تطوير واختبار ثنائي الببتيد ذو البنية النانوية الميثيلية التي تمنع نشاط src kinase في المختبر للتطبيقات المضادة للسرطان

Summary

يتم تقديم بروتوكول هنا لتصميم واختبار ثنائي الببتيد الذي يمكن أن يثبط نشاط إنزيم كيناز Src باستخدام فحوصات لا خلوية وخلوية للتطبيقات المضادة للسرطان. الببتيدات الصياغة هنا (WR_CH3 ، W_{CH3-R CH3} ، و W-R _{(CH3) 2}) تثبط كيناز Src بقيم IC₅₀ من 510 نانومتر و 916 نانومتر و 1 ميكرومتر ، على التوالي.

Abstract

هنا ، بهدف تطوير علاج جديد مضاد للسرطان ، تم تصميم سبعة ثنائي الببتيد يحتوي على التربتوفان الميثيل و / أو الأرجينين الميثيل وتم إنتاجه باستخدام تخليق الببتيد في الطور الصلب Fmoc. الإفراط في التعبير عن إنزيم التيروزين كيناز Src متورط في تطور أنواع مختلفة من السرطان. ثبت سابقا أن بقايا ثنائي الببتيدات التي تحتوي على أحماض أمينية غير طبيعية مثل الأرجينين الميثيلي (R_CH3) ، والأرجينين ثنائي الميثيل (R _{(CH3) 2}) ، و / أو بقايا التربتوفان الميثيلي (W_CH3) تثبط كيناز Src. في هذه الدراسة ، تم اختبار ثلاثة من هذه الثنائيات الببتيدات ، WR_CH3 و W_{CH3-R CH3} و W-R _{(CH3) 2} ، باستخدام فحوصات لا خلوية ووجد أن لها قيم IC₅₀ (التركيز الذي يحدث عنده تثبيط 50٪) من 510 نانومتر و 916 نانومتر و 1 ميكرومتر ، على التوالي. كانت هذه القيم قابلة للمقارنة مع تلك التي تم الحصول عليها لببتيدات الخماسي الدوري إلى الببتيدات النانوية WR ([W-R] ₅- [W-R] ₉) التي تم تصنيعها في الدراسات السابقة. ومع ذلك ، لم تظهر النسخ غير الميثيلة من ثنائي الببتيدات أي نشاط مثبط ضد Src kinase. لم تظهر كل هذه ثنائيات الببتيدات (50 ميكرومتر) أي سمية خلوية بعد الحضانة لمدة تصل إلى 72 ساعة مع ثلاثة خطوط مختلفة للخلايا السرطانية ، بما في ذلك سرطان الدم (CCRF-CEM) ، وسرطان الثدي الغدي (MDA-MB-231) ، وسرطان المبيض الغدي (SK-OV-3) خطوط الخلايا ، مما يشير إلى النفاذية المحدودة للببتيدات من خلال غشاء الخلية. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة لتحسين نفاذية هذه الببتيدات للتطبيقات المضادة للسرطان ، مثل استخدام حامل الببتيد أو وظيفة الببتيد الإضافية. باختصار ، توفر هذه الدراسة بروتوكولا لتصنيع واختبار الببتيدات التي تمنع نشاط كيناز Src ، وبالتالي تمتلك قدرة واعدة مضادة للسرطان ، كما هو موضح باستخدام المقايسات اللاخلوية والخلوية.

Introduction

يحدث السرطان بسبب النمو غير الطبيعي للخلايا الطبيعية وهو أحد أكثر الأمراض فتكا في جميع أنحاء العالم. تنتشر هذه الخلايا غير الطبيعية إلى أعضاء مختلفة في الجسم عن طريق عملية تسمى ورم خبيث. أكثر أشكال السرطان شيوعا هو سرطان الثدي ، الذي حدث في 2.26 مليون شخص في عام 2020. علاوة على ذلك ، كان هناك حوالي 1.80 مليون حالة وفاة بسبب سرطان الرئة في عام 2020¹. وفقا لمنظمة الصحة العالمية ، توفي حوالي 10 ملايين شخص بسبب السرطان في عام 2020². تختلف الخلايا السرطانية عن الخلايا الطبيعية من حيث أنها تفرط في التعبير عن إنزيمات معينة ، مثل بروتين التيروزين كيناز (PTKs). يعرف المعهد الوطني للسرطان الكينازات على أنها إنزيمات قادرة على فسفرة....

Protocol

1. تخليق الببتيدات

ملاحظة: يوصف توليف W-R كمثال تمثيلي (الشكل 2).

1. تزن 566 مجم (0.3 ملليمول) من راتنج H-Arg (Pbf) -2-chlorotriryl وأضفها إلى وعاء تخليق الببتيد (انظر جدول المواد) ، وفقا للإجراء المستخدم من قبل Mandal et al²⁰. إجراء تخليق الببتيد باستخدام استراتيجية تخليق الببتيد في الطور الصلب (SPPS)²¹.
   ملاحظة: تم تجميع ثنائي الببتيدات الميثيلية أو ثنائية الميثيل التي تحتوي على أحماض أمينية غير طبيعية على راتنج أميد حلبة التزلج (سعة تحميل 0.3 مليمول / جم) ، بينما تم تجميع ثنائي الببتيدات المحتوية على أحماض أمينية طبي....

Results

WR_CH3 ، W_{CH3-R CH3} ، WR _{(CH3) 2} ، _WCH3-R ، W_{CH3-R (CH3) 2} ، وببتيدات التحكم W-R تم تصنيعها باستخدام تخليق الببتيد في الطور الصلب Fmoc (الشكل 3) ، مع نقاء 95٪ و 98.7٪ و 99٪ و 100٪ و 100٪ و 99.5٪ على التوالي. تم تأكيد الهياكل الكيميائية لهذه ثنائيات الببتيدات باستخدام ESI-MS. كانت قيم m / z لهذه ثنائيات الببتيدات 374.1624 و 388.1949 و 388.1794 و 374.1815 و 402.2022 و 361.1457 على التوالي.

Discussion

تحتوي الببتيدات التي تم تصنيعها واختبارها هنا لتثبيط كيناز Src وما يترتب على ذلك من قتل الخلايا السرطانية على التربتوفان الميثيل و / أو الأرجينين الميثيلي ، وهي أحماض أمينية غير طبيعية. يعد تكوين الراسب الأبيض عند إضافة ثنائي إيثيل الأثير خطوة حاسمة في تخليق هذه الببتيدات. ومع ذلك ، لا يمكن لجميع الببتيدات الاصطناعية أن تشكل رواسب. لذلك ، حتى في حالة عدم تكوين راسب ، يمكن تأكيد تخليق الببتيد الناجح من خلال تحديد الكتلة المطلوبة باستخدام قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS). .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1،4-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	10708984001	تخليق الببتيد
قمع مرشح Aldrich fritted لتخليق المرحلة الصلبة	Sigma-Aldrich	Z283304	وعاء تخليق الببتيد
Alexa594 Tracer	Bell Brook Labs ، ماديسون ، ويسكونسن	3013
Anisole	Sigma-Aldrich	8014520500
CellTiter 96 AQueous One  الحل  كواشف فحص تكاثر الخلايا	Promega	G3582	مقايسة تكاثر الخلايا (كاشف MTS)
ثنائي كلورو الميثان ، 99.9٪ ، فيشرشي الجاف الإضافي		AC326850025
Fmoc-ADMA (Pbf) -OH	Sigma-Aldrich	8521070001
Fmoc-Arg (Me ، Pbf) - OH	Sigma-Aldrich	8521050001
Fmoc-Arg (Pbf) -OH	Sigma-Aldrich	8520670025
Fmoc-Trp (Boc) - OH	Sigma-Aldrich	47561-25G-F
HPLC C18 عمود	Shimadzu  (نظام RP-HPLC)		ماء / أسيتونيتريل التدرج
IRDye QC-1 مروي	بيل بروك لابز ، ماديسون ، ويسكونسن	3013
قارئ Microplate SpectraMax M2e			الجزيئية
Microsoft Excel	برنامج	جداول بيانات
N ، N-Diisopropylethylamine (DIPEA)	Sigma-Aldrich	496219
N ، N-Dimethylformamide ، اللامائي ، 99.8٪	فيشرسي	AA43997M1
بيبيريدين 20٪	سيجما-ألدريتش	80645
راتنج أميد حلبة الوحل (100-200 شبكة)	سيجما ألدريتش	8550010025
ثيوانيسول	سيجما ألدريتش	92358
Transcreener ADP2 FI فحص	بيل بروك لابز ، ماديسون ، ويسكونسن	3013	مجموعة فحص نشاط كيناز c-Src