Method Article

تطوير واختبار ثنائي الببتيد ذو البنية النانوية الميثيلية التي تمنع نشاط src kinase في المختبر للتطبيقات المضادة للسرطان

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم بروتوكول هنا لتصميم واختبار ثنائي الببتيد الذي يمكن أن يثبط نشاط إنزيم كيناز Src باستخدام فحوصات لا خلوية وخلوية للتطبيقات المضادة للسرطان. الببتيدات الصياغة هنا (WRCH3 ، WCH3-R CH3 ، و W-R (CH3) 2) تثبط كيناز Src بقيم IC50 من 510 نانومتر و 916 نانومتر و 1 ميكرومتر ، على التوالي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، بهدف تطوير علاج جديد مضاد للسرطان ، تم تصميم سبعة ثنائي الببتيد يحتوي على التربتوفان الميثيل و / أو الأرجينين الميثيل وتم إنتاجه باستخدام تخليق الببتيد في الطور الصلب Fmoc. الإفراط في التعبير عن إنزيم التيروزين كيناز Src متورط في تطور أنواع مختلفة من السرطان. ثبت سابقا أن بقايا ثنائي الببتيدات التي تحتوي على أحماض أمينية غير طبيعية مثل الأرجينين الميثيلي (RCH3) ، والأرجينين ثنائي الميثيل (R (CH3) 2) ، و / أو بقايا التربتوفان الميثيلي (WCH3) تثبط كيناز Src. في هذه الدراسة ، تم اختبار ثلاثة من هذه الثنائيات الببتيدات ، WRCH3 و WCH3-R CH3 و W-R (CH3) 2 ، باستخدام فحوصات لا خلوية ووجد أن لها قيم IC50 (التركيز الذي يحدث عنده تثبيط 50٪) من 510 نانومتر و 916 نانومتر و 1 ميكرومتر ، على التوالي. كانت هذه القيم قابلة للمقارنة مع تلك التي تم الحصول عليها لببتيدات الخماسي الدوري إلى الببتيدات النانوية WR ([W-R] 5- [W-R] 9) التي تم تصنيعها في الدراسات السابقة. ومع ذلك ، لم تظهر النسخ غير الميثيلة من ثنائي الببتيدات أي نشاط مثبط ضد Src kinase. لم تظهر كل هذه ثنائيات الببتيدات (50 ميكرومتر) أي سمية خلوية بعد الحضانة لمدة تصل إلى 72 ساعة مع ثلاثة خطوط مختلفة للخلايا السرطانية ، بما في ذلك سرطان الدم (CCRF-CEM) ، وسرطان الثدي الغدي (MDA-MB-231) ، وسرطان المبيض الغدي (SK-OV-3) خطوط الخلايا ، مما يشير إلى النفاذية المحدودة للببتيدات من خلال غشاء الخلية. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة لتحسين نفاذية هذه الببتيدات للتطبيقات المضادة للسرطان ، مثل استخدام حامل الببتيد أو وظيفة الببتيد الإضافية. باختصار ، توفر هذه الدراسة بروتوكولا لتصنيع واختبار الببتيدات التي تمنع نشاط كيناز Src ، وبالتالي تمتلك قدرة واعدة مضادة للسرطان ، كما هو موضح باستخدام المقايسات اللاخلوية والخلوية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدث السرطان بسبب النمو غير الطبيعي للخلايا الطبيعية وهو أحد أكثر الأمراض فتكا في جميع أنحاء العالم. تنتشر هذه الخلايا غير الطبيعية إلى أعضاء مختلفة في الجسم عن طريق عملية تسمى ورم خبيث. أكثر أشكال السرطان شيوعا هو سرطان الثدي ، الذي حدث في 2.26 مليون شخص في عام 2020. علاوة على ذلك ، كان هناك حوالي 1.80 مليون حالة وفاة بسبب سرطان الرئة في عام 20201. وفقا لمنظمة الصحة العالمية ، توفي حوالي 10 ملايين شخص بسبب السرطان في عام 20202. تختلف الخلايا السرطانية عن الخلايا الطبيعية من حيث أنها تفرط في التعبير عن إنزيمات معينة ، مثل بروتين التيروزين كيناز (PTKs). يعرف المعهد الوطني للسرطان الكينازات على أنها إنزيمات قادرة على فسفرة البروتينات أو السكريات الأخرى3. يمكن أن تسهل معرفة الوظيفة التنظيمية للكينازات تصميم الأدوية الفعالة المضادة للسرطان. على سبيل المثال ، تحفز PTKs فسفرة البروتينات أو السكريات الأخرى ، ونتيجة لذلك ، يتم تحويل ATP إلى ADP عن طريق فقدان مجموعة الفوسفات. ما مجموعه 80٪ من الجينات المسرطنة والبروتونوجينات تشفر PTKs4. كينازات Src هي عائلة من كينازات التيروزين غير المستقبلة ، بما في ذلك Lck و Fyn و Hck و Blk و Yes و Yrk ، والتي يتم التعبير عنها بشكل مفرط في الخلايا السرطانية ، خاصة في سرطان الثدي5،6. ترتبط كينازات التيروزين Src بتكوين الانقسام والتمايز وتنشيط الخلايا التائية وتحويل الخلايا. يساعد Src على غزو الخلايا السرطانية والورم الخبيث بسبب قدرته على تقليل التصاق الخلايا السرطانية. هناك خمسة مجالات مختلفة في كيناز Src ، مرتبة من المحطات الطرفية N- إلى C على النحو التالي: مجال الأحماض الدهنية ، مجال تماثل Src 3 (SH3) ، مجال تماثل Src 2 (SH2) ، مجال التيروزين كيناز (SH1) ، والمجال التنظيمي C-terminal7.

figure-introduction-1
الشكل 1: المجالات المستهدفة في إنزيم كيناز Src ، بما في ذلك مجال SH3 ، ومجال SH2 ، ومجال كيناز (SH1) ، وجزء تنظيمي قصير من C-terminal. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يتم استهداف مجال كيناز SH1 بشكل شائع عند تصميم مثبطات كيناز Src ، لأنه يحتوي على موقعين محفوظين ل ATP وربط الركيزة (الشكل 1). إذا كان تسلسل الأحماض الأمينية لمجال الكيناز معروفا ، فيمكن أيضا استخدام الركيزة كهدف لتصميم مركب يحاكي ارتباط الركيزة ب Srckinase 8. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام مواقع أخرى مثل مجالات SH3 و SH2 كأهداف. بالمقارنة مع عوامل العلاج الكيميائي الأخرى ، تظهر مثبطات كيناز سمية أقل وفعالية أعلى9. اعتبارا من سبتمبر 2021 ، هناك 73 جزيئا صغيرا تعمل كمثبطات كيناز تمت الموافقة عليها من قبل إدارة الغذاء والدواءالأمريكية 10. إيماتينيب هو مثال على دواء مضاد للسرطان يثبط بشكل انتقائي نشاط التيروزين كيناز. ومع ذلك ، فإن بعض المرضى يقاومون الدواء بسبب ظهور طفرة نقطية في مجال كيناز11. أصدرت AstraZeneca Saracatinib ، وهو دواء يثبط عائلة Src من التيروزين كينازات بقيمة IC50 (التركيز الذي يحدث عنده تثبيط 50٪) من 2.7 نانومتر ، ولكن تم استبعاده في تجارب المرحلة2 12. من بين 52 مثبطا ل PTK معتمدة من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية اعتبارا من بداية عام 2020، 13 ، 28 مستقبلا مستهدفا فقط PTKs ، و 11 تمنع PTK غير المستقبلة ، و 11 تمنع كينازات بروتين السيرين / الثريونين ، وكتلتان MEK1/213. سيستمر الاهتمام البحثي المتزايد بعلم الأورام في تغذية اكتشاف مثبطات كيناز كأدوية محتملة مضادة للسرطان. ومع ذلك ، تم استهداف 50 فقط من أصل 500 بروتين كيناز للعلاج حتى الآن. لذلك ، من المتوقع دراسة عدد أكبر من الكينازات لتطوير الأدوية في المستقبل القريب14. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة لاكتشاف مثبطات كيناز لاستكشاف طفرات كيناز غير محددة حتى الآن والتي تؤدي إلى الإصابة بالسرطان.

وبالتالي ، هدفت هذه الدراسة إلى تطوير الببتيدات التي يمكن استخدامها كمثبطات لعائلة Src واستهداف موقع ربط ATP نظرا لقدرتها على العمل كموقع محفوظ بين الكينازات المختلفة. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تصنيع سلسلة من ثنائي الببتيدات التي تحتوي على التربتوفان الميثيلي و / أو الأرجينين الميثيلي واختبارها لقدرتها التآزرية على تثبيط كيناز Src. تحاكي حلقة الإندول من التربتوفان الأدينين من ATP وتتنافس مع ATP من الارتباط بموقع ربط ATP. بالإضافة إلى ذلك ، يتنافس الأرجينين الميثيلي في الترابط على مجال SH3 من Src. أظهر الباحثون أن عديد الببتيد الذي يحتوي على أرجينين منزوع الميثيل يثبط مجال SH3 ، ربما بسبب تسلسل محفوظ محدد على شكل ربط SH3 (أي PXXP) ، والذي له تقارب ملزم برابط يحتوي على اثنين إلى ثلاثة بقايا Arg في الطرف N أو واحد إلى اثنين من بقايا Arg على الطرف C للروابط15 ، 16،17. ترتبط مجموعة guanidino من Arg ببقايا Asp-99 المحفوظة لمجال SH318،19 ، بينما يرتبط الجزء المتبقي من Arg ب Trp-118 المحفوظ من الإنزيم ، كما هو مؤكد من تحليل الرنين المغناطيسي النووي والهياكل البلورية للعديد من مجالات SH319. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتخليق سبعة ثنائيات الببتيد الميثيلية واختبار قدرتها على تثبيط Src kinase. علاوة على ذلك ، تم فحص قدرة هذه الببتيدات على قتل العديد من خطوط الخلايا السرطانية في المختبر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تخليق الببتيدات

ملاحظة: يوصف توليف W-R كمثال تمثيلي (الشكل 2).

  1. تزن 566 مجم (0.3 ملليمول) من راتنج H-Arg (Pbf) -2-chlorotriryl وأضفها إلى وعاء تخليق الببتيد (انظر جدول المواد) ، وفقا للإجراء المستخدم من قبل Mandal et al20. إجراء تخليق الببتيد باستخدام استراتيجية تخليق الببتيد في الطور الصلب (SPPS)21.
    ملاحظة: تم تجميع ثنائي الببتيدات الميثيلية أو ثنائية الميثيل التي تحتوي على أحماض أمينية غير طبيعية على راتنج أميد حلبة التزلج (سعة تحميل 0.3 مليمول / جم) ، بينما تم تجميع ثنائي الببتيدات المحتوية على أحماض أمينية طبيعية على راتنج به أول حمض أميني متصل به ، مثل راتنج H-Arg (Pbf) -2-chlorotriryl (قدرة تحميل 0.3 مليمول / جم). الأهم من ذلك ، أن راتنج أميد حلبة التزلج ينتج ببتيد مغطى بمحطة C NH2.
  2. انتفخ الراتنج الجاف لمدة 1 ساعة في 5 مل من N ، N-dimethylformamide (DMF) تحت ضغط غاز النيتروجين المتصل بوعاء الببتيد.
    ملاحظة: قم بإجراء عملية التوليف بأكملها في غطاء الدخان. يجب ارتداء النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر طوال التجربة. يعد المؤقت ضروريا أيضا للتتبع بين خطوات إضافة الكاشف الكيميائي.
  3. قم بإزالة DMF الزائد باستخدام ضغط غاز النيتروجين المتصل بوعاء تخليق الببتيد طوال عملية التوليف.
  4. تزن 473.9 مجم من Fmoc-trp (Boc) -OH (0.9 ملليمول) و 341 مجم من 2- (1H-Benzotriazole-1-yl) -1،1،3،3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) (0.9 مليمول) كواشف اقتران. أضف المساحيق إلى أنبوب الاختبار وقم بإذابتها في 5 مل من DMF الجاف.
  5. أضف 313.4 ميكرولتر (1.8 ملليمول) من N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) كعامل تنشيط في أنبوب الاختبار (الخطوة 1.4) واخلطه عن طريق هز الأنبوب.
  6. أضف محتويات أنبوب الاختبار إلى الراتنج واترك التفاعل يستمر لمدة 1 ساعة تحت غاز النيتروجين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتصريف DMF الزائد باستخدام ضغط غاز النيتروجين واغسل الراتنج 3x باستخدام DMF.
  7. قم بإزالة حماية Fmoc الطرفي N باستخدام 5 مل من 20٪ بيبيريدين في DMF (v / v) لمدة 20 دقيقة تحت غاز النيتروجين. اغسل الراتنج 3x باستخدام DMF (3 × 5 مل).
  8. جفف الراتنج بإضافة 5 مل من ثنائي كلورو الميثان (DCM) واحتفظ به تحت غاز النيتروجين لمدة 5 دقائق ، ثم قم بتصريف DCM باستخدام ضغط غاز النيتروجين. أضف 5 مل من الميثانول تحت غاز النيتروجين لمدة 5 دقائق لزيادة جفاف الراتنج.
  9. أضف 10 مل من كوكتيل الانقسام الطازج من TFA / thioanisole / dithiothreitol / anisole (90: 3: 5: 2 v / v / w / v) لمدة 2.5 ساعة لإزالة حماية جميع السلاسل الجانبية وشق ثنائي الببتيد من الراتنج.
    تنبيه: يجب إضافة كوكتيل الانقسام في أسطوانة قياس زجاجية لأن TFA حمضي وخطير. توخي الحذر عند استخدامه.
  10. بعد 2.5 ساعة ، قم بتصريف محلول التفاعل من وعاء الببتيد باستخدام ضغط النيتروجين في قارورة قاعية مستديرة. أضف 250 مل من ثنائي إيثيل الأثير البارد (Et2O) إلى القارورة السفلية المستديرة التي تحتوي على الببتيد الخام لترسيب الببتيد.
  11. قم بتصفية الببتيد المترسب باستخدام ورق ترشيح في قمع مخروطي الشكل بذراع جانبي واحد متصل بالماء (بحيث يحدث الترشيح بسبب ضغط الماء) ، واجمع الراسب (الببتيدات) لإزالة الأثير تماما. يترسب الببتيد الخام في غضون 10 دقائق.
  12. قم بتنقية الببتيد الخام على عمود كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) ذو طور عكسي (انظر جدول المواد) باستخدام نظام التدرج. استخدم تدرجا من 0٪ -100٪ أسيتونيتريل يحتوي على 0.1٪ TFA في الماء الذي يحتوي على 0.1٪ TFA لمدة 30-60 دقيقة بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.

figure-protocol-1
الشكل 2: تخليق الببتيد في الطور الصلب ل W-R. الاختصارات: HBTU = 2- (1H-Benzotriazole-1-yl) -1،1،3،3-tetramethyluronium سداسي فلورو فوسفات ؛ DIPEA = N ، N-Diisopropylethylamine ؛ TFA = حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ؛ DMF = ثنائي ميثيل فورماميد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تحديد سمية الخلية للببتيدات المركبة

  1. لوحة 2,000 خلية / بئر من خلايا SK-OV-3 ، و 5,000 خلية / بئر من خلايا MDA-MB-231 ، أو 5 × 106 خلايا / بئر من خلايا CCRF-CEM (بحجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر / بئر) في صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئر. احتضان الخلايا في جو رطب من 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى 75٪ -80٪ التقاء.
    ملاحظة: تستخدم وسائط RPMI-16 لزراعة خلايا CCRF-CEM والحد الأدنى من الوسط الأساسي للنسر (EMEM) لكل من خطوط الخلايا MDA-MB-231 و SK-OV-3. يتم استكمال كلتا الوسائطين بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (10,000 وحدة/مل من البنسلين و 10 ملغم/مل من الستربتومايسين بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم). ضع جميع الوسائط والمكملات الغذائية في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل بدء التجربة. يجب إجراء التجربة في غطاء للسلامة البيولوجية ، وارتداء القفازات ومعطف المختبر.
  2. قم بشفط الوسط باستخدام ماصة وأضف 100 ميكرولتر من الببتيد 50 ميكرومتر أو 10 ميكرومولار دوكسوروبيسين (Dox) المستخدم كعنصر تحكم إيجابي في النسخ الثلاثية في الآبار التي تحتوي على ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية المطلية في اللوحة المكونة من 96 بئرا. أعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 72 ساعة (في نفس الظروف المذكورة في الخطوة 2.1).
  3. بعد 72 ساعة ، أضف 20 ميكرولتر من 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -5- (3-كربوكسي ميثوكسي فينيل) -2- (4-سلفوفينيل) -2H-tetrazolium (MTS) في اللوحة المكونة من 96 بئر. لف اللوحة بورق الألمنيوم واحتضان اللوحة لمدة 1-4 ساعات عند 37 درجة مئوية في جو رطب.
    ملاحظة: MTS هي صبغة تستخدم لتصور الخلايا الحية (غير المعالجة أو المعالجة بالببتيدات) ، حيث أن الخلايا الحية فقط هي التي تحول MTS tetrazolium إلى صبغة فورمازان ملونة يمكن قياسها عند 490 نانومتر.
  4. قم بقياس امتصاص منتج الفورمازان عند 490 نانومتر (A490) على قارئ صفيحة دقيقة (انظر جدول المواد). قم بتضمين وسيط مختلط مع MTS كفارغ للتجربة. استخدم الماء وحده (لأن الببتيدات قابلة للذوبان في الماء) و 0.1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك (حيث يتطلب WCH3 حمض الهيدروكلوريك للذوبان) كضوابط سلبية.
  5. قم بقياس النسبة المئوية لبقاء الخلية باستخدام المعادلة التالية (المعادلة 1) ، باستخدام برنامج جداول البيانات (انظر جدول المواد). الإجراء هو نفسه الذي استخدمه Mandal et al20.
    figure-protocol-2مكافئ (1)

3. مقايسة نشاط C-Src كيناز

ملاحظة: تم إجراء مقايسة نشاط كيناز Src باستخدام مجموعة مقايسة تجارية (انظر جدول المواد) في ثلاث نسخ ، وفقا لإجراء Chhikara et al.22. استخدم WCH3 و RCH3 وحدهما كعناصر تحكم لمقارنة تأثير الأحماض الأمينية الميثيلية وحدها على كيناز ومع حمض أميني ميثيل أو غير ميثلي.

  1. في صفيحة دقيقة مستديرة القاع ذات السطح الأسود غير الملزم ذات الحجم المنخفض 384 بئرا ، أضف 2.5 ميكرولتر من كوكتيل التفاعل الذي يحتوي على 0.7 نانومتر من مجال كيناز 6-Src الخاص به في المخزن المؤقت كيناز ، وهو جزء من مجموعة الفحص ، إلى 2.5 ميكرولتر من الببتيدات المخففة المذابة في 10٪ DMSO (تركيز هدف 4x). احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام شاكر صفيحة دقيقة (5 دورات في الدقيقة) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يتكون كوكتيل التفاعل من عازلة كيناز (200 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.5) ، MgCl2 (16 ملم) ، DMSO (4٪) ، EGTA (8 ملليمتر) ، 2-mercaptoethanol (43 ملليمتر) ، و Brij-35 (0.04٪). الركيزة المثلى لتفاعل كيناز لهذه التجربة هي (AEEEIYGEFEAKKKK).
  2. أضف 5 ميكرولتر من كوكتيل ATP / الركيزة (40 ميكرومتر / 600 ميكرومتر) إلى الطبق واحتضنه لمدة 30 دقيقة على شاكر صفيحة دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد خليط الكشف 1x ADP الذي يحتوي على 8 نانومتر من متتبع ADP و 10 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد ADP2 المترافق بالصبغة (انظر جدول المواد) لإيقاف واكتشاف المخزن المؤقت B (1x) من المجموعة. أوقف تفاعل كيناز (الخطوة 3.2) بإضافة 10 ميكرولتر من خليط الكشف عن 1x ADP واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  4. قم بقياس شدة التألق باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، مع إثارة عند 580 نانومتر ، وانبعاث عند 630 نانومتر ، وعرض نطاق 10 نانومتر. احصل على وحدات التألق النسبية (RFUs) من الأداة للحصول على النسبة المئوية لتثبيط الإنزيم ، وفقا للمعادل (2).
    figure-protocol-3مكافئ (2)
  5. احسب قيمة IC50 كما هو مدرج في موقع الشركة23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

WRCH3 ، WCH3-R CH3 ، WR (CH3) 2 ، WCH3-R ، WCH3-R (CH3) 2 ، وببتيدات التحكم W-R تم تصنيعها باستخدام تخليق الببتيد في الطور الصلب Fmoc (الشكل 3) ، مع نقاء 95٪ و 98.7٪ و 99٪ و 100٪ و 100٪ و 99.5٪ على التوالي. تم تأكيد الهياكل الكيميائية لهذه ثنائيات الببتيدات باستخدام ESI-MS. كانت قيم m / z لهذه ثنائيات الببتيدات 374.1624 و 388.1949 و 388.1794 و 374.1815 و 402.2022 و 361.1457 على التوالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي الببتيدات التي تم تصنيعها واختبارها هنا لتثبيط كيناز Src وما يترتب على ذلك من قتل الخلايا السرطانية على التربتوفان الميثيل و / أو الأرجينين الميثيلي ، وهي أحماض أمينية غير طبيعية. يعد تكوين الراسب الأبيض عند إضافة ثنائي إيثيل الأثير خطوة حاسمة في تخليق هذه الببتيدات. ومع ذلك ، لا يمكن لجميع الببتيدات الاصطناعية أن تشكل رواسب. لذلك ، حتى في حالة عدم تكوين راسب ، يمكن تأكيد تخليق الببتيد الناجح من خلال تحديد الكتلة المطلوبة باستخدام قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS). ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر عمادة البحث العلمي في جامعة الملك عبد العزيز ، جدة ، المملكة العربية السعودية ، التي مولت هذا المشروع بموجب منحة رقم. (ز: 031-130-1443).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1،4-DithiothreitolSigma-Aldrich10708984001تخليق الببتيد
قمع مرشح Aldrich fritted لتخليق المرحلة الصلبةSigma-AldrichZ283304وعاء تخليق الببتيد
Alexa594 TracerBell Brook Labs ، ماديسون ، ويسكونسن3013
AnisoleSigma-Aldrich8014520500
CellTiter 96 AQueous One  الحل  كواشف فحص تكاثر الخلايا PromegaG3582مقايسة تكاثر الخلايا (كاشف MTS)
ثنائي كلورو الميثان ، 99.9٪ ، فيشرشي الجاف الإضافيAC326850025
Fmoc-ADMA (Pbf) -OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg (Me ، Pbf) - OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg (Pbf) -OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-Trp (Boc) - OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 عمود  Shimadzu  (نظام RP-HPLC)ماء / أسيتونيتريل التدرج
IRDye QC-1 مرويبيل بروك لابز ، ماديسون ، ويسكونسن3013
قارئ Microplate SpectraMax M2eالجزيئية
Microsoft Excelبرنامججداول بيانات
N ، N-Diisopropylethylamine (DIPEA)Sigma-Aldrich496219
N ، N-Dimethylformamide ، اللامائي ، 99.8٪فيشرسيAA43997M1
بيبيريدين 20٪سيجما-ألدريتش80645
راتنج أميد حلبة الوحل (100-200 شبكة)سيجما ألدريتش8550010025
ثيوانيسولسيجما ألدريتش92358
Transcreener ADP2 FI فحصبيل بروك لابز ، ماديسون ، ويسكونسن3013مجموعة فحص نشاط كيناز c-Src
الأجهزة Microsoft

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20a%20leading%20cause,and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
  3. Negi, P., Cheke, R. S., Patil, V. M. Recent advances in pharmacological diversification of Src family kinase inhibitors. Egyptian Journal of Medical Human Genetics. 22 (1), 52(2021).
  4. Huang, X. L., et al. Role of receptor tyrosine kinases mediated signal transduction pathways in tumor growth and angiogenesis-New insight and futuristic vision. International Journal of Biological Macromolecules. 180, 739-752 (2021).
  5. Mohammed, S., et al. Sublethal doxorubicin promotes migration and invasion of breast cancer cells: role of Src Family non-receptor tyrosine kinases. Breast Cancer Research. 23 (1), 76(2021).
  6. Biscardi, J. S., Ishizawar, R. C., Silva, C. M., Parsons, S. J. Tyrosine kinase signalling in breast cancer: epidermal growth factor receptor and c-Src interactions in breast cancer. Breast Cancer Research. 2 (3), 1-8 (2000).
  7. Ortiz, M. A., et al. Src family kinases, adaptor proteins and the actin cytoskeleton in epithelial-to-mesenchymal transition. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 67(2021).
  8. Hill, Z. B., Perera, B. G., Andrews, S. S., Maly, D. J. Targeting diverse signaling interaction sites allows the rapid generation of bivalent kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 7 (3), 487-495 (2012).
  9. Wu, S., Fu, L. Tyrosine kinase inhibitors enhanced the efficacy of conventional chemotherapeutic agent in multidrug resistant cancer cells. Molecular Cancer. 17 (1), 25(2018).
  10. Ayala-Aguilera, C. C., et al. Small molecule kinase inhibitor drugs (1995-2021): Medical indication, pharmacology, and synthesis. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (2), 1047-1131 (2022).
  11. Lyczek, A., et al. Mutation in Abl kinase with altered drug-binding kinetics indicates a novel mechanism of imatinib resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (46), 2111451118(2021).
  12. Musumeci, F., Schenone, S., Brullo, C., Botta, M. An update on dual Src/Abl inhibitors. Future Medicinal Chemistry. 4 (6), 799-822 (2012).
  13. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors: A 2020 update. Pharmacological Research. 152, 104609(2020).
  14. Cohen, P., Cross, D., Jänne, P. A. Kinase drug discovery 20 years after imatinib: Progress and future directions. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (7), 551-569 (2021).
  15. Feng, S., Chen, J. K., Yu, H., Simon, J. A., Schreiber, S. L. Two binding orientations for peptides to the Src SH3 domain: development of a general model for SH3-ligand interactions. Science. 266 (5188), 1241-1247 (1994).
  16. Alexandropoulos, K., Cheng, G., Baltimore, D. Proline-rich sequences that bind to Src homology 3 domains with individual specificities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (8), 3110-3114 (1995).
  17. Feng, S., Kasahara, C., Rickles, R. J., Schreiber, S. L. Specific interactions outside the proline-rich core of two classes of Src homology 3 ligands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (26), 12408-12415 (1995).
  18. Polverini, E., Rangaraj, G., Libich, D. S., Boggs, J. M., Harauz, G. Binding of the proline-rich segment of myelin basic protein to SH3 domains: Spectroscopic, microarray, and modeling studies of ligand conformation and effects of posttranslational modifications. Biochemistry. 47 (1), 267-282 (2008).
  19. Weng, Z., et al. Structure-function analysis of SH3 domains: SH3 binding specificity altered by single amino acid substitutions. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5627-5634 (1995).
  20. Mandal, D., Nasrolahi Shirazi, A., Parang, K. Cell-penetrating homochiral cyclic peptides as nuclear-targeting molecular transporters. Angewandte Chemie. 50 (41), 9633-9637 (2011).
  21. Hussein, W. M., Skwarczynski, M., Toth, I. Peptide Synthesis: Methods and Protocols. , Humana Press. (2020).
  22. Chhikara, B. S., et al. Phenylpyrazalopyrimidines as tyrosine kinase inhibitors: Synthesis, antiproliferative activity, and molecular simulations. Molecules. 25 (9), 2135(2020).
  23. TRANSCREENER ADP2 Fl Assay. BellBrook Labs. , Available from: https://www.bellbrooklabs.com/wp-content/uploads/2021/03/Tech-Manual-ADP2-Fl-v031621.pdf (2022).
  24. Sanner, M. F., et al. Cyclic peptides as protein kinase inhibitors: Structure-activity relationship and molecular modeling. Journal of Chemical Information and Modeling. 61 (6), 3015-3026 (2021).
  25. Nahhas, A. F., Nahhas, A. F., Webster, T. J. The physical properties of tripeptide stereocomplex nano-formations. Journal of Biomedical Nanotechnology. 16 (10), 1495-1503 (2020).
  26. Nahhas, A. F., Chang, R., Webster, T. J. Introducing unnatural amino acids-containing tripeptides as antimicrobial and anticancer agents. Journal of Biomedical Nanotechnology. 14 (5), 987-993 (2018).
  27. Deng, G., et al. Tryptophan-containing dipeptide derivatives as potent PPARγ antagonists: design, synthesis, biological evaluation, and molecular modeling. European Journal of Medicinal Chemistry. 43 (12), 2699-2716 (2008).
  28. Chetty, V. T., Sharma, A. M. Can PPARγ agonists have a role in the management of obesity-related hypertension. Vascular Pharmacology. 45 (1), 46-53 (2006).
  29. Skeggs, L. T., Kahn, J. R., Shumway, N. P. The preparation and function of the hypertensin-converting enzyme. Journal of Experimental Medicine. 103 (3), 295-299 (1956).
  30. Lunow, D., Kaiser, S., Brückner, S., Gotsch, A., Henle, T. Selective release of ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides from food proteins by enzymatic hydrolysis. European Food Research and Technology. 237 (1), 27-37 (2013).
  31. Weber, J., Wilke-Mounts, S., Grell, E., Senior, A. E. Tryptophan fluorescence provides a direct probe of nucleotide binding in the noncatalytic sites of Escherichia coli F1-ATPase. The Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 11261-11268 (1994).
  32. Iavarone, A. T., Patriksson, A., vander Spoel, D., Parks, J. H. Fluorescence probe of Trp-cage protein conformation in solution and in gas phase. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6726-6735 (2007).
  33. Nongonierma, A. B., Fitzgerald, R. J. Inhibition of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) by tryptophan containing dipeptides. Food & Function. 4 (12), 1843-1849 (2013).
  34. Bjelke, J. R., et al. Dipeptidyl peptidases 8 and 9: specificity and molecular characterization compared with dipeptidyl peptidase IV. The Biochemical Journal. 396 (2), 391-399 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Src Kinase InhibitionMethylated DipeptidesSolid Phase Peptide SynthesisAnti Cancer PeptidesTyrosine Kinase ActivityAcellular AssaysPeptide PermeabilityCancer Cell LinesPeptide FunctionalizationIC50 Measurement