليمبوسMVX10
أوليمبوس إيمج برو بلس 7.0OlYMPUSحزمة برامج معالجة الصور التجارية
جنوب الصين الزراعية جهاز برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fragile X SyndromeFMRP KnockdownIn Ovo ElectroporationAuditory CircuitChicken EmbryoSmall Hairpin RNAEGFP ReporterAuditory GanglionNucleus MagnocellularisNeural Tube Transfection

Related Articles