Method Article

التطبيقات التقنية لمصفوفة الأقطاب الدقيقة وتسجيلات المشبك التصحيحي على الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهرت الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-CMs) التي يسببها الإنسان كنموذج واعد في المختبر لفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ونمذجة الأمراض. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول لقياس الانقباض والفيزيولوجيا الكهربية ل hiPSC-CMs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي السبب الرئيسي لاستنزاف المخدرات والانسحاب من السوق. لذلك ، يعد استخدام نماذج تقييم سلامة القلب قبل السريرية المناسبة خطوة حاسمة أثناء تطوير الدواء. حاليا ، لا يزال تقييم سلامة القلب يعتمد بشكل كبير على الدراسات التي أجريت على الحيوانات. ومع ذلك ، تعاني النماذج الحيوانية من ضعف الخصوصية الانتقالية للبشر بسبب الاختلافات الخاصة بالأنواع ، خاصة من حيث الخصائص الكهروفسيولوجية القلبية. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لتطوير نموذج موثوق به وفعال وقائم على الإنسان لتقييم سلامة القلب قبل السريرية. ظهرت الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC-CMs) كنموذج لا يقدر بثمن في المختبر لفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ونمذجة الأمراض. يمكن الحصول على hiPSC-CMs من الأفراد ذوي الخلفيات الوراثية المتنوعة والحالات المرضية المختلفة ، مما يجعلها بديلا مثاليا لتقييم سمية القلب الناجمة عن الأدوية بشكل فردي. لذلك ، يجب وضع منهجيات للتحقيق الشامل في الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل العديد من الفحوصات الوظيفية التي يمكن تقييمها على hiPSC-CMs ، بما في ذلك قياس الانقباض ، والإمكانات الميدانية ، وإمكانات العمل ، ومعالجة الكالسيوم. بشكل عام ، فإن دمج hiPSC-CMs في تقييم سلامة القلب قبل السريرية لديه القدرة على إحداث ثورة في تطوير الأدوية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطوير الأدوية عملية طويلة ومكلفة. أفادت دراسة للعقاقير العلاجية الجديدة التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) بين عامي 2009 و 2018 أن متوسط التكلفة المقدرة للبحوث والتجارب السريرية المرسملة كان 985 مليون دولار لكل منتج1. السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي السبب الرئيسي لاستنزاف المخدرات والانسحاب من السوق2. والجدير بالذكر أنه تم الإبلاغ عن سمية القلب بين فئات متعددة من الأدوية العلاجية3. لذلك ، يعد تقييم سلامة القلب مكونا حاسما أثناء عملية تطوير الدواء. لا يزال النموذج الحالي لتقييم سلامة القلب يعتمد اعتمادا كبيرا على النماذج الحيوانية. ومع ذلك ، يتم التعرف بشكل متزايد على الاختلافات بين الأنواع من استخدام النماذج الحيوانية كسبب رئيسي للتنبؤات غير الدقيقة لسمية القلب الناجمة عن المخدرات في المرضى من البشر4. على سبيل المثال ، يختلف مورفولوجيا إمكانات عمل القلب اختلافا كبيرا بين البشر والفئران بسبب المساهمات من تيارات إعادة الاستقطاب المختلفة5. بالإضافة إلى ذلك ، تم توثيق الأشكال التفاضلية للميوسين القلبي والحمض النووي الريبي الدائري الذي يمكن أن يؤثر على فسيولوجيا القلب بشكل جيد بين الأنواع 6,7. لسد هذه الفجوات ، من الضروري إنشاء نموذج موثوق وفعال وقائم على الإنسان لتقييم سلامة القلب قبل السريرية.

أدى الاختراع الرائد لتكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) إلى إنشاء منصات غير مسبوقة لفحص الأدوية ونمذجة الأمراض. على مدى العقد الماضي ، أصبحت طرق توليد الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-CMs) التي يسببها الإنسانراسخة 8,9. اجتذبت hiPSC-CMs اهتماما كبيرا بتطبيقاتها المحتملة في نمذجة الأمراض ، وفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ، والطب الدقيق. على سبيل المثال ، تم استخدام hiPSC-CMs لنمذجة الأنماط الظاهرية المرضية لأمراض القلب الناجمة عن الوراثة الوراثية ، مثل متلازمة QT الطويلة 10 ، واعتلال عضلة القلب الضخامي11,12 ، واعتلال عضلة القلب الموسع13,14,15. ونتيجة لذلك، تم تحديد مسارات الإشارات الرئيسية المتورطة في التسبب في أمراض القلب، والتي يمكن أن تلقي الضوء على الاستراتيجيات العلاجية المحتملة للعلاج الفعال. علاوة على ذلك ، تم استخدام hiPSC-CMs لفحص سمية القلب الناجمة عن الأدوية المرتبطة بالعوامل المضادة للسرطان ، بما في ذلك مثبطات دوكسوروبيسين وتراستوزوماب والتيروزين كيناز16،17،18 ؛ ويجري التحقيق في استراتيجيات للتخفيف من سمية القلب الناتجة عن ذلك. وأخيرا ، فإن المعلومات الجينية المحتفظ بها في hiPSC-CMs تسمح بفحص والتنبؤ بسمية القلب الناجمة عن المخدرات على كل من المستوى الفردي والسكاني19,20. بشكل جماعي ، أثبتت hiPSC-CMs أنها أداة لا تقدر بثمن للتنبؤ بسلامة القلب الشخصية.

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وضع منهجيات للتحقيق بشكل شامل وفعال في الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs ، والتي لها أهمية كبيرة في تطبيق hiPSC-CMs نحو نمذجة الأمراض ، وفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ، والطب الدقيق. هنا ، نقوم بتفصيل مجموعة من الفحوصات الوظيفية لتقييم الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs ، بما في ذلك قياس الانقباض ، والإمكانات الميدانية ، وإمكانات العمل ، ومعالجة الكالسيوم (Ca2 +) (الشكل 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد وسائل الإعلام والحلول

  1. قم بإعداد وسيط صيانة hiPSC-CM عن طريق خلط زجاجة سعة 10 مل من مكمل B27 50x و 500 مل من RPMI 1640 متوسط. تخزين الوسط في 4 درجة مئوية واستخدامه في غضون شهر. قم بموازنة درجة حرارة المتوسط إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
  2. تحضير وسط البذر hiPSC-CM عن طريق خلط 20 مل من استبدال المصل و 180 مل من وسيط صيانة hiPSC-CM (تخفيف 10٪ ، v / v). في حين يفضل إعداد وسط البذر الطازج ، يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع. قم بموازنة الوسط إلى RT قبل الاستخدام.
  3. قم بإعداد محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية عن طريق إذابة زجاجة واحدة (10 مل) من مصفوفة الغشاء السفلي عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها واقتباس 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء السفلي في أنابيب معقمة 1.5 مل. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام. امزج 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء السفلي و 100 مل من وسط DMEM / F12 البارد (تخفيف 1:200 ، v / v) لصنع محلول طلاء مصفوفة الغشاء السفلي.
  4. قم بإعداد 50 مل من محلول Tyrode الذي يحتوي على 135 mM NaCl و 5.4 mM KCl و 1 mM MgCl 2 و 1.8 mM CaCl2 و 5 mM glucose و 10 mM HEPES. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام NaOH. قم بإعداد حل Tyrode الطازج في يوم التجربة.
  5. تحضير 50 مل من محلول ماصة داخل الخلايا يحتوي على 120 mM KCl و 1 mM MgCl2 و 10 mM EGTA و 10 mM HEPES. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 باستخدام KOH. Aliquot محلول ماصة داخل الخلايا في أنابيب معقمة 5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية. في يوم التجربة ، أضف MgATP حديثا إلى المحلول لتحقيق تركيز نهائي قدره 3 mM.
  6. تحضير 1 مل من محلول تحميل Fura-2 AM الذي يحتوي على 2 ميكرومتر Fura-2 AM و 0.1٪ Pluronic F-127. قم بإعداد حل تحميل جديد في يوم التجربة وحمايته من الضوء.

2. قياس حركة انكماش hiPSC-CM

  1. قم بإعداد ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء الطابق السفلي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية إلى كل بئر من لوحات 96 بئرا. احتضن صفائح البئر 96 في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  2. التفكك الأنزيمي ل hiPSC-CMs
    1. طلب hiPSCs من معهد ستانفورد للقلب والأوعية الدموية iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). إنشاء hiPSC-CMs وفقا للمنشورات السابقة 8,9. راقب hiPSC-CMs المستزرعة في ألواح من ستة آبار تحت المجهر عند تكبير 10x.
      ملاحظة: لا تقم بفصل الخلايا عندما لا تزال تكاثرية. خلاف ذلك ، سوف تنمو الخلايا على الآبار بعد إعادة الطلاء وتؤدي إلى نتائج غير دقيقة للفحوصات الوظيفية. عادة ، توقف hiPSC-CMs الانتشار في الأيام 18-23.
    2. تأكد من أن hiPSC-CMs تنبض بقوة ولها نقاء يزيد عن 95٪. تقييم النقاء عن طريق تلطيخ المناعة ضد التروبونين القلب T ، وهي علامة محددة من الخلايا العضلية القلبية 8,9.
    3. استنشاق وسيط الصيانة وغسل الخلايا مع 1x DPBS مرتين. أضف 1 مل من محلول انفصال الخلايا إلى كل بئر من ألواح البئر الستة واحتضنها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب مراقبة مدة الحضانة بانتظام. تأكد من عدم الإفراط في هضم الخلايا لأنها ستقلل من صلاحية الخلية.
    4. قم بسحب hiPSC-CMs بلطف لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة سعة 5 مل لإنشاء تعليق أحادي الخلية. أضف حجما متساويا من وسيط البذر hiPSC-CMs لتحييد محلول انفصال الخلايا.
    5. أجهزة الطرد المركزي hiPSC-CMs عند 300 × g لمدة 3 دقائق في RT. شفط supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1-2 مل من وسط البذر hiPSC-CM.
    6. حدد كثافة الخلية وقابليتها للحياة باستخدام طريقة استبعاد التربان الأزرق. باختصار ، امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع حجم متساو من التربان الأزرق ، وانقله إلى شريحة عد الخلايا ، ثم عد باستخدام عداد الخلايا ، كما هو موضح سابقا21.
  3. البذر hiPSC-CMs
    1. قم بإزالة محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية من لوحات 96 بئرا.
    2. زرع 50000 خلية لكل بئر في 100 ميكرولتر من وسط البذر hiPSC-CM ووضع لوحات 96 بئرا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
    3. استبدل وسيط البذر hiPSC-CM ب 100 ميكرولتر من وسيط صيانة hiPSC-CM بعد يوم واحد من الطلاء. تغيير وسيط صيانة hiPSC-CM كل 2 أيام حتى التسجيل.
  4. الحصول على البيانات
    1. قم بقياس حركة انكماش hiPSC-CM بعد 10 أيام على الأقل من الطلاء (مستحسن).
    2. قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة واضبط 37 درجة مئوية كدرجة الحرارة المفضلة. قم بتشغيل المجهر والكاميرا وإمدادات CO2 .
    3. املأ سترة الماء الخاصة بحامل اللوحة بكمية مناسبة من الماء المعقم منزوع الأيونات (الشكل 2A). ضع الصفيحة المكونة من 96 بئرا على حامل اللوحة واسمح للخلايا بالتأقلم لمدة 5 دقائق على الأقل.
    4. افتح برنامج العرض ، واضبط معدل إطارات الكاميرا على 75 إطارا في الثانية (fps) ودقة الفيديو / الصورة على 1024 × 1024 بكسل. تطبيق وظيفتي التركيز البؤري التلقائي والسطوع التلقائي. تسجيل مقاطع الفيديو والصور من hiPSC-CMs.
      ملاحظة: تجنب اهتزاز جدول المجهر أثناء التسجيل.
    5. افتح برنامج المحلل للتحليل التلقائي.

3. قياس إمكانات مجال hiPSC-CM

  1. إعداد لوحات مصفوفة الغشاء السفلي المغلفة
    1. ضع بعناية قطرة 8 ميكرولتر من محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية فوق منطقة قطب التسجيل لكل بئر من ألواح مصفوفة الأقطاب الدقيقة (MEA) المكونة من 48 بئرا. انظر الشكل 3A للحصول على منطقة القطب المناسب لوضع القطرات. هذه الخطوة ضرورية للحفاظ على الطبقة الأحادية hiPSC-CM مركزة على الأقطاب الكهربائية. تجنب لمس الأقطاب الكهربائية في أي ظرف من الظروف.
    2. أضف 3 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات إلى المنطقة المحيطة بالآبار (الشكل 3A) من ألواح MEA المكونة من 48 بئرا لمنع تبخر محلول الطلاء. احتضان 48 بئرا من ألواح MEA في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 45-60 دقيقة.
      ملاحظة: لا تحضن لفترة طويلة جدا لمنع مصفوفة الغشاء السفلي من التجفيف.
  2. إجراء التفكك الأنزيمي ل hiPSC-CMs كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  3. البذر hiPSC-CMs
    1. قم بإزالة معظم وسط المصفوفة خارج الخلية من سطح البئر دون لمس الأقطاب الكهربائية باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر داخل نفس الصف أو العمود الواحد.
    2. زرع 50000 خلية لكل بئر في قطرة 8 ميكرولتر من وسط البذر hiPSC-CM فوق منطقة قطب التسجيل لكل بئر من نفس الصف أو العمود.
    3. كرر الخطوتين الأخيرتين حتى يتم طلاء جميع الآبار بالخلايا. تحقق تحت المجهر من أن جميع الآبار تحتوي على تعليق hiPSC-CM. للاطلاع على الكثافة المطلوبة، انظر الشكل 3 ب.
      ملاحظة: سيتم اختراق مرفق hiPSC-CMs إذا تم تجفيف مصفوفة الغشاء السفلي تماما ، مما يجعل مرفق الخلية دون المستوى الأمثل.
    4. احتضان ألواح MEA ذات ال 48 بئرا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 60 دقيقة.
    5. أضف ببطء ولطف 150 ميكرولتر من وسط البذر hiPSC-CM إلى كل بئر من ألواح MEA ذات ال 48 بئرا. لإضافة وسط دون تشتيت hiPSC-CMs المزروعة مسبقا ، أمسك اللوحة بزاوية 45 درجة ، وقم بإمالة طرف الماصة على جدار كل بئر ، وحرر الوسط ببطء.
      ملاحظة: إضافة متوسطة بسرعة كبيرة أو مع ضغط عال سيؤدي إلى إزاحة الخلايا العضلية القلبية الملتصقة. تجنب الاتصال المباشر مع نظام التعليق السقوط hiPSC-CM.
    6. احتضن ألواح MEA ذات ال 48 بئرا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
    7. قم بتحديث وسط البذر hiPSC-CM مع 300 ميكرولتر من وسيط صيانة hiPSC-CM بعد 1 يوم من الطلاء. تغيير وسيط صيانة hiPSC-CM كل 2 أيام قبل التسجيل.
  4. الحصول على البيانات
    1. إجراء قياس MEA بعد 10 أيام على الأقل من الطلاء (مستحسن). في اليوم 10 بعد الطلاء ، تحقق من كثافة الطبقة الأحادية hiPSC-CM الضرب التلقائي تحت المجهر عند تكبير 10x ، والذي يجب أن يكون كما هو موضح في الشكل 3C.
    2. ضع لوحة MEA ذات ال 48 بئرا في أداة التسجيل. تسمح الشاشة التي تعمل باللمس بمراقبة درجة الحرارة (37 درجة مئوية) وحالة CO2 (5٪).
    3. افتح برنامج المستكشف. في نافذة الإعداد التجريبية، حدد تكوين القلب في الوقت الفعلي والتسجيلات المحتملة الميدانية. تطبيق تكوينات الضرب التلقائي أو الإيقاعي.
    4. في معلمات الكشف عن الإيقاع ، اضبط عتبة الكشف على 300 ميكروفولت ، والحد الأدنى لفترة الضرب إلى 250 مللي ثانية ، والحد الأقصى لفترة الضرب إلى 5 ثوان. حدد الانحدار متعدد الحدود لحساب مدة جهد الحقل (FPD).
    5. تحقق مما إذا كانت إشارة النشاط الكهربائي الأساسية ناضجة ومستقرة.
      ملاحظة: يجب أن تعكس الأشكال الموجية الناضجة التي يسجلها كل قطب كهربائي من صفيحة MEA متعددة الآبار إمكانات مجال القلب مع خصائص يمكن التعرف عليها بسهولة تتزامن مع ارتفاع إزالة الاستقطاب القلبي ومرحلة إعادة الاستقطاب ، كما هو موضح في الشكل 3D-F.
    6. الحصول على أنشطة القلب الأساسية لمدة 1-3 دقائق. إذا كانت هناك حاجة إلى علاج بالعقاقير ، أضف مركبات إلى الآبار بعد تسجيل خط الأساس. ضع اللوحة في حاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التسجيل التالي.

4. قياس إمكانات عمل hiPSC-CM

  1. قم بإعداد الأطباق المغلفة بمصفوفة الغشاء السفلي عن طريق وضع 500 ميكرولتر من محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية على الجزء السفلي من الزجاج من الأطباق مقاس 35 مم (الشكل 4A). احتضن الأطباق مقاس 35 مم في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  2. إجراء التفكك الأنزيمي ل hiPSC-CMs كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  3. البذر hiPSC-CMs
    1. قم بإزالة محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية من الأطباق مقاس 35 مم. زرع 50000 خلية لكل بئر في 500 ميكرولتر من وسط البذر hiPSC-CM على الجزء السفلي الزجاجي من أطباق 35 مم.
    2. احتضن الأطباق مقاس 35 مم في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها. قم بإزالة وسيط البذر hiPSC-CM وأضف 2 مل من وسيط صيانة hiPSC-CM إلى الأطباق مقاس 35 مم.
      ملاحظة: يوصى بوضع طرف غير مصفى سعة 200 ميكرولتر فوق ماصة الشفط سعة 2 مل لإزالة الوسط المستهلك لتجنب لمس الخلايا.
    3. تغيير وسيط ثقافة hiPSC-CM كل 2 أيام قبل التسجيل.
  4. الحصول على البيانات
    1. قم بإجراء قياس محتمل للإجراء بعد 10 أيام على الأقل من الطلاء (مستحسن). قم بإعداد محلول Tyrode الطازج كما هو موضح في الخطوة 1.4. قم بإذابة أليكوت واحد من محلول ماصة داخل الخلايا وأضف MgATP طازجا إلى تركيز نهائي قدره 3 mM.
    2. اسحب الماصات الدقيقة من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب الماصة الدقيقة.
      ملاحظة: يفضل مقاومة 2-5 MΩ من الماصات الدقيقة.
    3. استبدل وسيط الصيانة hiPSC-CM بمحلول Tyrode واسمح للخلايا بالتأقلم مع محلول Tyrode لمدة 15 دقيقة (الشكل 4C). أدخل مستشعرات درجة الحرارة في الغرفة ، وضع طبق 35 مم في الغرفة كما هو موضح في الشكل 4C ، واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية (الشكل 4D).
    4. املأ الماصات الدقيقة بمحلول داخل الخلايا وأدخلها في الحامل المتصل بمنضدة رأس مضخم التصحيح المشبك (الشكل 4E). افتح برنامج التحفيز / الاستحواذ ، وقم بتحميل بروتوكول تسجيل إمكانات الإجراء ، وحدد تكوين مشبك الجهد.
    5. أدخل الماصة الدقيقة في محلول الحمام ، وحدد hiPSC-CMs المفردة المناسبة ، واضبط وخفض موضع الماصة الدقيقة بجوار الخلية المحددة باستخدام مناور دقيق. عند إدخال طرف الماصة في محلول الحمام ، تحقق من مقاومة الماصة التي يمكن ملاحظتها على شاشة الذبذبات.
    6. ضع الماصة بالقرب من الخلية ، وستنخفض النبضات الحالية قليلا لتعكس مقاومة الختم المتزايدة. ضع شفطا لطيفا بضغط سلبي لزيادة المقاومة ، والتي ستشكل جيجاسيل. تطبيق وظيفة الختم .
    7. ضع شفطا إضافيا لكسر الغشاء للحصول على تكوين تسجيل خلية كاملة. بمجرد تمزق جزء الغشاء داخل منطقة الماصة عن طريق الشفط ، يكون المحلول الداخلي في حالة توازن مع سيتوبلازم الخلية. عند هذه النقطة، قم بالتبديل من وضع مشبك الجهد (V-المشبك) إلى وضع المشبك الحالي أو عدم وجود حقن تيار (C-Clamp) باستخدام مربع حوار مكبر الصوت. اضغط على الزر تسجيل لإنشاء ملفات تسجيل محتملة للإجراء وحفظها.
      ملاحظة: يوفر تغيير الوضع تسجيلا مستمرا لإمكانات العمل التلقائي ل hiPSC-CMs عبر أي مشغل ولا بروتوكول تسجيل تحفيزي ، والذي يمكن مراقبته عند إخراج V-mon لمضخم صوت المشبك التصحيحي.

5. قياس hiPSC-CM Ca2 + عابر

  1. ارجع إلى البروتوكول السابق لإعداد غرف خلية مخصصة لتصوير Ca 2+ 21. لإعداد غرفة الخلية المغلفة بمصفوفة الغشاء السفلي ، ضع 200 ميكرولتر من محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية في غرف الخلية. احتضان غرف الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  2. إجراء التفكك الأنزيمي ل hiPSC-CMs كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  3. البذر hiPSC-CMs
    1. قم بإزالة محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية من غرف الخلايا. زرع 20000 خلية لكل بئر في 200 ميكرولتر من وسط البذر hiPSC-CM.
    2. استبدل وسيط البذر hiPSC-CM ب 200 ميكرولتر من وسيط صيانة hiPSC-CM بعد 1 يوم من الطلاء. تغيير وسيط صيانة hiPSC-CM كل 2 أيام قبل التسجيل.
  4. الحصول على البيانات
    1. قم بإجراء قياس Ca2+ العابر بعد 10 أيام على الأقل من الطلاء (مستحسن). قم بإعداد محلول Tyrode الطازج كما هو موضح في الخطوة 1.4. قم بإعداد حل تحميل Fura-2 AM الطازج كما هو موضح في الخطوة 1.6.
    2. استنشق وسيط الصيانة hiPSC-CM واغسله بمحلول Tyrode مرتين. ضع 100 ميكرولتر من محلول تحميل Fura-2 AM واحتضنه لمدة 10 دقائق في RT.
    3. استبدل حل تحميل Fura-2 AM بمحلول Tyrode واسمح ب 5 دقائق على الأقل لإزالة الأسترة الكاملة من Fura-2 AM.
    4. أضف قطرة من زيت الغمر على الهدف 40x لمجهر فوق فلوري مقلوب مجهز بهدف غمر الزيت 40x (0.95 NA). ضع غرفة الخلية في محول المرحلة للمجهر (الشكل 5A).
    5. قم بتثبيت أسلاك التحكم في درجة الحرارة في غرفة الحمام واضبطها على 37 درجة مئوية. قم بتركيب أقطاب تحفيز المجال الكهربائي واضبط النبضات على 0.5 هرتز لمدة 20 مللي ثانية.
    6. قم بتشغيل مصدر الضوء فائق السرعة الذي يغير الطول الموجي واضبطه على وضع التبديل السريع 340 نانومتر و 380 نانومتر وفقا لتعليمات الجهاز.
    7. قم بتطبيق وقت تعرض يبلغ 20 مللي ثانية لكل من الأطوال الموجية ووقت تسجيل يبلغ 20 ثانية في البرنامج. سجل الفيديو الذي يعكس التغييرات في الوقت الفعلي ل Ca2+ عابرة في hiPSC-CMs. تصدير البيانات إلى جدول بيانات وتحليل البيانات كما هو موضح سابقا23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية قياس حركة الانكماش وإمكانات المجال وإمكانات العمل و Ca2+ العابر ل hiPSC-CMs. يوضح الشكل 1 مخططا تخطيطيا يتضمن الهضم الإنزيمي وبذر الخلايا والصيانة وتوصيل الفحص الوظيفي. يعد تكوين الطبقة الأحادية hiPSC-CM ضروريا لقياس حركة الانكماش (الشكل 2B). ويبين الشكل 2 جيم أثرا تمثيليا لحركة الانكماش والاسترخاء ل hiPSC-CMs. يتيح برنامج المحلل تحليل آثار حركة الانكماش والاسترخاء بطريقة آلية من خلال اكتشاف بداية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برزت تقنية iPSC البشرية كمنصة قوية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لقياس انقباض hiPSC-CM ، وإمكانات المجال ، وإمكانات العمل ، و Ca2 + العابر. يوفر هذا البروتوكول توصيفا شاملا لانقباض hiPSC-CM والفيزيولوجيا الكهربية. تم تطبيق هذه الفحوصات الوظيفية في منشورات متعددة من مجموعتنا 12،13،18،24،25،26،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. هو المؤسس المشارك لشركة Greenstone Biosciences ولكن ليس لديه مصالح متنافسة ، حيث أن العمل المعروض هنا مستقل تماما. ولا يعلن المؤلفون الآخرون عن أي مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بليك وو على التدقيق اللغوي للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 HL113006 و R01 HL141371 و R01 HL163680 و R01 HL141851 و U01FD005978 و NASA NNX16A069A (JCW) و AHA PostPhD Fellowship 872244 (GMP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
طبق سفلي زجاجي مقاس 35 مم مع زجاج غطاء 20 مم بئر صغير # 1.5غطاء CellvisD35-20-1.5-Nمشبك التصحيح
50x B27 مكملاتLife Technologies17504-044hiPSC-CM ثقافة متوسطة
6 آبار لوحة ثقافةE & K ScientificEK-27160hiPSC-CM ثقافة
96 بئر مسطحة قاع شفاف البوليسترين الأسود المعالج TC الصفائح الدقيقةCorning3603قياس حركة الانكماش
AccutaseSigma-AldrichA6964التفكك الأنزيمي
استوديو Axion المتكامل (AxIS)برنامج Axion Biosystemsالملاح
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكاتجهاز هارفاردBF 100-50-10 ،مشبك التصحيح
CaCl 2< / sub > 1 M في H2< / sub>OSigma-Aldrich21115Tyrode ' s الحل
شرائح غرفة عد الخلاياThermoFisher ScientificC10228الخلايا
CytoView 48 جيدا لوحات MEAAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM / F12Gibco / Life Technologies12634028وسط مصفوفة خارج الخلية
DPBS ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيومفيشر Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889محلول ماصة داخل الخلايا
EPC 10 USB & nbsp ؛ مكبر للصوت المشبك التصحيحWarnerInstruments 89-5000مشبك التصحيح
Fura-2 ، AM ، الخلية الدائمةThermoFisher ScientificF1221Ca2 + < / sup> قياس عابر
الجلوكوزسيجما ألدريتشG8270تيرود ' s الحل
HEPESسيجما ألدريتشH3375تيرود s الحل
hiPSCsمعهد ستانفورد للقلب والأوعية الدموية iPSC Biobank
KClسيجما ألدريتش529552تيرود ' s الحل
بالضربة القاضية استبدال المصلThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM بذر متوسط
KOH 8   ؛ MSigma-AldrichP4494محلول الماصة داخل الخلايا
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2 + < / sup> قياس عابر. مصدر ضوء تبديل الطول الموجي فائق السرعة
Luna-FL عداد الخلايا الفلورية الآليWISBIOMEDLB-L20001الخلايا
مايسترو برو   ؛ نظام MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) مصفوفة الغشاء القاعديCorning356231مصفوفة خارج الخلية المتوسطة
MgATPSigma-AldrichA9187محلول الماصة داخل الخلايا
MgCl2< / sub>Sigma-AldrichM8266Tyrode' s الحل
NaClسيجما ألدريتشS9888تيرود s الحل
هيدروكسيد الصوديوم 10   Mسيجما ألدريتش72068تيرود s الحل
NIS عناصر AR
Pluronic F-127 (حل 20٪ في DMSO)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2 + < / sup> قياس عابر
RPMI 1640 تقنيات العمر المتوسط11875-119hiPSC-CM ثقافة متوسطة
نظام Sony SI8000 نظام تصوير الحركة الخلية سونيالتكنولوجياالحيوية قياس الحركة الانكماش
مجتذب الماصة الدقيقةSutter InstrumentsP-97مشبك التصحيح
Trypan Blue stainLife TechnologiesT10282عد الخلايا
عد عد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216(2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345(2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628(2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859(2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117(2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662(2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565(2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

Related Articles