تحليل التدفق الخلوي للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم لنخاع عظم الفئران والخلايا المتخصصة اللحمة

قياس التدفق الخلوي هو طريقة لا تقدر بثمن لتوصيف وعزل الخلايا المناعية والمكونة للدم بشكل مستقبلي. كما يتم استخدامه بشكل متزايد لتحليل المجموعات اللحمية والظهارية للأنسجة المختلفة. تتميز الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) بخصائص فريدة من نوعها للتجديد الذاتي وتعدد القدرات. في الثدييات البالغة ، توجد HSCs بشكل أساسي في نخاع العظم (BM) ، حيث تتلقى إشارات الهدوء والبقاء على قيد الحياة من البيئة المكروية المحيطة أو المتخصصة¹. يتم تعريف HSCs رسميا وفقا للمقايسات الوظيفية². ومع ذلك ، فقد أظهرت العديد من الأوراق التاريخية فائدة قياس التدفق الخلوي لتحديد HSCs. من خلال استخدام علامات سطح الخلية المحدودة ، من الممكن التمييز بين المجموعات المكونة للدم التي يتم إثراؤها بشكل كبير في HSCs³. وبالتالي ، فإن قياس التدفق الخلوي هو طريقة مركزية في مجال الخلايا الجذعية. وقد تم استخدامه على نطاق واسع لتقييم تأثير أنواع الخلايا المتخصصة المفترضة والعوامل المتخصصة على HSCs. من خلال الجمع بين قياس التدفق الخلوي والتصوير والمقايسات الوظيفية ، فقد ثبت أن HSCs مدعومة بشكل حاسم من قبل الخلايا الجذعية الوسيطة المحيطة بالأوعية الدموية (MSCs) والخلايا البطانية (ECs). BM MSCs هي مجموعة غير متجانسة ولها مساهمات مختلفة في السيتوكين⁴ ، ولكن من الثابت أن مستقبلات اللبتين (LepR) ⁺ MSCs هي خلايا متخصصة رئيسية¹. BM ECs هي أيضا غير متجانسة للغاية ويمكن أن تكون جزءا من الجيوب الأنفية والشرايين والأوعية الانتقالية^{من النوع H / 5}. وقد أظهرت دراسات مختلفة المساهمة الدقيقة لهذه ECs المختلفة. على سبيل المثال ، تكون ECs الجيوب الأنفية الداخلية أقرب مكانيا إلى HSCs⁶ الهادئة ، في حين أن HSCs غير المهاجرة ذات المستويات المنخفضة من أنواع الأكسجين التفاعلية تقع بالقرب من ECs^{الشريانية 7}. كما أن الموقع الداخلي مقابل الموقع المركزي للمنافذ مهم جدا. ترتبط الأوعية الداخلية من النوع H بالخلايا اللحمية المحيطة بالأوعية الدموية التي تضيع مع تقدم العمر ، مما يؤدي إلى فقدان HSCs⁸. في سرطان الدم النخاعي الحاد ، يتم توسيع ECs المركزية ، في حين يتم فقدان الأوعية الداخلية و HSCs endosteal⁹.

ركزت معظم الدراسات في هذا المجال على تكون الدم نفسه وعلى التنظيم الخارجي للخلية ل HSCs. ومع ذلك ، فقد تم الاعتراف بشكل متزايد بأن هناك حاجة إلى توصيف أفضل للمنافذ التي تنظم السلف الأخرى ، وهي السلف متعدد القدرات (MPPs) ، لا سيما بالنظر إلى أنها المحركات الرئيسية لتكوين الدم في الحالة^{المستقرة 10}. على النقيض من الهيكل الهرمي الثابت ، أظهرت الدراسات الحديثة أن تكون الدم هو سلسلة متصلة تتمايز فيها HSCs إلى MPPs متحيزة في مرحلة مبكرة¹¹. تمت تسمية MPPs على اسم مخططات تصنيف مختلفة¹² ، لكن ورقة إجماع حديثة من قبل الجمعية الدولية لأمراض الدم التجريبية (ISEH) اقترحت تمييز MPPs على أنها MPPs مبكرة ووفقا لتحيز اللمفاويات (MPP-Ly) وخلايا النواة والكريات الحمر (MPP-Mk / E) والنخاعي (MPP-G / M^{) 13}. سيكون استخدام قياس التدفق الخلوي أمرا بالغ الأهمية في مواصلة دراسة أهمية منافذ BM في تنظيم هذه المجموعات السكانية. تستخدم طرق قياس التدفق الخلوي الحالية استراتيجيات بوابات متغيرة للتمييز بين HSPCs وتحديد الخلايا اللحمية ، أي ECs ، باستخدام علامات غير متسقة. الهدف من الطريقة الحالية هو تقديم سير عمل بسيط وقابل للتكرار لتلطيخ BM لتحديد المجموعات السكانية الفرعية HSPC ، والمجموعات غير المتجانسة من ECs ، و LepR ⁺ MSCs. نعتقد أن هذه التقنية ، على الرغم من مقارنتها بالطرق المبلغ عنها سابقا (انظر ، على سبيل المثال ، المرجع 14) ، توفر بروتوكولا محدثا وسهل التنفيذ لتحليل النمط الظاهري للخلايا المكونة للدم في منطقتي النخاع الوظيفيتين ، endosteal و BM المركزي BM ^8,15 ، وكذلك الخلايا المتخصصة اللحمية BM.

تم إيواء الحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول في منشأة الحيوانات i3S في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في دورة 12 ساعة من الضوء والظلام وبيئة يتم التحكم في درجة حرارتها. تم توفير حرية الوصول إلى طعام القوارض القياسية والمياه. تلقت جميع الحيوانات رعاية إنسانية وفقا للمعايير التي حددها اتحاد جمعيات علوم المختبر الأوروبية لرعاية المختبر والتعامل معها (توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 / EU). تمت الموافقة على الإجراء التجريبي الذي تم إجراؤه على الحيوانات (القتل الرحيم) من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان i3S (المرجع DD_2019_15) و Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. يمكن العثور على تفاصيل المواد المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد.

1. إعداد الحلول وتلطيخ الكوكتيلات

1. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): قم بإذابة خمسة أقراص PBS في 1 لتر من الماء المقطر. يحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. PBS 2٪ مصل بقري جنيني (FBS): أضف 10 مل من FBS إلى 500 مل من PBS. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
3. محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) (1x): أضف 50 مل من 10x محلول تحلل كرات الدم الحمراء إلى 450 مل من الماء منزوع الأيونات. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
4. كولاجيناز الوريدي ومحلول ديسباز II: يذوب 30 ملغ من كولاجيناز IV و60 ملغ من ديسباز II في 30 مل من HBSS لمحلول كولاجيناز IV 1 ملغ/مل ومحلول ديسباز II عيار 2 ملغ/مل. تحضير طازجة قبل الاستخدام.
5. محلول حجب مستقبلات Fc: أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد المنقى CD16 / 32 المضاد للفأر إلى 490 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS. تحضير طازجة أو في اليوم السابق. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
6. محلول تلطيخ صبغة صلاحية الخلايا الفلورية: أضف 2 ميكرولتر من صبغة صلاحية الخلايا الفلورية إلى 1 مل من برنامج تلفزيوني. تحضير طازجة قبل الاستخدام.
7. كوكتيل نسب البيوتين: امزج 100 ميكرولتر من كل من الأجسام المضادة التالية: البيوتين المضاد للفأر CD3ε ، البيوتين المضاد للفأر CD4 ، البيوتين المضاد للفأر CD8a ، البيوتين المضاد للفأر / CD11b البشري ، البيوتين المضاد للفأر / CD45R / B220 البشري ، البيوتين المضاد للفأر Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) ، والبيوتين المضاد للفأر TER-119 / خلايا الإريثرويد. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
8. كوكتيل التلوين الأساسي HSCs: أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل نسب البيوتين ، و 10 ميكرولتر من 510 CD150 المضاد للفأر (SLAM) ، و 10 ميكرولتر من فيكوريثرين (PE) المضاد للفأر Flk2 (CD135) ، و 10 ميكرولتر من بروتين بيريدينين كلوروفيل (PerCP) المضاد للفأر Ly-6A / E (Sca-1) ، و 10 ميكرولتر من PE / Cyanine7 المضاد للفأر CD48 ، و 10 ميكرولتر من الألوفيكوسيانين (APC) / Cyanine7 المضاد للفأر CD117 (c-kit) إلى 940 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS. تحضير طازجة أو في اليوم السابق. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية محميا من الضوء حتى الاستخدام.
9. كوكتيل تلطيخ أولي ستروني: أضف 5 ميكرولتر من الجسم المضاد للبتين R للفأر ، و 6.7 ميكرولتر من الجسم المضاد للإندوموسين المضاد للفأر PE ، و 10 ميكرولتر من PerCP المضاد للفأر Ly-6A / E (Sca-1) ، و 4 ميكرولتر من PE / Cyanine7 المضاد للفأر CD31 ، و 10 ميكرولتر من APC / Cyanine7 المضاد للفأر CD45 ، و 10 ميكرولتر من خلايا APC / Cyanine7 المضادة للفأر TER-119 / erythroid إلى 954 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS. تحضير طازجة أو في اليوم السابق. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية محميا من الضوء حتى الاستخدام.
10. HSCs / محلول تلطيخ ثانوي انسجة: أضف 1 ميكرولتر من APC streptavidin إلى 1 مل من PBS 2٪ FBS. تحضير طازجة أو في اليوم السابق. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية محميا من الضوء حتى الاستخدام.
11. كوكتيل تلطيخ ECs: أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد لبطانة الرحم PE المضاد للفأر ، و 10 ميكرولتر من PerCP المضاد للفأر Ly-6A / E (Sca-1) ، و 10 ميكرولتر من PE / Cyanine7 المضاد للماوس CD31 ، و 10 ميكرولتر من Alexa Fluor 647 المضاد للماوس CD54 / ICAM-1 ، و 10 ميكرولتر من APC / Cyanine7 المضاد للماوس CD45 ، و 10 ميكرولتر من خلايا APC / Cyanine7 المضادة للفأر TER-119 / erythroid إلى 940 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS. تحضير طازجة أو في اليوم السابق. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية محميا من الضوء حتى الاستخدام.
12. محلول تلطيخ DAPI: أضف 1 قطرة من كاشف DAPI إلى 500 ميكرولتر من PBS. تحضير طازجة قبل الاستخدام.

2. استخراج العينة

1. القتل الرحيم للحيوان عن طريق خلع عنق الرحم (يمكن العثور على تفاصيل الحيوانات المستخدمة لإنتاج البيانات المقدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي 1). ضع الحيوان مع البطن على طبق بتري ورشه بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بعمل قطع فوق البطن باستخدام المقص واسحب الجلد بعيدا حتى الكاحلين.
2. أمسك بساق واحدة ، وباستخدام المقص ، قم بقصها في قاعها (حيث يوجد المفصل بين الساق والورك) لفصلها عن الحيوان. ستكون هذه الخطوة أيضا بمثابة طريقة تأكيدية ثانوية للقتل الرحيم. إزالة القدم من الساق عن طريق قطع في الكاحل. ضع الساق في برنامج تلفزيوني بارد مثلج 2٪ FBS. إذا لزم الأمر ، كرر الخطوة مع الساق الأخرى.
3. الاستيلاء على عظم الورك ، واستخدام مقص قطع خلفه لفصله عن الحيوان. ضع عظم الورك في برنامج تلفزيوني بارد مثلج 2٪ FBS. إذا لزم الأمر ، كرر الخطوة مع عظم الورك الآخر.
4. ضع الساق (الساقين) وعظم (عظم) الورك في طبق بتري ، وباستخدام مشرط معقم ، نظف العظام. افصل الساق وعظم الفخذ عن طريق قطع الركبة بالمشرط. ضع العظام النظيفة في برنامج تلفزيوني بارد مثلج 2٪ FBS.

3. معالجة العينات لتحليل مجموعات الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم الكلي

1. ضع عظم الفخذ أو الساق في هاون مع الثلج البارد PBS 2٪ FBS وسحق العظم عن طريق الضغط عليه برفق على جدار الهاون باستخدام المدقة. يتم إطلاق خلايا BM في المحلول الموجود في الهاون.
2. ماصة تعليق الخلية الناتج لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 10 مل للتجانس والنقل إلى أنبوب 50 مل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر موضوعة أعلى الأنبوب.
3. إذا كانت العظام المسحوقة لا تبدو بيضاء في هذه المرحلة ، أضف المزيد من PBS 2٪ FBS إلى الهاون وكرر التكسير ، ثم ماصة لأعلى ولأسفل وانقل المحلول إلى نفس الأنبوب سعة 50 مل من خلال نفس مصفاة الخلايا 40 ميكرومتر.
4. اشطف الهاون ببعض PBS 2٪ FBS وانقل المحلول إلى نفس الأنبوب سعة 50 مل من خلال نفس مصفاة الخلايا 40 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي أنبوب 50 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء (1x) عند RT عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. بعد حضانة لمدة دقيقتين في RT ، أضف 15 مل من PBS 2٪ FBS.
6. جهاز طرد مركزي أنبوب 50 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إذا كانت حبيبات الخلية لا تزال تبدو حمراء ، فارجع إلى الخطوة 3.5. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS ، وانقل تعليق الخلية إلى بئر من صفيحة قاع V ذات 96 بئرا للتلطيخ.
7. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص وإعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ الصبغة الفلورية. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
8. لوحة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص وإعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS للغسيل.
9. قم بطرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من محلول حجب مستقبلات Fc. احتضن الطبق لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
10. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من كوكتيل التلوين الأساسي HSCs. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
11. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من محلول التلوين الثانوي HSCs. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
12. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص.
13. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. الحفاظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل التدفق الخلوي.
    ملاحظة: إذا كنت مهتما بتحديد الأعداد المطلقة لمجموعات الخلايا المكونة للدم ، فقم بإضافة حبات المعايرة إلى أنابيب البوليسترين قبل التحليل في مقياس الخلايا¹⁶.

4. معالجة العينات لتحليل مجموعات الخلايا اللحمية في نخاع العظم الكلي

1. ضع عظم الفخذ أو الساق في هاون مع الثلج البارد PBS 2٪ FBS وسحق العظم عن طريق الضغط عليه برفق على جدار الهاون باستخدام المدقة. اقطع طرف طرف P1000 باستخدام المقص واستخدمه لنقل كل محتوى الهاون إلى أنبوب سعة 50 مل (لا تمر عبر مصفاة خلية).
2. قم بالطرد المركزي لأنبوب 50 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من كولاجيناز IV ومحلول dispase II. احتضان الأنبوب على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
3. قم بتعبئة الأنبوب إلى 25 مل باستخدام PBS 2٪ FBS ودوامة للخلط. انقل محتوى الأنبوب سعة 50 مل إلى أنبوب جديد سعة 50 مل من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر. أضف 15 مل من PBS 2٪ FBS إلى أنبوب 50 مل القديم وانقل المحلول إلى نفس أنبوب 50 مل الجديد من خلال نفس مصفاة الخلية. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء (1x) عند RT عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. بعد حضانة لمدة دقيقتين في RT ، أضف 15 مل من PBS 2٪ FBS.
5. جهاز طرد مركزي أنبوب 50 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إذا كانت حبيبات الخلية لا تزال تبدو حمراء ، فارجع إلى الخطوة 4.4. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS ، وانقل تعليق الخلية إلى بئر من صفيحة قاع V ذات 96 بئرا للتلطيخ. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
6. في حالة إجراء تلطيخ اللحمية ، انتقل إلى الخطوة 4.7. في حالة إجراء تلطيخ EC ، انتقل إلى الخطوة 4.12.
7. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من كوكتيل التلوين الأساسي اللحمي. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
8. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من محلول التلوين الثانوي اللحمي. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
9. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص.
10. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. الحفاظ على الجليد محمية من الضوء.
11. قبل الذهاب إلى مقياس الخلايا مباشرة ، أضف 35 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI إلى الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية لتحليل التدفق الخلوي واحتضان الأنبوب في RT لمدة 5 دقائق في الظلام. بعد هذه الحضانة ، حافظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل قياس التدفق الخلوي.
12. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من كوكتيل تلطيخ ECs. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
13. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
14. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. الحفاظ على الجليد محمية من الضوء.
15. قبل الذهاب إلى مقياس الخلايا مباشرة ، أضف 35 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI إلى الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية لتحليل التدفق الخلوي واحتضان الأنبوب في RT لمدة 5 دقائق في الظلام. بعد هذه الحضانة ، حافظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: إذا كنت مهتما بتحديد الأعداد المطلقة لمجموعات الخلايا اللحمية والبطانية ، فقم بإضافة حبات المعايرة إلى أنابيب البوليسترين قبل التحليل في مقياس الخلايا¹⁶.

5. معالجة العينات لتحليل مجموعات الخلايا المكونة للدم في BM المسحوق والمتدفق

1. ضع عظم الفخذ على طبق بتري وقطع نهايات العظم باستخدام مشرط معقم.
2. اغسل الجزء المركزي من العظم (الحجاب الحاجز الحاجز النفسي) عن طريق تمرير 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS عبر داخل العظم مرة واحدة من كل جانب باستخدام حقنة أنسولين 0.5 مل بدون حجم ميت وجمع المحلول في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 1 مل من PBS 2٪ FBS. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 50 مل يسمى BM المتدفق يحتوي على 4 مل من PBS 2٪ FBS. ابق على الجليد.
3. ضع أطراف العظم في ملاط مع PBS 2٪ FBS بارد وسحقه بالضغط برفق على جدار الهاون باستخدام المدقة. ماصة تعليق الخلية الناتج لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 10 مل للتجانس والنقل إلى أنبوب سعة 50 مل يسمى BM المسحوق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
4. إذا كان العظم المسحوق لا يبدو أبيض في هذه المرحلة ، أضف المزيد من PBS 2٪ FBS إلى الهاون وكرر التكسير. ثم ماصة صعودا وهبوطا ونقل الحل إلى نفس أنبوب 50 مل (BM سحق) من خلال نفس مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
5. اشطف الهاون ببعض PBS 2٪ FBS وانقل المحلول إلى نفس الأنبوب سعة 50 مل (BM المسحوق) من خلال نفس مصفاة الخلايا 40 ميكرومتر.
6. أجهزة الطرد المركزي أنابيب 50 مل المقابلة للعينات المتدفقة والمكسرة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. اتبع الخطوات من 3.5 إلى 3.13 (القسم 3) مع عينات BM المتدفقة والمكسرة.

6. إعداد ضوابط أحادية اللون (SCCs) لتحليل التدفق الخلوي

1. اتبع الخطوات من 3.1 إلى 3.6 (القسم 3) بعظم إضافي من أحد الحيوانات غير المستخدمة في التحليل الرئيسي ، ونقل تعليق الخلية النهائي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 1 مل من PBS 2٪ FBS بدلا من بئر من صفيحة قاع V ذات 96 بئرا.
2. انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 8 آبار من صفيحة قاع V ذات 96 بئرا ، و 100 ميكرولتر إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل يحتوي على 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS المسمى DAPI SCC ، وتعليق الخلية المتبقي في أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل يحتوي على 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS المسمى على أنه غير ملوث. حافظ على الأنابيب على الجليد محمية من الضوء.
3. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المواد الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص.
4. أعد تعليق حبيبات واحدة في 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ الصبغة الفلورية والباقي في 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS.
5. أضف 0.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة التالية ، بصرف النظر عن مزيج النسب من الأجسام المضادة التي تضيف 2 ميكرولتر والجسم المضاد PECy7 CD31 الذي يضيف 0.3 ميكرولتر ، إلى كل من الآبار مع تعليق الخلية في PBS 2٪ FBS (جسم مضاد واحد لكل بئر ، نفس الأجسام المضادة المستخدمة في لوحات التحليل الرئيسية أو نفس الأجسام المضادة الفلوروفور ذات كثافة مضان مماثلة ووفرة حاتمة): كوكتيل نسب البيوتين ، الموسومة المناعية 510 المضادة للفأر CD150 (SLAM) ، PE المضادة للماوس Flk2 (CD135) ، PerCP المضادة للفأر Ly-6A / E (SCA-1) ، الموسومة المناعية 647 المضادة للماوس CD54 / ICAM-1 ، PE / Cyanine7 المضادة للماوس CD48 ، و APC / Cyanine7 المضادة للماوس CD117 (c-kit). احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
6. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS إلى كل بئر وماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسل. قم بطرد اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المواد الطافية عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص.
7. أعد تعليق جميع الكريات باستثناء تلك المقابلة للخلايا المحتضنة بمزيج النسب من الأجسام المضادة في 180 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS ونقل معلقات الخلايا إلى أنابيب مستديرة القاع من البوليسترين سعة 5 مل من خلال مصافي خلايا 40 ميكرومتر. الحفاظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل التدفق الخلوي.
8. إعادة تعليق الخلايا المحتضنة بمزيج النسب من الأجسام المضادة في 100 ميكرولتر من HSCs / محلول تلطيخ ثانوي لحمي. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
9. أضف 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للغسيل. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
10. أعد تعليق الحبيبات في 180 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. الحفاظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل التدفق الخلوي.
11. قبل الذهاب إلى مقياس الخلايا مباشرة ، أضف 35 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI إلى أنبوب DAPI SCC واحتضان الأنبوب في RT لمدة 5 دقائق في الظلام. بعد هذه الحضانة ، حافظ على الجليد محميا من الضوء حتى تحليل قياس التدفق الخلوي.

يظهر الشكل 1 مخططات تمثيلية لتحليل قياس التدفق الخلوي ل HSCs و MPPs في فأر C57Bl / 6 الشاب الأصحاء. تتبع استراتيجية البوابات أحدث تسميات منسقة اقترحها ISEH13. عند تحليل تأثير الاضطراب ، مثل العدوى أو السرطان ، من المهم استخدام ماوس التحكم كمرجع للبوابات العادية. يمكن أن تكون عناصر التحكم في مضان ناقص واحد (FMO) مفيدة بشكل خاص لترسيم حدود البوابات ، ولكن تجدر الإشارة إلى أن الإعداد الأعمى لحدود البوابة بناء على FMOs قد يحذف الخلايا المستهدفة أو يتضمن خلايا غير مستهدفة. على سبيل المثال ، كلما انخفضت شدة مجموعة CD48 ، زاد التخصيب ل HSCs17 الهادئة طويلة الأجل. علاوة على ذلك ، تعتمد الخصائص المختلفة لبعض السكان على شدة علامات محددة. على سبيل المثال ، HSCs التي تعبر عن مستويات CD150 أعلى هي أكثر تحيزا للنخاع18.

يتم عرض الترددات والأعداد المطلقة التي تم الحصول عليها في تحليل مجموعات الخلايا المكونة للدم المطبقة على ما مجموعه أربعة في الجدول 1.

يوضح الشكل 2 مخططات تمثيلية لتحليل قياس التدفق الخلوي ل ECs و MSCs. يتم استبعاد غالبية الخلايا المكونة للدم بعد الاختيار السلبي Ter119 / CD45. يمكن بعد ذلك تحديد LepR + MSCs بسهولة ، بينما تتطلب ECs الحقيقية اختيارا لاحقا لخلايا Sca-1 +. في حين أن Sca-1 غالبا ما يستخدم في دراسات التألق المناعي لتمييز الشرايين على وجه التحديد ، فإن هذا ليس هو الحال في قياس التدفق الخلوي ، لأن هذه التقنية حساسة للغاية ، وتعبر ECs دائما عن درجة معينة (حتى لو كانت منخفضة) من Sca-1 على سطح الخلية. من خلال عدم اختيار خلايا Sca-1 + فقط ، سيتم تضمين الخلايا غير البطانية الأخرى في التحليل ، مثل الخلايا النخاعية المعبرة عن CD31 ، والتي قد تؤثر بشكل كبير على تحديد كمية ECs في BM. يمكن تحليل ECs كمجموعة سكانية كاملة أو بناء على علامات محددة تكشف جزئيا عن عدم تجانسها. يعد Endomucin بالاشتراك مع CD31 مفيدا جدا لتحديد النوع المميز وظيفيا Hendothelium 15 (الشكل 2). علاوة على ذلك ، فقد ثبت سابقا أن تعبير ICAM-1 يسمح بالتمييز بين الشرايين (aBMECs) و ECs الجيبية (sBMECs) (الشكل 3)20.

يتم عرض الترددات والأعداد المطلقة التي تم الحصول عليها في تحليل MSCs ومجموعات الخلايا البطانية المطبقة على ما مجموعه أربعة في الجدول 2 والجدول 3.

على الرغم من أن المناطق الوظيفية ل BM ليست محددة بوضوح في المناطق النسيجية الواضحة ، فمن الثابت أن المناطق الداخلية المبطنة للعظام ومناطق BM المركزية يتم إثراؤها في أنواع وأحداث معينة من الخلايا (على سبيل المثال ، إطلاق الصفائح الدموية / الصفائح الدموية من خلايا النواة في الجيوب الأنفية لمناطق BM المركزية). لذلك ، من المفيد إثراء أنواع الخلايا في المناطق المركزية والداخلية لتحليل هاتين المقصورتين بشكل منفصل. طبقنا طريقة لغسل الحجاب الحاجز لإثراء أنواع الخلايا المركزية وسحق الميتافيزيقا لإثراء أنواع الخلايا الداخلية (الشكل 4 أ). إن القياس الكمي ل aBMECs و sBMECs في أنسجة BM المتدفقة (المركزية) والمسحوقة (الداخلية) (الشكل 4B) يتحقق من قابلية تطبيق طريقة العزل الميكانيكي هذه ، حيث أن aBMECs معروفة بأنها أكثر وفرة في المناطق الداخلية ، والجيوب الأنفية أكثر تواترا في مناطق BM المركزية.

الشكل 1: تحليل تجمعات الخلايا المكونة للدم. مخططات تمثيلية توضح استراتيجية البوابات لتحليل التدفق الخلوي لمجموعات الخلايا المكونة للدم في إجمالي BM باستخدام البرنامج المقدم. الاختصارات: FSC-H = مبعثر أمامي - ارتفاع ، FSC-A = مساحة مبعثر أمامي ، لين = نسب ، LKS = Lin- Sca-1 + c-Kit + خلايا سلفية مكونة للدم ، MPPsLy = أسلاف متعددو القدرات - ليمفويد ، MPPsG / M = أسلاف متعددي القدرات - الخلايا المحببة / البلاعم ، MPPsMk / E = أسلاف متعددي القدرات - خلايا النواة / كريات الدم الحمراء ، MPPs = أسلاف متعددي القدرات ، HSCs = الخلايا الجذعية المكونة للدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تحليل تجمعات الخلايا اللحمية. مخططات تمثيلية توضح استراتيجية البوابات لتحليل التدفق الخلوي للخلايا اللحمية في إجمالي BM باستخدام البرنامج المقدم. الاختصارات: FSC-H = مبعثر أمامي - ارتفاع ، FSC-A = منطقة مبعثرة أمامية ، MSCs = خلايا جذعية وسيطة ، LepR = مستقبلات اللبتين ، ECs = خلايا بطانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تحليل الخلايا البطانية. مخططات تمثيلية توضح استراتيجية البوابات لتحليل التدفق الخلوي ل ECs في إجمالي BM باستخدام البرنامج المقدم. الاختصارات: FSC-H = مبعثر أمامي - ارتفاع ، FSC-A = منطقة مبعثرة أمامية ، ECs = خلايا بطانية ، aBMECs = خلايا بطانة نخاع العظم الشرياني ، sBMECs = خلايا بطانة نخاع العظم الجيبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تحليل تجمعات EC في المناطق المركزية والداخلية. أ: تمثيل الأجزاء المختلفة لعظم الجرذ الطويل. (ب) مخططات توضح الاختلافات ذات الدلالة الإحصائية في ترددات الخلايا البطانية CD31 + في aBMECs (المخصب في العينة المسحوقة) و sBMECs (المخصب في العينة المتدفقة). تمثل كل نقطة ماوس (n = 9) ، ويتم إقران العينات. كان الاختبار الإحصائي المستخدم هو اختبار T المزدوج. يشير إلى قيمة P ثنائية الطرف < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: البيانات الكمية لمجموعات الخلايا المكونة للدم. متوسط التردد في الخلايا الحية BM لمختلف مجموعات الخلايا المكونة للدم التي تم تحليلها في إجمالي ، endosteal ، و BM المركزي وعدد الخلايا لكل عظم الفخذ في إجمالي BM. تظهر البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) ، n = 4.

الجدول 2: البيانات الكمية لتجمعات الخلايا اللحمية. متوسط التردد في الخلايا الحية BM وعدد الخلايا لكل قصبة لمختلف مجموعات الخلايا اللحمية التي تم تحليلها في إجمالي BM. تظهر البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) ، n = 4.

الجدول 3: البيانات الكمية لتجمعات الخلايا البطانية. متوسط التردد في الخلايا الحية BM وعدد الخلايا لكل قصبة لمختلف مجموعات الخلايا البطانية التي تم تحليلها في إجمالي BM. تظهر البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) ، n = 4.

الجدول التكميلي 1: تفاصيل الحيوانات المستخدمة في الدراسة. سلالة الحيوانات المستخدمة لإنتاج البيانات وجنسها وعمرها ووزنها في الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3 والجدول 1 والجدول 2 والجدول 3. اختصار: ز = غرام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.