مقالة منهجية

تحليل التدفق الخلوي للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم لنخاع عظم الفئران والخلايا المتخصصة اللحمة

DOI:

10.3791/64248

⸱

سبتمبر 28, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا لعزل وتلطيخ خلايا نخاع عظم الفئران إلى النمط الظاهري للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية جنبا إلى جنب مع الخلايا الجذعية البطانية والوسيطة المتخصصة. كما يتم تضمين طريقة لإثراء الخلايا الموجودة في مناطق نخاع العظم الداخلية والمركزية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نخاع العظم (BM) هو النسيج الرخو الموجود داخل العظام حيث يحدث تكون الدم ، وهي العملية التي يتم من خلالها توليد خلايا دم جديدة ، بشكل أساسي. على هذا النحو ، فإنه يحتوي على الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) ، بالإضافة إلى دعم الخلايا اللحمية التي تساهم في صيانة وتنظيم HSPCs. اضطرابات الدم وغيرها من اضطرابات BM تعطل تكون الدم من خلال التأثير على الخلايا المكونة للدم مباشرة و / أو من خلال تغيير مكانة BM. هنا ، نصف طريقة لدراسة تكون الدم في الصحة والأورام الخبيثة من خلال تحليل النمط الظاهري للفئران BM HSPCs ومجموعات اللحمة المتخصصة عن طريق قياس التدفق الخلوي. توضح طريقتنا بالتفصيل الخطوات المطلوبة لإثراء خلايا BM في أجزاء BM الداخلية والمركزية ، بالإضافة إلى استراتيجيات البوابات المناسبة لتحديد نوعين رئيسيين من الخلايا المتخصصة المشاركة في تنظيم HSPC ، الخلايا البطانية والخلايا الجذعية الوسيطة. يمكن دمج تحليل النمط الظاهري المقترح هنا مع طفرات الفئران ونماذج الأمراض والمقايسات الوظيفية لتوصيف حجرة HSPC ومكانتها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس التدفق الخلوي هو طريقة لا تقدر بثمن لتوصيف وعزل الخلايا المناعية والمكونة للدم بشكل مستقبلي. كما يتم استخدامه بشكل متزايد لتحليل المجموعات اللحمية والظهارية للأنسجة المختلفة. تتميز الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) بخصائص فريدة من نوعها للتجديد الذاتي وتعدد القدرات. في الثدييات البالغة ، توجد HSCs بشكل أساسي في نخاع العظم (BM) ، حيث تتلقى إشارات الهدوء والبقاء على قيد الحياة من البيئة المكروية المحيطة أو المتخصصة1. يتم تعريف HSCs رسميا وفقا للمقايسات الوظيفية2. ومع ذلك ، فقد أظهرت العديد من الأوراق التاريخية فائدة قياس التدفق الخلوي لتحديد HSCs. من خلال استخدام علامات سطح الخلية المحدودة ، من الممكن التمييز بين المجموعات المكونة للدم التي يتم إثراؤها بشكل كبير في HSCs3. وبالتالي ، فإن قياس التدفق الخلوي هو طريقة مركزية في مجال الخلايا الجذعية. وقد تم استخدامه على نطاق واسع لتقييم تأثير أنواع الخلايا المتخصصة المفترضة والعوامل المتخصصة على HSCs. من خلال الجمع بين قياس التدفق الخلوي والتصوير والمقايسات الوظيفية ، فقد ثبت أن HSCs مدعومة بشكل حاسم من قبل الخلايا الجذعية الوسيطة المحيطة بالأوعية الدموية (MSCs) والخلايا البطانية (ECs). BM MSCs هي مجموعة غير متجانسة ولها مساهمات مختلفة في السيتوكين4 ، ولكن من الثابت أن مستقبلات اللبتين (LepR) + MSCs هي خلايا متخصصة رئيسية1. BM ECs هي أيضا غير متجانسة للغاية ويمكن أن تكون جزءا من الجيوب الأنفية والشرايين والأوعية الانتقاليةمن النوع H / 5. وقد أظهرت دراسات مختلفة المساهمة الدقيقة لهذه ECs المختلفة. على سبيل المثال ، تكون ECs الجيوب الأنفية الداخلية أقرب مكانيا إلى HSCs6 الهادئة ، في حين أن HSCs غير المهاجرة ذات المستويات المنخفضة من أنواع الأكسجين التفاعلية تقع بالقرب من ECsالشريانية 7. كما أن الموقع الداخلي مقابل الموقع المركزي للمنافذ مهم جدا. ترتبط الأوعية الداخلية من النوع H بالخلايا اللحمية المحيطة بالأوعية الدموية التي تضيع مع تقدم العمر ، مما يؤدي إلى فقدان HSCs8. في سرطان الدم النخاعي الحاد ، يتم توسيع ECs المركزية ، في حين يتم فقدان الأوعية الداخلية و HSCs endosteal9.

ركزت معظم الدراسات في هذا المجال على تكون الدم نفسه وعلى التنظيم الخارجي للخلية ل HSCs. ومع ذلك ، فقد تم الاعتراف بشكل متزايد بأن هناك حاجة إلى توصيف أفضل للمنافذ التي تنظم السلف الأخرى ، وهي السلف متعدد القدرات (MPPs) ، لا سيما بالنظر إلى أنها المحركات الرئيسية لتكوين الدم في الحالةالمستقرة 10. على النقيض من الهيكل الهرمي الثابت ، أظهرت الدراسات الحديثة أن تكون الدم هو سلسلة متصلة تتمايز فيها HSCs إلى MPPs متحيزة في مرحلة مبكرة11. تمت تسمية MPPs على اسم مخططات تصنيف مختلفة12 ، لكن ورقة إجماع حديثة من قبل الجمعية الدولية لأمراض الدم التجريبية (ISEH) اقترحت تمييز MPPs على أنها MPPs مبكرة ووفقا لتحيز اللمفاويات (MPP-Ly) وخلايا النواة والكريات الحمر (MPP-Mk / E) والنخاعي (MPP-G / M) 13. سيكون استخدام قياس التدفق الخلوي أمرا بالغ الأهمية في مواصلة دراسة أهمية منافذ BM في تنظيم هذه المجموعات السكانية. تستخدم طرق قياس التدفق الخلوي الحالية استراتيجيات بوابات متغيرة للتمييز بين HSPCs وتحديد الخلايا اللحمية ، أي ECs ، باستخدام علامات غير متسقة. الهدف من الطريقة الحالية هو تقديم سير عمل بسيط وقابل للتكرار لتلطيخ BM لتحديد المجموعات السكانية الفرعية HSPC ، والمجموعات غير المتجانسة من ECs ، و LepR + MSCs. نعتقد أن هذه التقنية ، على الرغم من مقارنتها بالطرق المبلغ عنها سابقا (انظر ، على سبيل المثال ، المرجع 14) ، توفر بروتوكولا محدثا وسهل التنفيذ لتحليل النمط الظاهري للخلايا المكونة للدم في منطقتي النخاع الوظيفيتين ، endosteal و BM المركزي BM 8,15 ، وكذلك الخلايا المتخصصة اللحمية BM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إيواء الحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول في منشأة الحيوانات i3S في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في دورة 12 ساعة من الضوء والظلام وبيئة يتم التحكم في درجة حرارتها. تم توفير حرية الوصول إلى طعام القوارض القياسية والمياه. تلقت جميع الحيوانات رعاية إنسانية وفقا للمعايير التي حددها اتحاد جمعيات علوم المختبر الأوروبية لرعاية المختبر والتعامل معها (توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 / EU). تمت الموافقة على الإجراء التجريبي الذي تم إجراؤه على الحيوانات (القتل الرحيم) من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان i3S (المرجع DD_2019_15) و Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. يمكن العثور على تفاصيل المواد المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد.

1. إعداد الحلول وتلطيخ الكوكتيلات

  1. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): قم بإذابة خمسة أقراص PBS في 1 لتر من الماء المقطر. يحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. PBS 2٪ مصل بقري جنيني (FBS): أضف 10 مل من FBS إلى 500 مل من PBS. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  3. محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) (1x): أضف 50 مل من 10x محلول تحلل كرات الدم الحمراء إلى 450 مل من الماء منزوع الأيونات. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  4. كولاجيناز الوريدي ومحلول ديسباز II: يذوب 30 ملغ من كولاجيناز IV و60 ملغ من ديسباز II في 30 مل من HBSS لمحلول كولاجيناز IV 1 ملغ/مل ومحلول ديسباز II عيار 2 ملغ/مل. تحضير طازجة قبل الاستخدام.
  5. محلول حجب مستقبلات Fc: أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد المنقى CD16 / 32 المضاد للفأر إلى 490 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS. تحضير طازجة أو في اليوم السابق. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  6. محلول تلطيخ صبغة صلاحية الخلايا الفلورية: أضف 2 ميكرولتر من صبغة صلاحية الخلايا الفلورية إلى 1 مل من برنامج تلفزيوني. تحضير طازجة قبل الاستخدام.
  7. كوكتيل نسب البيوتين: امزج 100 ميكرولتر من كل من الأجسام المضادة التالية: البيوتين المضاد للفأر CD3ε ، البيوتين المضاد للفأر CD4 ، البيوتين المضاد للفأر CD8a ، البيوتين المضاد للفأر / CD11b البشري ، البيوتين المضاد للفأر / CD45R / B220 البشري ، البيوتين المضاد للفأر Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) ، والبيوتين المضاد للفأر TER-119 / خلايا الإريثرويد. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  8. كوكتيل التلوين الأساسي HSCs: أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل نسب البيوتين ، و 10 ميكرولتر من 510 CD150 المضاد للفأر (SLAM) ، و 10 ميكرولتر من فيكوريثرين (PE) المضاد للفأر Flk2 (CD135) ، و 10 ميكرولتر من بروتين بيريدينين كلوروفيل (PerCP) المضاد للفأر Ly-6A / E (Sca-1) ، و 10 ميكرولتر من PE / Cyanine7 المضاد للفأر CD48 ، و 10 ميكرولتر من الألوفيكوسيانين (APC) / Cyanine7 المضاد للفأر CD117 (c-kit) إلى 940 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS. تحضير طازجة أو في اليوم السابق. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية محميا من الضوء حتى الاستخدام.
  9. كوكتيل تلطيخ أولي ستروني: أضف 5 ميكرولتر من الجسم المضاد للبتين R للفأر ، و 6.7 ميكرولتر من الجسم المضاد للإندوموسين المضاد للفأر PE ، و 10 ميكرولتر من PerCP المضاد للفأر Ly-6A / E (Sca-1) ، و 4 ميكرولتر من PE / Cyanine7 المضاد للفأر CD31 ، و 10 ميكرولتر من APC / Cyanine7 المضاد للفأر CD45 ، و 10 ميكرولتر من خلايا APC / Cyanine7 المضادة للفأر TER-119 / erythroid إلى 954 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS. تحضير طازجة أو في اليوم السابق. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية محميا من الضوء حتى الاستخدام.
  10. HSCs / محلول تلطيخ ثانوي انسجة: أضف 1 ميكرولتر من APC streptavidin إلى 1 مل من PBS 2٪ FBS. تحضير طازجة أو في اليوم السابق. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية محميا من الضوء حتى الاستخدام.
  11. كوكتيل تلطيخ ECs: أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد لبطانة الرحم PE المضاد للفأر ، و 10 ميكرولتر من PerCP المضاد للفأر Ly-6A / E (Sca-1) ، و 10 ميكرولتر من PE / Cyanine7 المضاد للماوس CD31 ، و 10 ميكرولتر من Alexa Fluor 647 المضاد للماوس CD54 / ICAM-1 ، و 10 ميكرولتر من APC / Cyanine7 المضاد للماوس CD45 ، و 10 ميكرولتر من خلايا APC / Cyanine7 المضادة للفأر TER-119 / erythroid إلى 940 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS. تحضير طازجة أو في اليوم السابق. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية محميا من الضوء حتى الاستخدام.
  12. محلول تلطيخ DAPI: أضف 1 قطرة من كاشف DAPI إلى 500 ميكرولتر من PBS. تحضير طازجة قبل الاستخدام.

2. استخراج العينة

  1. القتل الرحيم للحيوان عن طريق خلع عنق الرحم (يمكن العثور على تفاصيل الحيوانات المستخدمة لإنتاج البيانات المقدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي 1). ضع الحيوان مع البطن على طبق بتري ورشه بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بعمل قطع فوق البطن باستخدام المقص واسحب الجلد بعيدا حتى الكاحلين.
  2. أمسك بساق واحدة ، وباستخدام المقص ، قم بقصها في قاعها (حيث يوجد المفصل بين الساق والورك) لفصلها عن الحيوان. ستكون هذه الخطوة أيضا بمثابة طريقة تأكيدية ثانوية للقتل الرحيم. إزالة القدم من الساق عن طريق قطع في الكاحل. ضع الساق في برنامج تلفزيوني بارد مثلج 2٪ FBS. إذا لزم الأمر ، كرر الخطوة مع الساق الأخرى.
  3. الاستيلاء على عظم الورك ، واستخدام مقص قطع خلفه لفصله عن الحيوان. ضع عظم الورك في برنامج تلفزيوني بارد مثلج 2٪ FBS. إذا لزم الأمر ، كرر الخطوة مع عظم الورك الآخر.
  4. ضع الساق (الساقين) وعظم (عظم) الورك في طبق بتري ، وباستخدام مشرط معقم ، نظف العظام. افصل الساق وعظم الفخذ عن طريق قطع الركبة بالمشرط. ضع العظام النظيفة في برنامج تلفزيوني بارد مثلج 2٪ FBS.

3. معالجة العينات لتحليل مجموعات الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم الكلي

  1. ضع عظم الفخذ أو الساق في هاون مع الثلج البارد PBS 2٪ FBS وسحق العظم عن طريق الضغط عليه برفق على جدار الهاون باستخدام المدقة. يتم إطلاق خلايا BM في المحلول الموجود في الهاون.
  2. ماصة تعليق الخلية الناتج لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 10 مل للتجانس والنقل إلى أنبوب 50 مل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر موضوعة أعلى الأنبوب.
  3. إذا كانت العظام المسحوقة لا تبدو بيضاء في هذه المرحلة ، أضف المزيد من PBS 2٪ FBS إلى الهاون وكرر التكسير ، ثم ماصة لأعلى ولأسفل وانقل المحلول إلى نفس الأنبوب سعة 50 مل من خلال نفس مصفاة الخلايا 40 ميكرومتر.
  4. اشطف الهاون ببعض PBS 2٪ FBS وانقل المحلول إلى نفس الأنبوب سعة 50 مل من خلال نفس مصفاة الخلايا 40 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي أنبوب 50 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء (1x) عند RT عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. بعد حضانة لمدة دقيقتين في RT ، أضف 15 مل من PBS 2٪ FBS.
  6. جهاز طرد مركزي أنبوب 50 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إذا كانت حبيبات الخلية لا تزال تبدو حمراء ، فارجع إلى الخطوة 3.5. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS ، وانقل تعليق الخلية إلى بئر من صفيحة قاع V ذات 96 بئرا للتلطيخ.
  7. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص وإعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ الصبغة الفلورية. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
  8. لوحة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص وإعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS للغسيل.
  9. قم بطرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من محلول حجب مستقبلات Fc. احتضن الطبق لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  10. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من كوكتيل التلوين الأساسي HSCs. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
  11. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من محلول التلوين الثانوي HSCs. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
  12. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص.
  13. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. الحفاظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل التدفق الخلوي.
    ملاحظة: إذا كنت مهتما بتحديد الأعداد المطلقة لمجموعات الخلايا المكونة للدم ، فقم بإضافة حبات المعايرة إلى أنابيب البوليسترين قبل التحليل في مقياس الخلايا16.

4. معالجة العينات لتحليل مجموعات الخلايا اللحمية في نخاع العظم الكلي

  1. ضع عظم الفخذ أو الساق في هاون مع الثلج البارد PBS 2٪ FBS وسحق العظم عن طريق الضغط عليه برفق على جدار الهاون باستخدام المدقة. اقطع طرف طرف P1000 باستخدام المقص واستخدمه لنقل كل محتوى الهاون إلى أنبوب سعة 50 مل (لا تمر عبر مصفاة خلية).
  2. قم بالطرد المركزي لأنبوب 50 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من كولاجيناز IV ومحلول dispase II. احتضان الأنبوب على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
  3. قم بتعبئة الأنبوب إلى 25 مل باستخدام PBS 2٪ FBS ودوامة للخلط. انقل محتوى الأنبوب سعة 50 مل إلى أنبوب جديد سعة 50 مل من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر. أضف 15 مل من PBS 2٪ FBS إلى أنبوب 50 مل القديم وانقل المحلول إلى نفس أنبوب 50 مل الجديد من خلال نفس مصفاة الخلية. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء (1x) عند RT عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. بعد حضانة لمدة دقيقتين في RT ، أضف 15 مل من PBS 2٪ FBS.
  5. جهاز طرد مركزي أنبوب 50 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إذا كانت حبيبات الخلية لا تزال تبدو حمراء ، فارجع إلى الخطوة 4.4. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS ، وانقل تعليق الخلية إلى بئر من صفيحة قاع V ذات 96 بئرا للتلطيخ. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. في حالة إجراء تلطيخ اللحمية ، انتقل إلى الخطوة 4.7. في حالة إجراء تلطيخ EC ، انتقل إلى الخطوة 4.12.
  7. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من كوكتيل التلوين الأساسي اللحمي. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
  8. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من محلول التلوين الثانوي اللحمي. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
  9. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص.
  10. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. الحفاظ على الجليد محمية من الضوء.
  11. قبل الذهاب إلى مقياس الخلايا مباشرة ، أضف 35 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI إلى الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية لتحليل التدفق الخلوي واحتضان الأنبوب في RT لمدة 5 دقائق في الظلام. بعد هذه الحضانة ، حافظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل قياس التدفق الخلوي.
  12. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من كوكتيل تلطيخ ECs. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
  13. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  14. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. الحفاظ على الجليد محمية من الضوء.
  15. قبل الذهاب إلى مقياس الخلايا مباشرة ، أضف 35 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI إلى الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية لتحليل التدفق الخلوي واحتضان الأنبوب في RT لمدة 5 دقائق في الظلام. بعد هذه الحضانة ، حافظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: إذا كنت مهتما بتحديد الأعداد المطلقة لمجموعات الخلايا اللحمية والبطانية ، فقم بإضافة حبات المعايرة إلى أنابيب البوليسترين قبل التحليل في مقياس الخلايا16.

5. معالجة العينات لتحليل مجموعات الخلايا المكونة للدم في BM المسحوق والمتدفق

  1. ضع عظم الفخذ على طبق بتري وقطع نهايات العظم باستخدام مشرط معقم.
  2. اغسل الجزء المركزي من العظم (الحجاب الحاجز الحاجز النفسي) عن طريق تمرير 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS عبر داخل العظم مرة واحدة من كل جانب باستخدام حقنة أنسولين 0.5 مل بدون حجم ميت وجمع المحلول في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 1 مل من PBS 2٪ FBS. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 50 مل يسمى BM المتدفق يحتوي على 4 مل من PBS 2٪ FBS. ابق على الجليد.
  3. ضع أطراف العظم في ملاط مع PBS 2٪ FBS بارد وسحقه بالضغط برفق على جدار الهاون باستخدام المدقة. ماصة تعليق الخلية الناتج لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 10 مل للتجانس والنقل إلى أنبوب سعة 50 مل يسمى BM المسحوق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
  4. إذا كان العظم المسحوق لا يبدو أبيض في هذه المرحلة ، أضف المزيد من PBS 2٪ FBS إلى الهاون وكرر التكسير. ثم ماصة صعودا وهبوطا ونقل الحل إلى نفس أنبوب 50 مل (BM سحق) من خلال نفس مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
  5. اشطف الهاون ببعض PBS 2٪ FBS وانقل المحلول إلى نفس الأنبوب سعة 50 مل (BM المسحوق) من خلال نفس مصفاة الخلايا 40 ميكرومتر.
  6. أجهزة الطرد المركزي أنابيب 50 مل المقابلة للعينات المتدفقة والمكسرة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. اتبع الخطوات من 3.5 إلى 3.13 (القسم 3) مع عينات BM المتدفقة والمكسرة.

6. إعداد ضوابط أحادية اللون (SCCs) لتحليل التدفق الخلوي

  1. اتبع الخطوات من 3.1 إلى 3.6 (القسم 3) بعظم إضافي من أحد الحيوانات غير المستخدمة في التحليل الرئيسي ، ونقل تعليق الخلية النهائي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 1 مل من PBS 2٪ FBS بدلا من بئر من صفيحة قاع V ذات 96 بئرا.
  2. انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 8 آبار من صفيحة قاع V ذات 96 بئرا ، و 100 ميكرولتر إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل يحتوي على 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS المسمى DAPI SCC ، وتعليق الخلية المتبقي في أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل يحتوي على 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS المسمى على أنه غير ملوث. حافظ على الأنابيب على الجليد محمية من الضوء.
  3. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المواد الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص.
  4. أعد تعليق حبيبات واحدة في 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ الصبغة الفلورية والباقي في 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS.
  5. أضف 0.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة التالية ، بصرف النظر عن مزيج النسب من الأجسام المضادة التي تضيف 2 ميكرولتر والجسم المضاد PECy7 CD31 الذي يضيف 0.3 ميكرولتر ، إلى كل من الآبار مع تعليق الخلية في PBS 2٪ FBS (جسم مضاد واحد لكل بئر ، نفس الأجسام المضادة المستخدمة في لوحات التحليل الرئيسية أو نفس الأجسام المضادة الفلوروفور ذات كثافة مضان مماثلة ووفرة حاتمة): كوكتيل نسب البيوتين ، الموسومة المناعية 510 المضادة للفأر CD150 (SLAM) ، PE المضادة للماوس Flk2 (CD135) ، PerCP المضادة للفأر Ly-6A / E (SCA-1) ، الموسومة المناعية 647 المضادة للماوس CD54 / ICAM-1 ، PE / Cyanine7 المضادة للماوس CD48 ، و APC / Cyanine7 المضادة للماوس CD117 (c-kit). احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
  6. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS إلى كل بئر وماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسل. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المواد الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص.
  7. أعد تعليق جميع الكريات باستثناء تلك المقابلة للخلايا المحتضنة بمزيج النسب من الأجسام المضادة في 180 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS ونقل معلقات الخلايا إلى أنابيب مستديرة القاع من البوليسترين سعة 5 مل من خلال مصافي خلايا 40 ميكرومتر. الحفاظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل التدفق الخلوي.
  8. إعادة تعليق الخلايا المحتضنة بمزيج النسب من الأجسام المضادة في 100 ميكرولتر من HSCs / محلول تلطيخ ثانوي لحمي. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
  9. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. أعد تعليق الحبيبات في 180 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. الحفاظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل التدفق الخلوي.
  11. قبل الذهاب إلى مقياس الخلايا مباشرة ، أضف 35 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI إلى أنبوب DAPI SCC واحتضان الأنبوب في RT لمدة 5 دقائق في الظلام. بعد هذه الحضانة ، حافظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل قياس التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر الشكل 1 مخططات تمثيلية لتحليل قياس التدفق الخلوي ل HSCs و MPPs في فأر C57Bl / 6 الشاب الأصحاء. تتبع استراتيجية البوابات أحدث تسميات منسقة اقترحها ISEH13. عند تحليل تأثير الاضطراب ، مثل العدوى أو السرطان ، من المهم استخدام ماوس التحكم كمرجع للبوابات العادية. يمكن أن تكون عناصر التحكم في مضان ناقص واحد (FMO) مفيدة بشكل خاص لترسيم حدود البوابات ، ولكن تجدر الإشارة إلى أن الإعداد الأعمى لحدود البوابة بناء على FMOs قد يحذف الخلايا المستهدفة أو يتضمن خلايا غير مستهدفة....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حين أن البروتوكول الموصوف بسيط وسهل التنفيذ ، يجب إيلاء اهتمام خاص لخطوات محددة. على سبيل المثال ، عند الحصول على تدفق BM (الخطوة 5.2) ، يجب عدم تجاوز حجم أو عدد المرات المشار إليها لتمرير PBS 2٪ FBS عبر الجزء الداخلي من الجزء المركزي من العظم ، لأن هذا قد يؤدي إلى تلوث كبير للعينة المتدفقة بواسطة مجموعات الخلايا الداخلية.

يمكن إجراء تعديلات على البروتوكول لتسهيل تنفيذه من قبل المحقق. في استخراج العينات (القسم 2) ، يمكن تخزين الأرجل و / أو العظام في PBS 2٪ FBS عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم LM بمنحة من صندوق السيدة تاتا التذكاري. تم دعم JR من خلال زمالة الدكتوراه من Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; زمالة FCT UI/BD/150833/2021). تم دعم ML من خلال زمالة الدكتوراه من FCT (زمالة FCT 2021.04773.BD). تم دعم DD بمنح من الجمعية الأمريكية لأمراض الدم ، ومؤسسة بابلوف ، و FCT (EXPL / MED-ONC / 0522/2021) ، والجمعية البرتغالية لأمراض الدم. نشكر الدعم المقدم من الدكتورة كاتارينا ميريليس وإميليا كاردوسو من منشأة تريسي في i3s.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alexa Fluor 647 الأجسام المضادة للفأر CD54 / ICAM-1BioLegend116114
APC StreptavidinBioLegend405207
APC / Cyanine7 المضادة للفأر CD117 (c-kit) الأجسام المضادةBioLegend105826
APC / Cyanine7 المضادة للفأر CD45 BioLegend103116
APC / Cyanine7 المضادة للفأر TER-119 / خلايا الكريات الحمراء المضادةBioLegend116223
البيوتين المضاد للفأر CD3 & إبسيلون ؛ الأجسام المضادةBioLegend100304
Biotin المضادة للفأر CD4 الأجسام المضادةBioLegend100404
Biotin المضادة للفأر CD8aBioLegend100704
Biotin المضاد للفأر Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) الجسم المضادBioLegend108404
Biotin الأجسام المضادة للفأر TER-119 / خلايا الكريات الحمراءBioLegend116204
البيوتين المضاد للفأر / الجسم المضاد البشري CD11bBioLegend101204
البيوتين المضاد للفأر / الإنسان CD45R / B220 الجسم المضادBioLegend103204
Brilliant Violet 510 الأجسام المضادة للفأر CD150 (SLAM)BioLegend115929
Calibrite 2 Color BeadsBD Biosciences349502
Collagenase IVMerck Life ScienceC1889
Dispase IIMerck Life ScienceD4693
مصل الأبقار الجنينية ، مؤهل ، معطل بالحرارة ، معتمد من الاتحاد الأوروبي ،الجنوبية ThermoFisher Scientific10500064
محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS)ThermoFisher Scientific14175095
الفأر Leptin R الأجسام المضادة البيوتينيلR & أنظمة DBAF497
NucBlue كاشف الخلية الثابتة (DAPI) كاشفThermoFisher ScientificR37606DAPI كاشف
PE الأجسام المضادة للاندوموسين المضاد للفأرThermoFisher Scientific12-5851-82
PE المضاد للفأر Flk2 (CD135)ThermoFisher Scientific12-1351-82
PE / Cyanine7 المضاد للفأر CD31 الأجسام المضادةBioLegend102524
PE / Cyanine7 الأجسام المضادة CD48 المضادة للفأرBioLegend103424
PerCP الأجسام المضادة Ly-6A / E (Sca-1) المضادة للفأرBioLegend108122
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أقراصMerck Life ScienceP4417
المضاد النقي المضاد للفأر CD16 / 32BioLegend101302
تحلل كرات الدم الحمراء 10xBioLegend420302
صبغة الزومبي البنفسجي القابلة للإصلاحBioLegend423114صبغة الفلورسنت
من أصل أمريكا محلول الجسم محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189(2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519(2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532(2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449(2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Bone Marrow CellsHematopoietic Stem CellsEndosteal Bone MarrowCentral Bone MarrowMesenchymal Stem CellsEndothelial CellsPhenotypic Analysis

مقالات ذات صلة