مقالة منهجية

نقل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون في الفئران إلى بويضات الفئران المسنة

DOI:

10.3791/64217

⸱

يناير 6, 2023

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Affiliated Hospital, Soochow University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 3Center for Reproductive Medicine and Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف عزل الميتوكوندريا عن الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون من الفئران ، ثم ننقل الميتوكوندريا إلى بويضات الفئران القديمة لتحسين جودة البويضات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بسبب انخفاض كمية ونوعية البويضات المرتبطة بالعمر ، انخفضت خصوبة النساء فوق سن 35 عاما بشكل حاد. لا تزال الآليات الجزيئية التي تحافظ على جودة البويضات غير واضحة ، وبالتالي يصعب زيادة معدل المواليد للنساء فوق سن 35 عاما في الوقت الحالي. تحتوي البويضات على ميتوكوندريا أكثر من أي نوع من الخلايا في الجسم ، ويمكن أن يؤدي أي خلل وظيفي في الميتوكوندريا إلى انخفاض جودة البويضات. في التسعينيات ، أدى نقل سيتوبلازمي البويضات إلى نجاح كبير في التكاثر البشري ولكنه كان مصحوبا بخلافات أخلاقية. من المتوقع أن تكون زراعة الميتوكوندريا الذاتية تقنية مفيدة لزيادة جودة البويضات التي انخفضت بسبب العمر. في الدراسة الحالية ، استخدمنا الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون من الفئران المسنة كمتبرع بالميتوكوندريا لزيادة جودة بويضات الفئران المسنة. سيوفر التطوير الإضافي لتكنولوجيا نقل الميتوكوندريا الذاتية علاجا جديدا وفعالا للعقم لدى النساء المسنات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحد العوامل المهمة التي تؤثر على خصوبة الإناث هو شيخوخة البويضات. انخفاض جودة البويضات هو السبب الرئيسي للعقم عند النساء المسنات. ومع ذلك ، فإن السبب الرئيسي لشيخوخة البويضات والآلية الجزيئية التي تنظم جودة البويضات لا يزالان غير واضحين. أشارت الدراسات السابقة إلى أن كلا من عدد ونوعية الميتوكوندريا يشاركان في مراقبة جودة البويضات والتطور الجنيني1،2،3. يرتبط الانخفاض في كمية ونوعية الميتوكوندريا ارتباطا وثيقا بالشيخوخة3.

بذلت العديد من المحاولات لتحسين وظيفة الميتوكوندريا في البويضات المسنة ، بما في ذلك المكملات الغذائية للميتوكوندريا ونقل الميتوكوندريا. تشمل المكملات الغذائية المعروفة والفعالة للميتوكوندريا الإنزيم المساعد Q10 (CoQ10) وحمض ألفا ليبويك (α-LA) والريسفيراترول (RSV)4. أظهرت الدراسات أن مكملات CoQ10 لا يمكن أن تحسن فقط الانخفاض المرتبط بالعمر في كمية ونوعية البويضات ، ولكن أيضا تعزز التطور الطبيعي والإباضة للبويضات5. يبطئ α-LA تدهور جودة البويضات المرتبط بالشيخوخة والنمط الظاهري الأيضي للمرضى الذين يعانون من متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS) 6،7. يمكن أن يقلل الريسفيراترول من عدد البويضات ذات المغازل غير الطبيعية وزيادة محاذاة الكروموسومات غير الصحيحة في الفئران المتقدمة في السن ، مع التأثير على التطور الجنيني بطريقة تعتمد علىالجرعة 8. ومع ذلك ، نظرا لأن التأثير السريري للمكملات الغذائية للميتوكوندريا لم يصل إلى المستويات المتوقعة ، يجب استكشاف علاجات فعالة أخرى.

تم تنفيذ المحاولة الأولى لنقل الميتوكوندريا في عام 1997. أدى نقل سيتوبلازم البويضات المانحة الصغيرة إلى البويضات المتلقية المسنة إلى تحسين جودة البويضة للمرضى المسنين ، الذين أنجبوا أطفالا أصحاء بنجاح9 ، وهو الأساس المنطقي وراء استخدام هذه التقنية. ومع ذلك ، لا يمكن تطبيق نقل السيتوبلازم للبويضات الخيفية على الممارسة السريرية لسببين رئيسيين - مشكلة عدم التجانس الجيني والقضايا التنظيمية الناجمة عن زرع الميتوكوندريا من المتبرع. أظهرت دراسة سابقة أن زرع الميتوكوندريا ذاتية الخلايا يمكن أن يحسن جودة البويضات وتطور الأجنة وخصوبة الفئران المسنة10 ، والتي لم يكن لديها مشاكل أخلاقية أو مشكلات عدم تجانس وراثي وحل بعض المشكلات الناجمة عن نقل سيتوبلازم البويضة المانحة إلى البويضات المتلقية10،11.

وفي الوقت نفسه ، كان نقل الميتوكوندريا ذاتية المنشأ متفوقا على تأثير المكملات الغذائية السابقة للميتوكوندريا على تحسين جودة البويضات11. لذلك ، فإن زرع الميتوكوندريا ذاتية المنشأ هو الخيار المناسب للتطبيق السريري لهذه التقنية12. يمكن الحصول على الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs) عن طريق تقنية طفيفة التوغل ، وهي سهلة العزل والزرع ، ويمكن أن تكون خلية "بذور" مثالية للطب التجديدي. الميتوكوندريا غنية ب ADSCs ، ولا تنخفض وظيفة الميتوكوندريا مع تقدم العمر ، مما يشير إلى أن ADSCs هي مصدر ممتاز للميتوكوندريا13،14. في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة لنقل الميتوكوندريا للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون من الفئران إلى بويضات الفئران القديمة لتحسين جودة البويضة. هذا نموذج مفيد لتقنية نقل الميتوكوندريا الذاتية ADSC البشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب على الموصوفة من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية في المستشفى الثالث التابع ، جامعة سوشو. تتبع جميع العمليات الوكالة المناسبة لرعاية واستخدامها والإرشادات الوطنية. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والأدوات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون في الفئران (ADSCs)

  1. التضحية بالفئران المسنة (10 أشهر ، بمتوسط ثلاثة) عن طريق خلع عنق الرحم تحت تخدير البنتوباربيتال الصوديوم وانقعها في كحول 75٪ لمدة 5 دقائق قبل عزل الأنسجة الدهنية.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي النقع في 75٪ من الكحول لمدة 5 دقائق إلى تقليل تلوث الخلايا الأولية بشكل فعال.
  2. قم بعمل شق 2 سم في الجلد على الأربي الثنائي ، وكشف الدهون تحت الجلد ، واستخدم الملقط لعزل الدهون تحت الجلد. اجمع الدهون الأربية الثنائية من الفئران باستخدام مقص عين معقم (تجنب قطع الأنسجة تحت الجلد). ضع الأنسجة الدهنية في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل على الجليد وانقله على الفور إلى مختبر زراعة الخلايا.
  3. انقل الأنسجة الدهنية إلى طبق مكون من 6 آبار ، واشطفه 3 مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 100 وحدة / مل من البنسلين والستربتومايسين. قم بإزالة الأوعية الدموية واللفافة الدهنية والأنسجة الضامة الموجودة أسفل الأنسجة الدهنية وقطعها إلى قطع ~ 0.5 سم × 0.5 سم × 0.5 سم.
    ملاحظة: عند عزل الخلايا الجذعية الدهنية ، غالبا ما يكون هناك تلوث للخلايا البطانية الوعائية. يمكن أن تقلل إزالة الأوعية الدموية من الأنسجة الدهنية من تلوث الخلايا البطانية الوعائية.
  4. انقل الأنسجة الدهنية المقطعة إلى نفس حجم محلول الكولاجيناز من النوع الأول (0.1٪ تركيز نهائي من النوع الأول من الكولاجيناز) وهضمه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. أضف حجما متساويا من وسط الاستزراع الكامل (وسط DMEM F-12 الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني) لتحييد الكولاجيناز من النوع الأول ، وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من الأنسجة الطافية والدهنية.
  6. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط الثقافة الكامل. قم بإزالة الأنسجة غير المهضومة عن طريق الترشيح من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق.
  7. أعد تعليق تعليق الخلية بسعة 5 مل من وسط الاستزراع الكامل واستخدم ماصة سعة 1 مل لتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل لتشكيل تعليق أحادي الخلية. تحقق من تعليق الخلية تحت المجهر عن طريق وضع كمية على مقياس كثافة الدم للتأكد من وجود خلايا مفردة فقط ، بدون أي مجاميع. أضف المعلق أحادي الخلية إلى قارورة مزرعةخلية مقاس 25 سم وزراعته في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.
  8. قم بتغيير وسط الثقافة بعد 48 ساعة. استمر في تغيير وسط الثقافة كل 2-3 أيام.
  9. بعد 7-10 أيام ، افصل الخلايا لمرور الخلايا عندما يصل التقائها إلى 80٪ -90٪. قم بإزالة وسط الثقافة الكامل واغسل الخلايا ب 2 مل من PBS. ثم أضف 2 مل من 0.05٪ تربسين / EDTA لإجراء تفكك الخلية15،16.
  10. أضف وسيط تحريض شحمي المنشأ لمدة 14 يوما للحث على تمايز ADSCs إلى adipoctyes. أضف وسط تحريض العظم لمدة 28 يوما إلى ADSCs المطلية بألواح 24 بئرا مطلية بالجيلاتين بنسبة 2٪ للحث على تمايزها إلى بانيات العظم. للتمايز العصبي ، قم بزراعة ADSCs بوسط الحث العصبي ، ثم اكتشف إييولاز خاص بالخلايا العصبية وعديد ببتيد وسيط الخيوط العصبي باستخدام التألق المناعي15.
    1. قم بتثبيت الخلايا في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بالنفاذية بنسبة 0.5٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة.
    2. بعد الحظر باستخدام 3٪ BSA في PBS ، احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد) المخففة في محلول مانع عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    3. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية لمدة 45 دقيقة ثم قم بلطخها ب DAPI لمدة 10 دقائق. ثم افحص الخلايا بالمجهر الفلوري.
  11. اجمع معلق ADSC أحادي الخلية باستخدام 0.05٪ تريبسين / EDTA ، وجهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وأعد التعليق في PBS لضبط كثافة الخلية إلى 1 × 106 / مل. قم بتقسيم تعليق الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل (100 ميكرولتر / أنبوب) وأضف أجسام مضادة أحادية النسيلة CD29 و CD90 و CD34 و HLA-DR المضادة للأرانب المضادة للفأر المسمى FITC ، بتركيز أجسام مضادة يبلغ 0.5 ميكروغرام / مل. عالج المجموعة الضابطة بنفس الحجم من الأرانب IgG FITC ، واحتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة ، واشطفه باستخدام PBS لإزالة الجسم المضاد غير المترافق. الكشف عن علامات سطح ADSC عن طريق قياس التدفقالخلوي 13.

2. عزل الميتوكوندريا عن الخلايا الجذعية الدهنية

ملاحظة: يجب إجراء جميع عمليات عزل الميتوكوندريا على الجليد.

  1. عندما تنمو ADSCs إلى كثافة 90٪ ، هضم الخلايا ب 2 مل من 0.05٪ تربسين / EDTA ، وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق ، وجمع الخلايا وعدها ، وخذ 1 × 107 خلايا لكل استخراج.
  2. أعد تعليق الخلايا في 2 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الميتوكوندريا (لتحضير المخزن المؤقت: 10 مل من 0.1 M Tris-MOPS ، 1 مل من 0.1 M EGTA / Tris ، و 20 مل من 1 M سكروز ؛ ارفع الحجم إلى 100 مل بالماء المقطر واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4) مع كوكتيل مثبط البروتياز 1x بعد الغسيل ب 2 مل من PBS المعقم ، ثم يحتضن على الثلج لمدة 5 دقائق.
  3. قم بتجانس الخلايا 20x-30x باستخدام الخالط الزجاجي (2.0 مل) وتحقق من درجة التجانس عن طريق تلطيخ الtrypan الأزرق.
    ملاحظة: يجب أن تكون نسبة الخلايا الملطخة ~ 80٪. سيؤدي التجانس المفرط إلى إتلاف بنية الميتوكوندريا.
  4. جهاز طرد مركزي تتجانس الخلية عند 600 × جم لمدة 15 دقيقة ، وخذ المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مبرد مسبقا سعة 1.5 مل ، وكرر العملية مرة واحدة.
  5. قم بجهاز الطرد المركزي للطافي عند 7,500 × جم لمدة 15 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. اغسل راسب الميتوكوندريا وأعد تعليقه عن طريق إضافة ~ 100 ميكرولتر من مخزن حقن الميتوكوندريا المبرد مسبقا (225 ملي مانيتول ، 75 ملي سكروز ، 10 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، و 5 ملي كيلو هيدروكلوريك2PO4 ، درجة الحموضة 7.2) ، بتركيز 1-5 مجم / مل (تركيز البروتين الكلي). نقل معلق الميتوكوندريا على الجليد.
  6. تحليل وظيفة ونقاء الميتوكوندريا المعزولة عن طريق تحليل مقياس التدفق الخلوي JC-1 واللطخة الغربية (VDAC1 و β-actin و Lamin B) 13.
    1. قسم الميتوكوندريا المعزولة إلى ثلاث مجموعات: ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، و JC-1 ملطخ ، و JC-1 ملطخ بمعالجة مسبقة ب 30 دقيقة من الكربونيل سيانيد 3-كلوروفينيل هيدرازون (CCCP).
    2. بعد الطرد المركزي عند 7,500 × جم ، تخلص من المادة الطافية المخزن المؤقت.
    3. التقط شدة التألق لمونومرات JC-1 (قناة FITC) والمجاميع (قناة PE) التي تم التقاطها بواسطة قياس التدفق الخلوي. قم بتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا المعزولة عن طريق قياس نسب متوسط شدة التألق لقناة PE إلى قناة FITC.
      ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه في الظلام.

3. التحفيز الفائق للمبيض

  1. حقن أنثى الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 10 أشهر داخل الصفاق مع 10 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية لمصل الفرس الحامل (PMSG) للإباضة الزائدة. بعد 48 ساعة, حقن 10 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (قوات حرس السواحل الهايتية) داخل الصفاق.
  2. بعد 13 ساعة من حقن قوات حرس السواحل الهايتية، قم بتمزيق قناة فالوب المتورمة باستخدام ملاقط مجهرية. حرر المجمعات الركامية من قناة فالوب المتورمة. قم بإذابة الخلايا الركامية في وسط M2 مع الهيالورونيداز (0.3 مجم / مل) عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: وقت الذوبان أقل من 5 دقائق. قلل من الوقت الذي يتعرض فيه المركب الركامي للهيالورونيداز ، حيث يمكن أن يؤدي التعرض لفترات طويلة إلى إضعاف إمكانات نمو البويضات.

4. نقل الميتوكوندريا مع الحقن المجهري

  1. ضع المنوية بدون ذيل في سائل الميتوكوندريا. الحصول على المنوية بدون ذيل عن طريق القطع باستخدام الموجات فوق الصوتية17. ضع المنوية بدون ذيل في سائل الميتوكوندريا ، بحيث يوجد 100 منوي في 50 ميكرولتر من سائل الميتوكوندريا.
    ملاحظة: نظرا لأن معلق الميتوكوندريا لزج قليلا وغير مستقر في المختبر ، فأكمل الحقن في غضون 30 دقيقة وقم بتغيير إبرة الحقن المجهري على الفور عندما تصبح مسدودة. القطر الداخلي الأمثل لإبرة الحقن المجهري هو 5 ميكرومتر.
  2. حقن ~ 2 لول من عازلة تنفس الميتوكوندريا أو تعليق الميتوكوندريا مع المنوية في البويضات باستخدام حاقن دقيق تحت مجهر مقلوب (200x ؛ انظر جدول المواد) في غضون 30 دقيقة وفقا لبروتوكول Hiramoto كما هو موضح من قبل Mehlmann و Kline10،18.
    ملاحظة: يمثل معلق الميتوكوندريا المحقون 1٪ -3٪ من الحجم الكلي للبويضات. التحكم في حجم (1٪ -3٪) من تعليق الميتوكوندريا في السيتوبلازم لضمان اتساق الحقن.
  3. بعد الحقن ، ضع البويضات المخصبة في وسط M2 لتحقيق التوازن لمدة 15 دقيقة ، وانقل البويضات المخصبة الباقية إلى وسط زراعة M16.
  4. افحص البويضات الخصبة الباقية من خلال مراقبة التشكل السلس ، والتكوين النووي ، وإطلاق الجسم القطبي الثاني19. مراقبة الأجنة وتصويرها وعدها في الساعة 09:00 صباحا و 06:00 مساء كل يوم لمدة 4 أيام. أخيرا ، قم بجمع وتجميد الأكياس الأريمية وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية لتحديد رقم نسخة ATP و mtDNA لتقييم عدد وتحسين زرع الميتوكوندريا.
    1. قم بإعداد البلازميد القياسي (البلازميد للقياس الكمي المطلق ، كما هو موضحسابقا 13) ، لتحديد رقم نسخة الميتوكوندريا وفقا لرقم النسخة 1 × 107 و 1 × 106 و 1 × 105 و 1 × 104 و 1 × 103 و 1 × 102 و 1 × 101. انقل الأجنة إلى أنبوب التعقيم وأضف 20 ميكرولتر من محلول المحللة لتحرير الحمض النووي للميتوكوندريا. بعد ذلك ، قم بإلغاء تنشيط البروتياز في المحللة عند 55 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. حدد رقم نسخة mtDNA عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري باستخدام الإعداد التالي: 5 ميكرولتر من مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، 0.5 ميكرولتر من B6 التمهيدي إلى الأمام ، 0.5 ميكرولتر من B6 التمهيدي ، 2 ميكرولتر من منتج الانحلال الحراري ، و 2 ميكرولتر من ddH2O. اتبع شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): المرحلة 1 ، 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ المرحلة 2 ، 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ كرر الدورة 40x.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، قمنا بعزل وتمييز ADSCs من دهون الفئران (الشكل 1). للحصول على الميتوكوندريا المعزولة ، يجب تعطيل غشاء الخلية باستخدام الخالط الزجاجي. (الشكل 2 أ). من المهم الحصول على جزء ميتوكوندريا موحد بدون كتل كبيرة حتى لا يتم حظر أنبوب الحقن المجهري. أولا ، 200 ميكرولتر ، ثم 10 ميكرولتر ، يجب استخدام أطراف الماصة لإعادة تعليق المتجانسات برفق ؛ أخيرا ، يجب استخدام إبرة 29 جم للشفط ببطء مرتين أو ثلاث مرات للحصول على مكونات الميتوكوندريا التي يمكن استخدامها ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي البويضات على ميتوكوندريا أكثر من أي نوع من الخلايا في الجسم ، مع ~ 1-5 × 10 5أرقام نسخ mtDNA. الميتوكوندريا ضرورية لنضج البويضات والتخصيب والتطور الجنيني ، وبالتالي ، فإن أي خلل وظيفي في الميتوكوندريا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض جودة البويضات. يرتبط انخفاض كمية الميتوكوندريا وجودتها ارتباطا وثيقا بالشيخوخة الفسيولوجية. في هذا البروتوكول ، تم تقديم طريقة بسيطة لعزل الميتوكوندريا عن ADSCs للفئران المسنة ونقلها إلى بويضات الفئران القديمة لمحاولة تحسين جودة البويضات القديمة.

...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في الإعراب عن تقديرهم للدعم المقدم من المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (82001629 إلى XQS) ، ومشروع البحث الأساسي لمكتب تشانغتشو للعلوم والتكنولوجيا بموجب المنحة رقم CJ20200110 (إلى YJAY) ، وبرنامج الشباب لمؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20200116 إلى XQS) ، وتمويل أبحاث ما بعد الدكتوراه في مقاطعة جيانغسو (2021K277B إلى X ، س.س.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ تريبسين / EDTAGibco25300054زراعة الخلايا
  ؛ 4٪ بارافورمالدهايدبيوتيمP0099التألق المناعي
40 & مصفاة الخلايا mCorning352340ADSC عزل
الحث الشحميCyagenHUXXC-90031التمايز متعدد الاتجاهات
محلول تلطيخ أحمر أليزارينSigmaA5533للتمايز متعدد الاتجاهات
ضد CD29BD Biosciences558741تحليل التدفق
الجسم المضاد ضد CD34BD Biosciencesتحليل تدفق 560942
الأجسام المضادة ضد CD90BD Biosciences553016تحليل
التدفق الجسم المضاد ضد HLA-DRBD Biosciences555560تحليل
التدفق & بيتا - أكتينAbcamab-8226اختبار وظيفة الميتوكوندريا
BSASigmaV900933التألق المناعي
CCCPSolarbioC6700الميتوكوندريا JC-1 تحليل التدفق
ChamQ العالمي SYBR qPCR Master MixVazymeQ711qPCR
collagenase النوع الأولSigmaSCR103ADSC عزل
DAPI  InvitrogenD1306التألق المناعي
DMEM-F12Gibco11320033ثقافة الخلايا
DMSOSigma276855الميتوكوندريا JC-1 تحليل
التدفق EGTASigma324626عزل الميتوكوندريا
FBSGibco10100147قياس تدفق ثقافة الخلايا
BD BiosciencesFACSCanto & تجر; IIخصائص مجهر مضان ADSCs
leicaDM2500الجيلاتين المناعي
Sigma48722زجاجي متعدد الاتجاهات
SangonF519062عزل الميتوكوندريا
hCGAibeiM2520التحفيز الفائق للمبيض
هيالورونيدازسيجماH1115000التحفيز الفائق للمبيض
  المجهر المقلوبأوليمبوسIMT-2
تلطيخ الميتوكوندريا المعزولSigmaCS0760تدفق الميتوكوندريا JC-1
SigmaT4069اختبار وظيفة الميتوكوندريا
KClSigmaP5405نقل الميتوكوندريا
KH2PO4SigmaP5655نقل
الميتوكوندرياLaminBAbcamab-16048اختبار وظيفة الميتوكوندريا
M16 متوسطسيجماM7292ثقافة خلايا الجنين
M2 متوسطسيجماM7167ثقافة خلايا الجنين
مانيتولسيجماM9546نقل الميتوكوندريا
حاقن ميكروأوليمبوس + إيبندورفIX73نقل الميتوكوندريا
MitoTracker أحمرInvitrogenM22425تلطيخ الميتوكوندريا
MOPSSigmaM1442عزل الميتوكوندريا
الخيوط العصبية عديد الببتيد (NFM)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةsc-16143التمايز متعدد الاتجاهات
الحث العصبيGibcoA1647801التمايز متعدد
الاتجاهات إييولاز النوعي للخلايا العصبية (NSE)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-292097التمايز متعدد الاتجاهات
أحمر OSangonE607319زيت التمايز الأديبوجيني
الأحمر O الحلSigmaO1516التمايز متعدد الاتجاهات تحريض
العظمCyagenHUXXC-90021التمايز متعدد الاتجاهات
PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)HycloneSH30256.LSزراعة الخلايا
البنسلين والستربتومايسينهيكلونSV30010ثقافة الخلايا
PMSGAibeiM2620الفائق التحفيز المبيض
SigmaP8340عزل الميتوكوندريا
السكروزسيجماV900116عزل الميتوكوندريا
تريسسيجما648314عزل الميتوكوندريا
Tris-HClSigma108319نقل الميتوكوندريا
Triton X-100beyotimeP0096التألق المناعي
VDACAbcam ab-14734اختبار وظيفة الميتوكوندريا
الجسم المضاد أنبوب تجانس طقم بالحقن الدقيق تحليل وسيط زيت كوكتيل مثبط البروتياز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sheng, X., et al. The mitochondrial protease LONP1 maintains oocyte development and survival by suppressing nuclear translocation of AIFM1 in mammals. eBioMedicine. 75, 103790(2022).
  2. Qi, L., et al. Mitochondria: the panacea to improve oocyte quality. Annals of Translational Medicine. 7 (23), 789(2019).
  3. Babayev, E., Seli, E. Oocyte mitochondrial function and reproduction. Current Opinion in Obstettrics & Gynecology. 27 (3), 175-181 (2015).
  4. Bentov, Y., Esfandiari, N., Burstein, E., Casper, R. F. The use of mitochondrial nutrients to improve the outcome of infertility treatment in older patients. Fertility and Sterility. 93 (1), 272-275 (2010).
  5. Ben-Meir, A., et al. Coenzyme Q10 restores oocyte mitochondrial function and fertility during reproductive aging. Aging Cell. 14 (5), 887-895 (2015).
  6. He, Y., Wang, Y., Zhang, H., Zhang, Y., Quan, F. Alpha-lipoic acid improves the maturation and the developmental potential of goat oocytes in vitro. Reproduction in Domestic Animals. 56 (4), 545-554 (2021).
  7. Gunalan, E., Yaba, A., Yilmaz, B. The effect of nutrient supplementation in the management of polycystic ovary syndrome-associated metabolic dysfunctions: A critical review. Journal of the Turkish German Gynecological Association. 19 (4), 220-232 (2018).
  8. Liu, M., et al. Resveratrol protects against age-associated infertility in mice. Human Reproduction. 28 (3), 707-717 (2013).
  9. Cohen, J., Scott, R., Schimmel, T., Levron, J., Willadsen, S. Birth of infant after transfer of anucleate donor oocyte cytoplasm into recipient eggs. Lancet. 350 (9072), 186-187 (1997).
  10. Wang, Z. B., et al. Transfer of autologous mitochondria from adipose tissue-derived stem cells rescues oocyte quality and infertility in aged mice. Aging. 9 (12), 2480-2488 (2017).
  11. Mobarak, H., et al. Autologous mitochondrial microinjection; a strategy to improve the oocyte quality and subsequent reproductive outcome during aging. Cell & Bioscience. 9, 95(2019).
  12. Bagheri, H. S., et al. Mitochondrial donation in translational medicine; from imagination to reality. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 367(2020).
  13. Sheng, X., et al. Mitochondrial transfer from aged adipose-derived stem cells does not improve the quality of aged oocytes in C57BL/6 mice. Molecular Reproduction & Development. 86 (5), 516-529 (2019).
  14. Arana, M., Mazo, M., Aranda, P., Pelacho, B., Prosper, F. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, and characterization. Methods in Molecular Biology. 1036, 47-61 (2013).
  15. Yang, Y., Zhang, C., Sheng, X. Isolation and culture of three kinds of umbilical cord mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (186), e64065(2022).
  16. Yang, Y., et al. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on a collagen scaffold improves ovarian function in a premature ovarian failure model of mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 55 (4), 302-311 (2019).
  17. Ward, M. A., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), (2018).
  18. Rinaudo, P., et al. Microinjection of mitochondria into zygotes creates a model for studying the inheritance of mitochondrial DNA during preimplantation development. Fertility and Sterility. 71 (5), 912-918 (1999).
  19. Arroyo, G., et al. Pronuclear morphology, embryo development and chromosome constitution. Reproductive Biomedicine Online. 20 (5), 649-655 (2010).
  20. Gosden, R. G., Johnson, M. H. Can oocyte quality be augmented. Reproductive Biomedicine Online. 32 (6), 551-555 (2016).
  21. Su, J., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells combined with collagen scaffolds restores ovarian function in a rat model of premature ovarian insufficiency. Human Reproduction. 31 (5), 1075-1086 (2016).
  22. Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), 115963(2014).
  23. Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة