Method Article

التطبيقات التقنية لمصفوفة الأقطاب الدقيقة وتسجيلات المشبك التصحيحي على الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهرت الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-CMs) التي يسببها الإنسان كنموذج واعد في المختبر لفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ونمذجة الأمراض. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول لقياس الانقباض والفيزيولوجيا الكهربية ل hiPSC-CMs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي السبب الرئيسي لاستنزاف المخدرات والانسحاب من السوق. لذلك ، يعد استخدام نماذج تقييم سلامة القلب قبل السريرية المناسبة خطوة حاسمة أثناء تطوير الدواء. حاليا ، لا يزال تقييم سلامة القلب يعتمد بشكل كبير على الدراسات التي أجريت على الحيوانات. ومع ذلك ، تعاني النماذج الحيوانية من ضعف الخصوصية الانتقالية للبشر بسبب الاختلافات الخاصة بالأنواع ، خاصة من حيث الخصائص الكهروفسيولوجية القلبية. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لتطوير نموذج موثوق به وفعال وقائم على الإنسان لتقييم سلامة القلب قبل السريرية. ظهرت الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC-CMs) كنموذج لا يقدر بثمن في المختبر لفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ونمذجة الأمراض. يمكن الحصول على hiPSC-CMs من الأفراد ذوي الخلفيات الوراثية المتنوعة والحالات المرضية المختلفة ، مما يجعلها بديلا مثاليا لتقييم سمية القلب الناجمة عن الأدوية بشكل فردي. لذلك ، يجب وضع منهجيات للتحقيق الشامل في الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل العديد من الفحوصات الوظيفية التي يمكن تقييمها على hiPSC-CMs ، بما في ذلك قياس الانقباض ، والإمكانات الميدانية ، وإمكانات العمل ، ومعالجة الكالسيوم. بشكل عام ، فإن دمج hiPSC-CMs في تقييم سلامة القلب قبل السريرية لديه القدرة على إحداث ثورة في تطوير الأدوية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطوير الأدوية عملية طويلة ومكلفة. أفادت دراسة للعقاقير العلاجية الجديدة التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) بين عامي 2009 و 2018 أن متوسط التكلفة المقدرة للبحوث والتجارب السريرية المرسملة كان 985 مليون دولار لكل منتج1. السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي السبب الرئيسي لاستنزاف المخدرات والانسحاب من السوق2. والجدير بالذكر أنه تم الإبلاغ عن سمية القلب بين فئات متعددة من الأدوية العلاجية3. لذلك ، يعد تقييم سلامة القلب مكونا حاسما أثناء عملية تطوير الدواء. لا يزال النموذج الحالي لتقييم سلامة القلب يعتمد اعتمادا كبيرا على النماذج الحيوانية. ومع ذلك ، يتم التعرف بشكل متزايد على الاخت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد وسائل الإعلام والحلول

  1. قم بإعداد وسيط صيانة hiPSC-CM عن طريق خلط زجاجة سعة 10 مل من مكمل B27 50x و 500 مل من RPMI 1640 متوسط. تخزين الوسط في 4 درجة مئوية واستخدامه في غضون شهر. قم بموازنة درجة حرارة المتوسط إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
  2. تحضير وسط البذر hiPSC-CM عن طريق خلط 20 مل من استبدال المصل و 180 مل من وسيط صيانة hiPSC-CM (تخفيف 10٪ ، v / v). في حين يفضل إعداد وسط البذر الطازج ، يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع. قم بموازنة الوسط إلى RT قبل الاستخدام.
  3. قم بإعداد محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية عن طريق إذابة زجاجة واحدة (10 مل) من مصفوفة الغشاء السفلي عند 4 درجات مئوية بين عشية و....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية قياس حركة الانكماش وإمكانات المجال وإمكانات العمل و Ca2+ العابر ل hiPSC-CMs. يوضح الشكل 1 مخططا تخطيطيا يتضمن الهضم الإنزيمي وبذر الخلايا والصيانة وتوصيل الفحص الوظيفي. يعد تكوين الطبقة الأحادية hiPSC-CM ضروريا لقياس حركة الانكماش (الشكل 2B). ويبين الشكل 2 جيم أثرا تمثيليا لحركة الانكماش والاسترخاء ل hiPSC-CMs. يتيح برنامج المحلل تحليل آثار حركة الانكماش والاسترخاء بطريقة آلية من خلال اكتشاف بداية.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برزت تقنية iPSC البشرية كمنصة قوية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لقياس انقباض hiPSC-CM ، وإمكانات المجال ، وإمكانات العمل ، و Ca2 + العابر. يوفر هذا البروتوكول توصيفا شاملا لانقباض hiPSC-CM والفيزيولوجيا الكهربية. تم تطبيق هذه الفحوصات الوظيفية في منشورات متعددة من مجموعتنا 12،13،18،24،25،26،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. هو المؤسس المشارك لشركة Greenstone Biosciences ولكن ليس لديه مصالح متنافسة ، حيث أن العمل المعروض هنا مستقل تماما. ولا يعلن المؤلفون الآخرون عن أي مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بليك وو على التدقيق اللغوي للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 HL113006 و R01 HL141371 و R01 HL163680 و R01 HL141851 و U01FD005978 و NASA NNX16A069A (JCW) و AHA PostPhD Fellowship 872244 (GMP).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
طبق سفلي زجاجي مقاس 35 مم مع زجاج غطاء 20 مم بئر صغير # 1.5غطاء CellvisD35-20-1.5-Nمشبك التصحيح
50x B27 مكملاتLife Technologies17504-044hiPSC-CM ثقافة متوسطة
6 آبار لوحة ثقافةE & K ScientificEK-27160hiPSC-CM ثقافة
96 بئر مسطحة قاع شفاف البوليسترين الأسود المعالج TC الصفائح الدقيقةCorning3603قياس حركة الانكماش
AccutaseSigma-AldrichA6964التفكك الأنزيمي
استوديو Axion المتكامل (AxIS)برنامج Axion Biosystemsالملاح
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكاتجهاز هارفاردBF 100-50-10 ،مشبك التصحيح
CaCl 2< / sub > 1 M في H2< / sub>OSigma-Aldrich21115Tyrode ' s الحل
شرائح غرفة عد الخلاياThermoFisher ScientificC10228الخلايا
CytoView 48 جيدا لوحات MEAAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM / F12Gibco / Life Technologies12634028وسط مصفوفة خارج الخلية
DPBS ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيومفيشر Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889محلول ماصة داخل الخلايا
EPC 10 USB & nbsp ؛ مكبر للصوت المشبك التصحيحWarnerInstruments 89-5000مشبك التصحيح
Fura-2 ، AM ، الخلية الدائمةThermoFisher ScientificF1221Ca2 + < / sup> قياس عابر
الجلوكوزسيجما ألدريتشG8270تيرود ' s الحل
HEPESسيجما ألدريتشH3375تيرود s الحل
hiPSCsمعهد ستانفورد للقلب والأوعية الدموية iPSC Biobank
KClسيجما ألدريتش529552تيرود ' s الحل
بالضربة القاضية استبدال المصلThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM بذر متوسط
KOH 8   ؛ MSigma-AldrichP4494محلول الماصة داخل الخلايا
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2 + < / sup> قياس عابر. مصدر ضوء تبديل الطول الموجي فائق السرعة
Luna-FL عداد الخلايا الفلورية الآليWISBIOMEDLB-L20001الخلايا
مايسترو برو   ؛ نظام MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) مصفوفة الغشاء القاعديCorning356231مصفوفة خارج الخلية المتوسطة
MgATPSigma-AldrichA9187محلول الماصة داخل الخلايا
MgCl2< / sub>Sigma-AldrichM8266Tyrode' s الحل
NaClسيجما ألدريتشS9888تيرود s الحل
هيدروكسيد الصوديوم 10   Mسيجما ألدريتش72068تيرود s الحل
NIS عناصر AR
Pluronic F-127 (حل 20٪ في DMSO)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2 + < / sup> قياس عابر
RPMI 1640 تقنيات العمر المتوسط11875-119hiPSC-CM ثقافة متوسطة
نظام Sony SI8000 نظام تصوير الحركة الخلية سونيالتكنولوجياالحيوية قياس الحركة الانكماش
مجتذب الماصة الدقيقةSutter InstrumentsP-97مشبك التصحيح
Trypan Blue stainLife TechnologiesT10282عد الخلايا
عد عد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

Related Articles