مقالة منهجية

منصة لقاح الجسيمات النانوية "التوصيل والعرض" القائمة على حويصلات الغشاء الخارجي التي تعرض مجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2

DOI:

10.3791/64213

⸱

يوليو 25, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الحالي الهندسة الحيوية للحويصلات الغشائية الخارجية بأنها منصة لقاح "التوصيل والعرض" ، بما في ذلك الإنتاج والتنقية والاقتران الحيوي والتوصيف.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اجتذبت الجسيمات النانوية المحاكية بيولوجيا التي تم الحصول عليها من البكتيريا أو الفيروسات اهتماما كبيرا بالبحث والتطوير في مجال اللقاحات. تفرز الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) بشكل أساسي بواسطة البكتيريا سالبة الجرام أثناء متوسط النمو ، بقطر نانوي ونشاط مساعد ذاتي ، والذي قد يكون مثاليا لتوصيل اللقاح. عملت OMVs كنظام توصيل متعدد الأوجه للبروتينات والأحماض النووية والجزيئات الصغيرة. للاستفادة الكاملة من الخصائص البيولوجية ل OMVs ، تم استخدام OMVs المشتقة من الإشريكية القولونية المهندسة بيولوجيا كحامل ومجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2 (RBD) كمستضد لبناء منصة لقاح "التوصيل والعرض". تم تطبيق نطاقات SpyCatcher (SC) و SpyTag (ST) في Streptococcus pyogenes على OMVs و RBD المرافقين. تمت ترجمة جين Cytolysin A (ClyA) مع جين SC كبروتين اندماج بعد نقل البلازميد ، تاركا موقعا تفاعليا على سطح OMVs. بعد خلط RBD-ST في نظام عازلة تقليدي بين عشية وضحاها ، تم تشكيل الربط التساهمي بين OMVs و RBD. وهكذا ، تم تحقيق لقاح OMV متعدد التكافؤ. من خلال الاستبدال بمستضدات متنوعة ، يمكن لمنصة لقاح OMVs عرض مجموعة متنوعة من المستضدات غير المتجانسة بكفاءة ، وبالتالي منع أوبئة الأمراض المعدية بسرعة. يصف هذا البروتوكول طريقة دقيقة لبناء منصة لقاح OMV ، بما في ذلك الإنتاج والتنقية والاقتران الحيوي والتوصيف.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كمنصة لقاح محتملة ، جذبت الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) المزيد والمزيد من الاهتمام في السنوات الأخيرة 1,2. OMVs ، التي تفرزها بشكل طبيعي البكتيريا سالبة الجرام3 ، هي جسيمات نانوية كروية تتكون من طبقة ثنائية دهنية ، عادة بحجم 20-300 نانومتر4. تحتوي OMVs على مكونات بكتيرية أبوية مختلفة ، بما في ذلك المستضدات البكتيرية والأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) ، والتي تعمل كمحفزات مناعية صلبة5. بالاستفادة من مكوناتها الفريدة ، وهيكل الحويصلة الطبيعية ، ومواقع تعديل الهندسة الوراثية الرائعة ، تم تطوير OMVs للاستخدام في العديد من ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء البلازميد

  1. أدخل تسلسل SpyCatcher لترميز الحمض النووي (الملف التكميلي 1) في بلازميد pThioHisA-ClyA المقاوم للأمبيسيلين (انظر جدول المواد) بين موقعي BamH I و Sal I لبناء pThioHisA ClyA-SC البلازميد بعد تقرير منشور مسبقا20.
  2. قم بربط جين الاندماج SpyTag-RBD-Histag المركب (الملف التكميلي 1) في بلازميد pcDNA3.1 (انظر جدول المواد) بين موقعي BamH I و EcoR I لبناء pcDNA3.1 RBD-ST البلازميد بعد تقرير منشور مسبقا19.

2. إعداد OMV-SC

  1. قم بإجراء تحويل ClyA-S....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 المخطط الانسيابي لهذا البروتوكول. يمكن أن يكون هذا البروتوكول نهجا عاما لاستخدام OMVs كمنصة لقاح. يحتاج المرء فقط إلى اختيار أنظمة التعبير المناسبة بناء على نوع المستضدات.

يوفر الشكل 2 مخطط تصميم بلازميد ممكن. يرتبط جين SC بجين ClyA عبر رابط مرن ، بينما يتصل ST بالطرف 5 'من جين RBD مع جين His-tag للتنقية والتحقق. أظهرت اللطخة الغربية أن التفاعل يكتمل تدريجيا مع زيادة OMV-SC (الشكل 3 أ). بعد ا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإنشاء منصة لقاح الجسيمات النانوية "التوصيل والعرض" ، تم التعبير عن ClyA المنصهر SC في سلالات BL21 (DE3) ، والتي تعد واحدة من أكثر النماذج استخداما لإنتاج البروتين المؤتلف بسبب مزاياها في التعبير البروتيني24 ، بحيث يكون هناك ما يكفي من شظايا SC المعروضة على سطح OMVs أثناء عملية انتشار البكتيريا. في الوقت نفسه ، تم إعداد مستضد مستهدف منصهر ST للاقتران الكيميائي بين المستضدات و OMVs. تنعكس مزايا هذا المخطط التجريبي وآفاق التطبيق المستقبلي بشكل أساسي في ثلاثة جوانب. أولا ، يتم تحقيق نظام "التوصيل وال.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الرئيسي لمؤسسة تشونغتشينغ للعلوم الطبيعية (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ومشروع المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 31670936، 82041045).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أمبيسلين الصوديومسانجون التكنولوجيا الحيويةA610028
عداد الخلايا الآليCountstarBioTech
BCA مجموعة قياس البروتينcwbiocw0014s
نظام التصوير باللمس الكيميائيBio-rad
Danamic ضوء تشتتMalvernZetasizer Nano S90
جهاز الرحلان الكهربائيCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
Goat pAb to mouse IgG1Abcamab97240
جهاز طرد مركزي عالي السرعة للتجميدBioridgeH2500R
His-Tag ماوس mAbتقنية إشارات الخلية2366s
ImidazoleSangon BiotechA600277
الأيزوبروبيل بيتا D-thiogalactopyranosideسانجون التكنولوجيا الحيويةA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
الحليب المجفف الخالي من الدسمسانجون للتكنولوجيا الحيويةA600669
OPM-293 وسط زراعة الخلاياOpm Biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST البلازميدووهان جينيكريات علم
عازلة الفوسفاتملحي ZSGB-bioZLI-9061
Polyethylenimine LinearPolysciences23966-1
سلم البروتين الملونمسبقا Thermo26616
pThioHisA ClyA-SC بلازميدووهان الجينات البيولوجية علم
التكنولوجيا البيولوجية PVDF أغشية النشاف الغربيةروش03010040001
أنظمة منضدة Quixstand (عمود ألياف مجوف 100 كيلو دالتون) عازلGE للرعاية الصحية
SDS-PAGE (5x)BeyotimeP0015
كلوريد الصوديومسانجون للتكنولوجيا الحيويةA100241
Supersignal west pico PLUS (محلول تلألؤ كيميائي محسن) أداةThermo34577
تقنية الحياةHula خلاط
نقل المجهر الإلكترونيهيتاشيHT7800
التربتونأكسبودLP0042B
الطرد المركزي الفائقبيكمان كولترXPN-100
الطيف الضوئي بالأشعة فوق البنفسجيةهيتاشيU-3900
مستخلص الخميرةسانجون للتكنولوجيا الحيويةA610961
التكنولوجيا البيولوجية محلول تحميل تعليق مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
  2. Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SARS CoV 2 RBDPlug And Display PlatformOMV BioconjugationSpyCatcher SpyTagProtein PurificationUltracentrifugationTransmission Electron MicroscopyDynamic Light Scattering

مقالات ذات صلة