Method Article

رسم خرائط كثافة الحمض النووي المطلقة في نوى الخلية باستخدام الفحص المجهري للتوطين أحادي الجزيء

DOI:

10.3791/64268

⸱

November 11th, 2025

 , 
1Institute of Molecular Biology (IMB), 2Max Planck Institute for Polymer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الحالي طريقة لقياس كثافة الحمض النووي المطلقة داخل نوى الخلية الملتصقة باستخدام فسيفساء Voronoi لبيانات الفحص المجهري للتوطين أحادي الجزيء ، والحجم المعروف ، وحجم الجينوم ، ومرحلة دورة الخلية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

داخل نواة الخلية ، توجد الجينات الصامتة بشكل عام في مناطق الكروماتين عالية الكثافة تسمى الكروماتين المتغاير ، بينما يمكن العثور على الجينات النشطة في الغالب في الواجهة بين الكروماتين والفضاء بين الكروماتين المسمى يوكروماتين. في الوقت الحاضر ، يعتمد توصيف eu- والكروماتين المتغاير في الغالب على التعديلات اللاجينية لبروتينات هيستون على طول تسلسل الحمض النووي ، في حين لا يعرف سوى القليل عن كثافة الحمض النووي المطلقة عبر نواة الخلية وآثارها الوظيفية. لا تزال نماذج النواة التي تعتمد فقط على البيانات والافتراضات الكيميائية الحيوية حول طبيعة الكروماتين كبوليمر تختلف اختلافا جوهريا عن بيانات التصوير الناتجة عن الفحص المجهري عالي الدقة. يشير هذا إلى أنه لا تزال هناك معلومات مهمة ذات صلة هيكلية مفقودة. نعتقد أن القيود المكانية قد تكون متورطة في تنظيم الجينات ، وبالتالي قمنا بتطوير طريقة تسمح بقياس كثافة الحمض النووي المطلقة في نوى خلايا الثدييات عن طريق تحويل بيانات التوطين فائقة الدقة إلى خرائط كثافة حقيقية إلى مقياس عن طريق فسيفساء فورونوي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ الأيام الأولى لبيولوجيا الخلية ، فتنت نواة الخلية - مقر المعلومات الجينية - علماء الأحياء. بعد تطبيق طرق التلوين الخلوية المطورة ذاتيا ، اكتشف إميل هيتز ، في عام 1928 ، مناطق ملطخة بشكل مكثف داخل نواة الخلية1. وأطلق على المناطق الأكثر تلطيخا وكثافة "الكروماتين المتغاير" ، بينما أطلق على المناطق الأقل تلطيخا والأقل كثافة "يوكروماتين". بمرور الوقت ، أصبح من الواضح أن الجينات النشطة موجودة في الغالب في euchromatin ، بينما وجد أن المناطق الأكثر كثافة غنية بالعناصر المتكررة والجينات الصامتة. نجا مصطلحا الكروماتين المتغاير ويوكروماتين حتى يومنا هذا على الرغم من تغير تعريفهما من الخصائص الهيكلية إلى الخصائص الجزيئية (انظر أدناه). نعلم اليوم أن نواة الخلية مقسمة إلى مرحلتين رئيسيتين. سائل واحد ( حجرة الكروماتين) ، والذي يضم الأجسام النووية ، وحجرة الربط ، والنيوكليوبلازم ، والآخر صلب يشبه مجال الكروماتين ، والذي يشمل مناطق الكروموسوم والنواة2. في واجهة الفضاء بين الكروماتين ، يكون الكروماتين أقل كثافة ، وهذا هو المكان الذي تحدث فيه العمليات النشطة وراثيا مثل النسخ والنسخ المتماثل والإصلاحفي الغالب 3،4،5 ، بينما بجوار الصفيحة ، وحول النواة ، وبالقرب من السنتروميرات ، يظهر الكروماتين مستويات ضغط عالية وهو بشكل عام غير نشط إلى حد ما من الناحية النسخية6.

على المستوى الجزيئي ، يتم بناء الكروماتين من الحمض النووي الملفوف حول النيوكليوسومات (ثماني بروتينات هيستون الأساسية). تمتلك الهستونات مجالات ذيل مضطربة جوهريا يمكن تعديلها بعد الترجمة عن طريق إضافة عدة مجموعات كيميائية (ميثيل ، أسيتيل ، فوسفور ، بيوتين) ، أحماض أمينية (أرجينين) ، أو حتى بروتينات (سومو ، يوبيكويتين) 7. يمكن قراءة هذه التعديلات وجذب بروتينات أخرى (على سبيل المثال ، إعادة تشكيل الكروماتين ، HP1 ، بروتينات الإصلاح ، الحمض النووي الريبي) وبالتالي تحديد الحالة الفسيولوجية لتسلسل الحمض النووي (متساهل / مقيد من الناحية النسخية) ، دون تغيير تسلسله مباشرة (وبالتالي "epi" الوراثي) 7. يمكن أن يختلف نوع وعدد التعديلات حول تسلسل معين اختلافا عميقا بين أنواع الخلايا ، ويمكن عكسها ، ويمكن أن يتغير خلال التطور والشيخوخة والمرض8،9،10. هناك تعديلات على ذيول هيستون أكثر انتشارا في المناطق المنسوخة للغاية والتعديلات التي تسود في مناطق الجينوم التي لها نشاط نسخ ضئيل أو معدوم.

على سبيل المثال ، عادة ما توصف المناطق المنسوخة للغاية والغنية بتعديلات H3K4 أو التي يتم إستيلات ذيولها من الهيستون على أنها يوكروماتين ، في حين يشار إلى المناطق الغنية بتعديلات الهيستون القمعية (H3K9me3 أو H3K27me3 أو H4K20me3) باسم الكروماتين المتغاير ، والذي ينقسم أيضا إلى كروماتين متغاير التأسيسي (غير نشط نسخيا في جميع الخلايا) (على سبيل المثال ، H4K20me3) والكروماتين المتغاير الاختياري (الكروماتين الذي يتم إسكاته اعتمادا على نوع الخلية ، على سبيل المثال ، H3K27me3) 6. على الرغم من أن الطرق البيولوجية الحيوية والجزيئية مناسبة تماما لقياس التغيرات الكيميائية على مستوى التسلسل ، إلا أنه من الصعب جدا استخدامها الإدلاء ببيانات حول الخصائص المكانية على المستوى المتوسط باستخدام هذه الطرق.

على سبيل المثال ، بذلت محاولات باستخدام معلومات القرب من تجارب Hi-C ، والتي تكتشف وترسم خريطة لنقاط القرب القريبة من الحمض النووي بين مناطق التسلسل ، لإعادة بناء النماذج المكانية للجينوم11. ومع ذلك ، تظهر المقارنة المباشرة مع صور الفحص المجهري للضوء والإلكترون عالية الدقة أن هذا ممكن فقط إلى حد محدود (الشكل 1). على الرغم من أن طرق مثل Hi-C12 ، يمكنها اكتشاف مناطق الكروموسومات في خلايا الطور البيني بشكل صحيح ككيانات منفصلة ، إلا أن هذه النماذج هي إلى حد ما "قصيرة النظر" ، لأن تقارب تسلسل الحمض النووي وحدها عمياء لتعكس العلاقات المكانية بين الأجزاء البعيدة من الجينوم ، وبالتالي فهي ليست مناسبة تماما لإعادة بناء الجينوم ثلاثي الأبعاد المناسب. لذلك ، لا يمكن أيضا أن تنعكس اختلافات الكثافة بشكل صحيح من خلال معلومات تردد الاتصال. يؤدي هذا إلى تمثيلات "معكرونة" للجينوم في النواة (انظر الشكل 1 ب) ، والتي يبدو أنها تحدث في كرة من الحلقات الشبيهة بالصوف والتي يمكن الوصول إليها بحرية.

ولتمهيد الطريق لصورة تكاملية وأكثر واقعية للنواة تجمع بين المعلومات الكيميائية الحيوية والبيانات الفيزيائية الحيوية والهيكلية، يجب تطوير أساليب تسمح بتوليد بيانات عن جوانب مختلفة من التنظيم النووي. حتى وقت قريب ، كان من الصعب أيضا تحديد كثافة الحمض النووي المطلقة في نوى الخلية من بيانات التصوير. كانت أسباب ذلك هي الدقة المحدودة للمجاهر الضوئية التقليدية ، ومشاكل في المجهر الإلكتروني لتلطيخ الحمض النووي على وجه التحديد ، وأحجام المراقبة الصغيرة في المجهر الإلكتروني.

دقة المجاهر الفلورية التقليدية محدودة بسبب حيود الضوء. تنتشر صورة مصدر نقطة للضوء بسبب حد الحيود ويمكن وصفها بواسطة وظيفة انتشار النقطة (PSF). وفقا ل PSF ، فإن صورة الفلوروفور ، التي يمكن اعتبارها في تقريب جيد كمصدر نقطي للضوء ، تحتل حجما بحجم معين حول مصدر منشأها (الفلوروفور) 13. عندما يتم إثارة العديد من الفلوروفورات ، الواقعة بالقرب من بعضها البعض من أبعاد صورها محدودة الحيود ، في وقت واحد ، يتم تثبيت توزيعات الكثافة المصورة ، ولا يمكن حل موقع الفلوروفورات الفردية. يسمح انبعاث الضوء العشوائي المتسلسل من الفلوروفورات (الوميض) بالعزل البصري للجزيئات الفردية ، وبالتالي العثور على مواقعها الدقيقة عن طريق تحديد مراكز الجاذبية الشدة لإشاراتها.

يمكن استخدام هذا لإعادة بناء المعلومات الهيكلية للعينات عن طريق تراكم بيانات توطين الفلوروفور من العديد من الصور المسجلة. يشار إلى هذه الطريقة عموما باسم الفحص المجهري للتوطين أحادي الجزيء (SMLM) (لمزيد من المعلومات انظر14). كلما زاد عدد الفوتونات التي ينبعث منها الفلوروفور أثناء "الوقت المحدد" ، يمكن تحديد مراكز الجاذبية الأكثر دقة. تقوم العدسات الاستجماتيزمية في مسار الحزمة بتحويل إشارات الفلوروفورات أعلى أو أسفل المستوى البؤري البصري إلى علامات حذف ، والتي يمكن استخدامها لتحديد موقعها على طول المحور البصري. يتم تدوير المحاور الطويلة للعلامات الناقص الناشئة عن إشارات الفلورسنت أسفل المستوى البؤري عند 90 درجة مقارنة بمحاور القطع الناقص الناشئة عن الفلوروفورات فوق المستوى البؤري. علاوة على ذلك ، تسمح نسبة المحاور لهذه القطع الناقص بتحديد موضع الجزيء على طول المحور البصري بالنسبة للمستوى البؤري في نطاق ±300 نانومتر15.

تعتمد جودة الصور فائقة الدقة الناتجة عن إعادة بناء أحداث وميض عشوائي بشدة على كثافة الملصقات وعدد أحداث الوميض. يعتمد هذا الأخير على الثبات الضوئي للفلوروفورات وعدد أحداث الوميض قبل أن تفشل في النهاية (عدد دورات التشغيل / الإيقاف). الطريقة الموضحة هنا للحصول على صور فائقة الدقة لتوزيع الحمض النووي داخل النواة تسمى fBALM (الفحص المجهري للتوطين المنشط بمساعدة الربط بمساعدة بنية الحمض النووي). يعتمد على الفلوروفورات التي تتداخل بشكل عابر في الأحماض النووية ولا تتألق إلا بمجرد ارتباطها بالحمض النووي16،17. نظرا للمخلفات المشحونة للعمود الفقري للفوسفور والديستر ، فإن الحمض النووي عبارة عن بوليمر سالب الشحنة للغاية. يتطلب تثبيت خيوط الحمض النووي التكميلية في الخلايا الحية تحييد البروتينات موجبة الشحنة (مثل الهستونات) والأيونات. عن طريق خفض درجة الحموضة ، يتم تقليل استقرار الاقتران التكميلي للقواعد للسماح للأصباغ المتداخلة بالانتشار داخل وخارج16،17.

اعتمادا على صبغة الفلورسنت المقحمة ، يمكن الوصول إلى هذه الحالة ضمن نطاق معين من الأس الهيدروجيني. تتألق الأصباغ الفلورية مثل YoYo-1 و SYTOX Orange فقط عند ربطها بالحمض النووي ولأن الأصباغ المقحمة (على عكس الأصباغ التي تربط الأخدود البسيط للحمض النووي مثل Hoechst و 4'،6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]) عادة ما ترتبط بطريقة مستقلة عن التسلسل ، فهي مناسبة تماما لرسم خرائط توزيع الحمض النووي داخل نوى الخلايا عن طريق الفحص المجهري للتوطين.

فسيفساء Voronoi هي طريقة رياضية تسمح بتقسيم الفضاء إلى أقسام مختلفة بناء على موقع النقاط. في 2D-Space ، يعكس حجم المربعات الناتجة عكس كثافة النقاط18. نظرا لأن الفحص المجهري للتوطين يعيد بناء الصور كمجموعة من النقاط التي تمثل موقع الفلوروفورات ، يمكن أن يساعد فسيفساء Voronoi في تحديد كثافة إشارات التوطين (الشكل 2). وبالتالي ، فإن استخدام صبغة خاصة بالحمض النووي كفلوروفور يسمح بقياس كثافة الحمض النووي.

تسمح المعرفة المسبقة بمحتوى الحمض النووي (عدد أزواج القاعدة) والبعد المكاني للنواة بتحويل كثافة الحمض النووي النسبية إلى كثافات مطلقة للحمض النووي. يوضح البروتوكول التالي رسم خرائط كثافات الحمض النووي المطلقة في الخلايا الملتصقة باستخدام SMLM بدقة عالية جدا ويوضح أن هذه الكثافات تخضع لاختلافات كبيرة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يقدم الشكل 3 نظرة عامة على سير العمل الموضح في هذا القسم. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل تتعلق بالكواشف والمواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول. يمكن الاطلاع على الكود المستخدم لهذا المنشور وتنزيله هنا: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. ثقافة الخلية

  1. ازرع خلايا C3H10T1/2 و HFB و HeLa في DMEM مع 10٪ مصل بقري جنيني عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مكمل ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. عندما تكون الخلايا قريبة من التقاء الخلايا ، قم بزراعة الخلايا الفرعية عن طريق تقسيمها بنسبة 1: 3 (C3H10T1/2 ، HFB) و 1:10 (HeLa) ، على التوالي.
  2. قبل يوم واحد من إجراء القياسات ، قم بزرع الخلايا من الثقافات التي تنمو بشكل كبير على طبق شبكي مقاس 35 مم. تأكد من أن أطباق المراقبة توفر جودة بصرية ممتازة للفحص المجهري الفلوري (قاع زجاجي بسمك 170 ميكرومتر ، # 1.5) وتمتلك شبكة لتحديد موقع الخلايا بشكل لا لبس فيه. تأكد أيضا من أن الخلايا في معلق أحادي الخلية وأن كامل مساحة سطح الطبق مغطاة بشكل متجانس بالخلايا.
    ملاحظة: يوصى باستخدام أطباق ذات شبكة مطبوعة للعثور مرة أخرى على الخلايا الدقيقة التي تم تعيينها لمرحلة دورة خلية معينة.
  3. إذا طلبت التجربة ذلك ، أضف 100 نانومتر Trichostatin A (TSA) إلى وسط زراعة الخلايا واحتضان الخلايا في ظل الظروف الموضحة سابقا في الخطوة 1.1.

2. تحضير العينة

  1. في يوم القياس ، اغسل الخلايا مرة واحدة ب 1x DPBS قبل تثبيتها لمدة 30 دقيقة في 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في 1x DPBS.
    ملاحظة: للحصول على نتائج قابلة للتكرار ، تأكد من تحضير محلول PFA جديد في كل مرة وحرص بشكل خاص على دقة تركيز PFA.
  2. بعد إزالة المثبت ، اغسل الخلايا مرة أخرى 2x مع 1x DPBS قبل اختراقها لمدة 20 دقيقة في 1x DPBS تحتوي على 0.4٪ Triton X-100.
  3. قم بإزالة المخزن المؤقت للنفاذية باستخدام ماصة وقم بتنفيذ خطوة غسيل إضافية باستخدام 1x DPBS قبل معالجة الخلايا بكوكتيل RNase (التخفيف 1: 1,000 في 1x DPBS). ضع الخلايا في حاضنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة.
  4. قم بإعداد محلول التلوين عن طريق تخفيف محلول مخزون SYTOX Orange القادر على fBALM (5 ملي مولار في 1x DPBS عند تخفيف 1: 10,000).
  5. قم بإزالة المخزن المؤقت RNase باستخدام ماصة وقم بتطبيق خطوة غسيل إضافية باستخدام 1x DPBS قبل إضافة محلول التلوين. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة لمدة 5 دقائق.
  6. قم بإزالة محلول تلطيخ SYTOX Orange من الخلايا باستخدام ماصة ، واغسلها ب 1x DPBS ، وقم بتخزين الخلايا في 1x DPBS ، محمية من الضوء الشديد.

3. تحديد دورة الخلية الخلوية

ملاحظة: في هذه الخطوة ، تم استخدام مجهر فحص مقلوب عالي المحتوى هنا ، ولكن يمكن استخدام أي مجهر مضان آلي عكسي واسع المجال. شدة النواة بأكملها هي مقياس لمحتوى الحمض النووي الخاص بها. ومن ثم ، تأكد من فتح الثقب بالكامل إذا كنت تستخدم نظاما متحد البؤر. يفضل استخدام العدسات الهوائية الشيئية ذات الفتحة العددية المنخفضة (NA) على العدسات الموضوعية الغاطسة بالزيت.

  1. ضع الطبق مع الخلايا على مجهر مضان عكسي مزود بمرحلة آلية وبرنامج يسمح بإعادة بناء مساحات كبيرة على العينة عن طريق خياطة الصور المسجلة تلقائيا معا.
  2. اختر عدسة موضوعية تسمح بتسجيل خلايا كافية لكل مجال رؤية (ما لا يقل عن 900 نواة مفردة في المجموع [للحصول على التفاصيل ، انظر Roukos et al.19]) بحيث يمكن إجراء الحصول على الصورة لتحديد دورة الخلية في غضون فترة زمنية معقولة. استخدم عدسة لا تظهر اختلافات كبيرة في الشدة بين المركز والحدود. إذا لم تكن هذه العدسة متوفرة، فقم بتطبيق تصحيح المجال المسطح على الصور (انظر الخطوة 7). لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم مجهره مضان واسع المجال مزودا بعدسة هوائية 20x NA 0.4 بعمق تركيز = 8 ميكرومتر.
  3. أثناء الحصول على الصورة ، قم بتغطية المنطقة المركزية من الطبق باستخدام المرشحات المناسبة للفلوروفور المستخدم. التقط صور الحقل الساطع في وضع الضوء المرسل.
    ملاحظة: تعد صور Brightfield مهمة لنقل الخلايا على الشبكة في الخطوة 4.6.
  4. ضع الطبق مع الخلايا في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية حتى الخطوة 4.4.
  5. أعد بناء المنطقة الممسوحة ضوئيا من الصور الفردية عن طريق تجانب الصور الفردية المسجلة معا.
  6. انقل بيانات صورة صبغة الحمض النووي الفلورية إلى جهاز كمبيوتر يقوم بتشغيل البرنامج مفتوح المصدر CellProfiler4.2.120.
  7. إذا كان تصحيح المجال المسطح لصور التألق ضروريا ، فقم بإنشاء صورة مرجعية للمجهر المستخدم من الصور المسجلة. افتح خط أنابيب Illumination Correction.cpproj (مضمن كملف تكميلي 1) ؛ لاحظ أن خط الأنابيب يظهر كتسلسل على الشاشة يمكن من خلاله النقر فوق خطوات مختلفة. اسحب الصور وأفلتها في الحقل المخصص في صور الخطوة الأولى لخط الأنابيب.
    ملاحظة: تأكد من استبعاد جميع البيانات غير المتعلقة بالصور في الملفات المدرجة باستخدام خيارات التصفية في الجزء السفلي من النافذة.
  8. في الخطوة الأخيرة من خط أنابيب تصحيح الإضاءة ، انقر فوق حفظ الصور لتحديد موقع حيث سيتم تخزين الصور المرجعية ، ثم انقر فوق الزر تحليل الصور .
  9. افتح خط الأنابيب CellCycleAnalysis.cpproj (مضمن كملف تكميلي 2). قم بسحب الصور المسجلة في الخطوة 3.3 وإفلاتها (انظر الشكل 4 أ كمثال) ، بما في ذلك الصورة المرجعية (الخطوة 3.8) ، في الحقل المخصص في الخطوة الأولى صور خط الأنابيب.
    ملاحظة: تأكد من استبعاد جميع البيانات غير المتعلقة بالصور في الملفات المدرجة باستخدام خيارات التصفية في الجزء السفلي من النافذة.
  10. في الخطوة CorrectIlluminationApply في خط الأنابيب، اختر الصورة المرجعية في القائمة المنسدلة عن طريق تحديد وظيفة تحديد الإضاءة.
  11. في الخطوة الأخيرة من خط أنابيب تحليل دورة الخلية ، حدد موقعا تم فيه تخزين الصورة المرجعية في الخطوة 3.7 وانقر فوق الزر تحليل الصور لبدء القياس المجمع لشدة التألق المدمجة لجميع النوى داخل الصور المسجلة في الخطوة 3.3.
    ملاحظة: سيقوم CellProfiler4.2.1 بإنشاء ملف نصي "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt" يحتوي على بيانات كل نواة تم قياسها (Image، ObjectID، شدة التألق المدمجة، إحداثيات الصورة) بتنسيق CSV.
  12. تأكد من تحديد عنصر DisplayHistogram في المسار على أنه نشط.
  13. لاحظ شدة التألق المدمجة في الرسم البياني ل G1 و G2 (انظر الشكل 4 ب كمثال) القمم وأدخل الفواصل الزمنية المحيطة بها في عناصر FilteredObjects في خط الأنابيب. قم بتنشيط عناصر المسار بالنقر فوق خانات الاختيار.
  14. قم بتنشيط عناصر خط أنابيب DisplayDataOnImage المقابلة لإنشاء صورة تبرز الخلايا في المرحلةG 1 أو G2 وقم بتشغيل خط الأنابيب مرة أخرى (انظر الشكل 4C كمثال).
  15. اختر ما يصل إلى خمس خلايا تمثل مرحلة دورة الخلية المطلوبة من الصورة التي تم إنشاؤها في المنطقة المحددة من غرفة المراقبة وحاول نقل الخلايا على مجهر SMLM.
    ملاحظة: نظرا لاستخدام خطين من الخلايا بحجم جينوم غير معروف هنا ، فقد تم تحديد أحجام الجينوم من خلال مقارنة قمم G1 لخط خلايا الخلايا الليفية البشرية بقمم G1 من HeLa وخلايا C3H10T1/2. يمكن عرض الرسوم البيانية والعلاقة النسبية بين أحجام الجينوم في الشكل التكميلي S1.

4. SMLM-fBALM

ملاحظة: على الرغم من أن المجموع الصافي للأكسجين في هذه التفاعلات الكيميائية الحيوية مجتمعة هو صفر ، فمن المستحسن إجراء التفاعل في طبق غير مغلق ، لأن تركيزات الأكسجين المحدودة يمكن أن تبطئ إنتاج D-glucono-1،5-lactone. يؤدي التركيز المتزايد ل D-glucono-1،5-lactone إلى خفض درجة الحموضة تدريجيا ، وهو أمر ضروري لأن الخفض الفوري للأس الهيدروجيني سيغير البنية التحتية للعينة.

  1. قم بإعداد 1 مل من المخزن المؤقت للتصوير عن طريق خلط المكونات التالية: 900 ميكرولتر من الجلوكوز (1 جم / مل من الجلوكوز في 1x DPBS) ، و 50 ميكرولتر من أوكسيديز الجلوكوز (0.5 مجم / مل في 1x DPBS) ، و 50 ميكرولتر من الكاتلاز (40 ميكروغرام / مل في 1x DPBS).
  2. قم بإزالة 1x DPBS من العينة باستخدام ماصة وأضف 1 مل من المخزن المؤقت للتصوير إلى الطبق الذي يحتوي على الخلايا.
  3. قم بتركيب الطبق على مسرح مجهر قادر على SMLM. استخدم عدسة موضوعية عالية NA وتكبير بصري عالي.
  4. حدد موقع إحدى النوى المختارة (من الخطوة 3.15) باستخدام نظام إحداثيات الطبق وقم بتوسيطه في مجال رؤية الكاميرا.
    ملاحظة: يستغرق التفاعل الأنزيمي ~ 60-180 دقيقة حتى يتم الوصول إلى الرقم الهيدروجيني الصحيح لطريقة fBALM ويسهل الوميض المناسب. يوصى بتركيب طبق المراقبة في أسرع وقت ممكن لتوفير الوقت الكافي للعينة للتكيف مع درجة حرارة الجهاز لأن التغيرات في درجات الحرارة يمكن أن تؤدي إلى الانجراف المحوري. تأكد من أن درجة الحرارة في الغرفة التي تحتوي على مجهر SMLM مستقرة طوال القياس.
  5. حدد ارتفاع النواة عن طريق تغيير التركيز باستخدام محرك z الخاص بالمجهر وتسجيل موضع الحدود العليا والسفلية.
  6. في نقاط زمنية مختلفة ، تحقق من الوميض المناسب الناتج عن عملية fBALM عن طريق زيادة طاقة الليزر. بمجرد أن تظهر العينة وميضا عشوائيا مناسبا ، ابدأ في الحصول على سلسلة الصور اللازمة لإعادة بناء SMLM فائق الحلية.
    ملاحظة: يجب أن يكون المجهر المستخدم في fBALM مزودا بليزر مثير مناسب لإثارة الفلوروفور المستخدم والذي يمكن أن يولد كثافة فوتون عالية بما فيه الكفاية لضمان عدد كاف من الفوتونات لكل إطار. اختبر هذا في تجربة تجريبية قبل جميع التجارب الأخرى.
  7. بمجرد ضمان الوميض الصحيح لعملية fBALM ، ابدأ في الحصول على سلسلة الصور باستخدام وقت تعريض ضوئي يبلغ 50 مللي ثانية ، مما ينتج عنه معدل إطارات ~ 20 إطارا في الثانية.
  8. خذ مكدسة z عبر النواة (حول القسم الأوسط) بفواصل خطوات 200 نانومتر و 500 إطار فقط لكل قسم بصري ضوئي. مرة أخرى في القسم الأوسط ، التقط سلسلة صور من 50,000 إطار لجمع أحداث وامضة كافية لإعادة بناء جيدة للتفاصيل الهيكلية بدقة توطين عالية (سيستغرق ذلك ~ 45 دقيقة).
    ملاحظة: المكدس z مهم لتحديد جزء القسم الأوسط من إشارة الحمض النووي فيما يتعلق بالنواة بأكملها. تأكد من أن حجم البكسل الفعال مناسب تماما ل SMLM22 وأن الإشارة الموجودة على الكاميرا لا تشبع المستشعر.
  9. تأكد من استيفاء المتطلبات التالية
    1. تأكد من أن كمبيوتر الاكتساب يحتوي على مساحة قرص كافية حيث يمكن أن تصبح أحجام ملفات مكدسات الصور كبيرة جدا اعتمادا على عدد الصور وحجمها 16 بت.
    2. تأكد من أن الكمبيوتر الذي يقوم بتشغيل برنامج الاقتناء يمكنه التعامل مع نظام ملفات على جهاز التخزين المستخدم القادر على التعامل مع أحجام الملفات الكبيرة (>4 جيجابايت) وأن معدل النقل إلى جهاز التخزين مرتفع بما يكفي لكتابة الملفات في الوقت الفعلي عند تسجيل بيانات الصورة مباشرة إلى جهاز التخزين.
    3. عند حفظ البيانات بعد الحصول على الصورة، تأكد من أن الكمبيوتر مزود بذاكرة وصول عشوائي كافية (على سبيل المثال، 64 جيجابايت).

5. تحضير وتسجيل طبق بخرز الفلورسنت لمعايرة z لمجهر SMLM

ملاحظة: من أجل المعايرة المحورية المناسبة لعدسات الاستجماتيزم الخاصة بالمجهر لتعيين المواقع الصحيحة على طول المحور البصري ، يجب مراعاة تسجيل أكوام z من حبات الفلورسنت 100 نانومتر.

  1. خفف الخرز 1: 10,000 في 1x DPBS وبذور 100 نانومتر على نفس نوع الأطباق المستخدمة في قياسات SMLM.
    ملاحظة: استخدم فقط أفضل جودة ومواصفات بصرية مثل #1.5 أغطية.
  2. قم بتركيب طبق المعايرة على المجهر. تسجيل مكدسات الصور من خلال المستوى البؤري للحبات (~ 1,5 ميكرومتر في المجموع ؛ 10 خطوات نانومتر مستخدمة هنا)15.
  3. نقل البيانات إلى كمبيوتر تحليل البيانات.
    ملاحظة: لا تقم بتخزين شرائح المعايرة واستخدامها لفترة طويلة.

6. معالجة بيانات SMLM

ملاحظة: تم استخدام المكون الإضافي ImageJ23 "ThunderSTORM"24 لتسجيل الترجمات (على سبيل المثال، تحويل النقاط الوامضة في مكدس الصور إلى قائمة تحتوي على إحداثيات الترجمة ورقم الإطار وما إلى ذلك). يعمل ImageJ أو Fiji25 على جميع أنظمة تشغيل سطح المكتب الرئيسية (Linux / Windows / macOS) ويمكن تنزيله واستخدامه مجانا.

  1. لاستخدام ThunderSTORM في FijI ، تأكد من إضافة موقع تحديث Hohlbein Lab ضمن HELP | تحديث | إدارة مواقع التحديث، وحدد خانة الاختيار الخاصة بمختبر Hohlbein، وأعد تشغيل فيجي. تأكد من أن البرنامج لديه إمكانية الوصول إلى ذاكرة كافية.
    ملاحظة: يجب أن تكون بيانات الصورة بتنسيق ملف يمكن قراءته بواسطة ImageJ/Fiji. عند تسجيل البيانات على نظام تجاري قياسي ، افتح البيانات مباشرة باستخدام المكون الإضافي Bio-Formats ل ImageJ (الذي يأتي تلقائيا مع فيجي). في هذه الحالة ، تم استخدام برنامج نصي MATLAB h52tif.m (الموجود في صفحة GitHub المذكورة في بداية البروتوكول) لتحويل البيانات المسجلة بواسطة الإعداد المخصص الخاص بنا من تنسيق hdf5 إلى تنسيق TIFF.
    1. اعتمادا على مقدار الذاكرة المتوفرة في النظام المستخدم وعدد الإطارات المراد تسجيلها ، قم بتقسيم البيانات إلى عدة مجموعات فرعية لتجنب نفاد الذاكرة.
      ملاحظة: في ما يلي، يتم استخدام الإعدادات التي تم استخدامها لاستخراج البيانات الموضحة في قسم النتائج. للحصول على شرح أكثر تفصيلا لإعدادات ThunderSTORM ، راجع دروس ThunderSTORM ، والتي يمكن العثور عليها عبر الإنترنت.
  2. قم بتحسين الإعدادات لاكتشاف الإشارات الوامضة عن طريق تكييف إعدادات ThunderSTORM وفقا لظروف التسجيل المطلوبة. انقر فوق ThunderSTORM | قم بتشغيل التحليل ، واختر إعداد الكاميرا وأدخل حجم البكسل الصحيح لبيانات الصورة ، وعدد A / D ، والكفاءة الكمومية للكاميرا المستخدمة ، والمستوى الأساسي ، وكسب EM (لهذا الإعداد ، حجم البكسل: 65 نانومتر ، عدد A / D: 0.64 ، الكفاءة الكمومية: 0.8).
  3. بعد ذلك ، اختر الخوارزمية لتحديد إحداثيات الترجمة عن طريق تركيب الإشارات الوامضة. في قسم تصفية الصور ، استخدم مرشح المويجة (B-Spline) بترتيب B-Spline 3 ومقياس B-Spline 2.0. بالنسبة للإعدادات الأخرى ، اضبط طريقة التوطين التقريبي للجزيئات على الحد الأقصى المحلي ، وعتبة شدة الذروة إلى 2 * std (Wave.F1) ، والاتصال إلى 8 جوار. في قسم توطين البكسل الفرعي للجزيئات ، اختر PSF: Gaussian المتكامل ، نصف قطر التركيب [px]: 3 ، طريقة التركيب: الاحتمالية القصوى ، و sigma الأولي [px]: 1.6.
  4. قم بتشغيل المكون الإضافي لإنشاء جدول يحتوي على إدخال لكل ترجمة تم اكتشافها وخصائصها. احفظ الجدول على القرص الصلب.
  5. إذا كانت هناك حاجة إلى تحليل مكدسات صور متعددة أو كان لا بد من تقسيم مكدسات الصور إلى عدة مكدسات (على سبيل المثال ، للسماح بتحليل مجموعات البيانات الكبيرة أو في حالة عدم توفر الكثير من الذاكرة في كمبيوتر تحليل البيانات) ، فقم بأتمتة اكتشاف الترجمة عن طريق تشغيل ماكرو.
  6. إذا كان لا بد من تقسيم بيانات الاكتساب إلى مجموعات صور متعددة ، فقم بتسلسل جداول الترجمة في ThunderSTORM عن طريق استيراد ملف تلو الآخر. تأكد من تنشيط الخيار إلحاق بالجدول الحالي في القائمة استيراد واستخدام رقم البداية الصحيح لتجنب الكتابة فوق الترجمة في الجدول.
  7. بمجرد إنشاء جدول الترجمة الكامل، تحقق من النتيجة عن طريق إعادة إنشاء الصورة من المواقع في جدول النتائج. اضغط على زر التصور في نافذة نتائج ThunderSTORM وانتظر حتى تظهر الصورة المعاد بناؤها (على سبيل المثال ، الرسم البياني للترجمة).
  8. تحقق من الصورة المعاد بناؤها بحثا عن مشكلات مثل الانجراف الجانبي وقطع أثرية التصوير الأخرى. قم بقياس وتصحيح الانجراف في القائمة الفرعية للانجراف عن طريق تحديد الارتباط المتبادل للأقسام الفرعية الملخصة من مكدس البيانات (المستخدم هنا) أو باستخدام العلامات الائتمانية في العينة. بعد الضغط على قائمة >> ، أدخل 5 صناديق وعامل التكبير (6.5 في هذا البروتوكول). انتظر حتى تظهر نافذة تظهر الانجراف x و y.
    ملاحظة: قد لا تزال الصور الأولى بعد التسجيل تعاني من مضان قوي في الخلفية (مع إحضار الفلوروفورات إلى الحالة المظلمة) ؛ وبالتالي ، قد يكون من الضروري استبعاد أول بضع مئات من الصور من التحليل (على سبيل المثال ، اكتب "frame >500" في حقل Filter في نافذة ThunderSTORM الرئيسية).
  9. لتجنب المبالغة في حساب الإشارات المرئية على عدة إطارات متتالية ، قم بتطبيق الدمج على بيانات الترجمة باستخدام نصف قطر يأخذ في الاعتبار متوسط دقة الترجمة (20 نانومتر هنا) ، وإطار داكن واحد ، و 0 إطارات كحد أقصى (لا توجد قيود على الحد الأقصى لوقت تشغيل الجزيء).
  10. إذا كان لا بد من تحليل قسم ضوئي رفيع للغاية خفيف فقط ، فاستبعد جميع الترجمات أعلى وأسفل المستوى البؤري من مجموعة البيانات. أولا ، ابحث عن النقطة في z التي تحتوي على أكبر عدد من الترجمة بالضغط على Plot Histogram في النافذة التي تحتوي على جدول النتائج ، ثم تجاهل الترجمة 50 نانومتر أعلى وأسفل هذه النقطة باستخدام أمر التصفية:
    z > "ذروة الرسم البياني" - 50 & z < "ذروة الرسم البياني" + 50
  11. لتحديد جزء الحمض النووي في القسم المسجل ، حدد التوطين في كل مستوى من مكدس الصور (سمك 200 نانومتر ؛ 100 نانومتر على كل جانب) المسجلة في الخطوة 4.7.1. افتح جدول نتائج الترجمة الأول للمكدس عن طريق اختيار المكونات الإضافية | العاصفة الرعدية | الاستيراد / التصدير | استيراد النتائج وتصفية كل شريحة مسجلة إلى 200 نانومتر. لهذا ، انقر فوق تطبيق بعد الكتابة في حقل الفلتر:
    z > -100 & z < 100
  12. انقر فوق التصور واختر خيار الرسوم البيانية لإنشاء صورة لكل شريحة. احفظ الصورة الناتجة في مجلد بتنسيق TIFF. أغلق جميع الصور المفتوحة. كرر هذا لجميع مستويات الصورة.
  13. افتح جميع الشرائح وادمجها باستخدام Image | مداخن | الصور المراد تكديسها. اختر صورة | مداخن | Z-Project واختر خيار Sum . افتح مدير عائد الاستثمار في ImageJ (تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار) ؛ ثم اختر أداة Polygon Selection Tool من شريط أدوات ImageJ في نافذة ImageJ الرئيسية وحدد النواة. انقر فوق إضافة في مدير عائد الاستثمار.
    1. انقر فوق تحليل | اضبط القياسات وحدد الكثافة المتكاملة. انقر فوق تحليل | قياس. في ThunderSTORM، افتح جدول النتائج للمستوى المركزي كما هو موضح أعلاه وقم بتصفيته إلى سمك 100 نانومتر باستخدام الأمر التالي في حقل عامل التصفية:
      z > -50 & z < 50
  14. قم بإنشاء رسم بياني للتوطين الذي تمت تصفيتها كما هو موضح أعلاه ، وقم بتنشيط عائد الاستثمار المحدد عن طريق تحديده في مدير عائد الاستثمار وانقر فوق تحليل | قياس.
  15. حدد جزء التوطين في القسم الأوسط بسمك 100 نانومتر بالنسبة إلى العدد الإجمالي للتوطين بقسمة الكثافات المتكاملة المقاسة - عامل التحويل المطلوب في الخطوة 8.2 لحساب كثافات الحمض النووي المطلقة.
    ملاحظة: يتناسب محتوى الحمض النووي مع عدد التوطين. لتقدير جزء الحمض النووي في الصورة فائقة الدقة المصورة (القسم الأوسط) ، يكفي تحديد العدد الإجمالي للتوطين في جميع أنحاء حجم النواة بأكملها وتحديد العدد الإجمالي للتوطين في القسم محل الاهتمام. يمكن تحقيق ذلك عن طريق إنشاء رسوم بيانية ثنائية الأبعاد للتوطين.

7. معايرة Z لمجهر SMLM

  1. افتح مكدسات الصور المسجلة في القسم 5 في فيجي.
  2. في قائمة المكون الإضافي ThunderSTORM ، حدد القائمة الفرعية للمعايرة ثلاثية الأبعاد | معايرة العدسة الأسطوانية.
  3. أدخل حجم الخطوة المستخدم لتسجيل بيانات المعايرة (10 نانومتر) وحدد مساحة مكدس الصور التي سيتم استخدامها للمعايرة.
  4. حدد موقعا لحفظ ملف المعايرة.
  5. استخدم بيانات المعايرة في نافذة الحوار Run Analysis عن طريق تحديد PSF: Elliptical Gaussian (3D Astigmatism) في لوحة توطين البكسل الفرعي للجزيئات وضبط مسار الملف إلى ملف المعايرة الذي تم إنشاؤه في القسم 5.

8. فورونوي الفسيفساء

ملاحظة: بمجرد إنشاء جدول الترجمة وإعدادها ، انتقل إلى الخطوة الأخيرة من تحليل الصورة - فسيفساء Voronoi. استخدم MATLAB 2021 لهذه الخطوة ؛ تعد نصوص MATLAB جزءا من حزمة برنامج "محلل التوطين للتوزيعات النانوية" (LAND) ويمكن تنزيلها من الروابط الموجودة في جدول المواد. على غرار تسجيل البيانات وإنشاء جدول الترجمة ، من المهم استخدام نظام مجهز جيدا بالذاكرة وقوة المعالجة. تم تجهيز النظام المستخدم لإنشاء الصور لهذا المنشور بذاكرة وصول عشوائي (RAM) بسعة 128 جيجابايت ووحدة معالجة مركزية Intel i9 ذات 9 نواة.

  1. قم بتحويل جدول ترجمة ThunderSTORM من تنسيق .csv إلى تنسيق Orte عن طريق تشغيل البرنامج النصي MATLAB "TS2Orte.m" ، والذي يحول جدول الترجمة إلى مصفوفة MATLAB ويحفظه بتنسيق ".mat".
  2. بمجرد أن تصبح البيانات بالتنسيق الصحيح ، ابدأ الاستعدادات لحساب الفسيفساء Voronoi وكثافة الحمض النووي. احسب معامل التحويل بقسمة عدد أزواج القواعد في النواة على العدد النسبي للتوطين في القسم المصور فيما يتعلق بالحجم (انظر الخطوة 6.15). انتقل إلى مجلد LAND-Voronoi وفي المجلد الفرعي /coreAlgorithm ، افتح الملف voronoiCluster.m واضبط عامل التحويل لحسابات الكثافة المطلقة في السطر 13.
    ملاحظة: انظر الشكل 5 للحصول على مثال على نواة G1 HeLa ؛ تم قياس معامل تحويل 265.
  3. قم بتحرير البرنامج النصي الذي يبدأ التحليل "VonoRoi.m". اضبط مسار الملف على بيانات ترجمة Orte ومجلد الإخراج لملفات النتائج. في قائمة الإحداثيات ، حدد الإحداثيات التي تحدد المنطقة التي يجب أن يتم فيها الفسيفساء. نظرا لأن فسيفساء Voronoi يمكن أن تستغرق وقتا طويلا للحساب (اعتمادا على مواصفات الجهاز المستخدم) ، فحدد مناطق متعددة للحساب ضمن نفس مجموعة بيانات الإدخال.
  4. بعد تشغيل البرنامج النصي ، ابحث عن الصورة التي توضح كثافات الحمض النووي المطلقة جنبا إلى جنب مع ملفات أخرى تحتوي على رسوم بيانية توضح الرسم البياني لتوزيع المنطقة وملف "densities.mat" يحتوي على كثافات كل خلية Voronoi محسوبة في مجلد الإخراج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اختيار نواة HeLa الموضحة في الشكل 5 من الجدول الذي تم إنشاؤه بواسطة CellProfiler4.2.1 في القسم 3 للحصول على شدة مضان متكاملة بالقرب من الذروة الأولى في الرسم البياني الموضح في الشكل 5 الذي يمثل النوى في المرحلة G1 . نظرا لصغر حجمها وهيكلها الداخلي الواضح ، فمن المحتمل أن تكون نواة G1 مبكرة لا تزال في طور إزالة تكثيف الكروماتين بعد الانقسام. التواجد في G1 يعني أنه يمكن افتراض محتوى الحمض النووي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة كيفية قياس كثافة الحمض النووي المطلقة في نوى خلايا الثدييات باستخدام SMLM. بالإضافة إلى ذلك ، أوضحنا كيفية تحديد مرحلة دورة الخلية للخلايا المزروعة وكيفية استخدام هذه المعلومات لتقدير كمية الحمض النووي الموجودة في قسم خفيف فائق النحافة بصرية. كما تم وصف إعداد الخلايا الملتصقة للفحص المجهري fBALM SMLM وكيفية معالجة بيانات SMLM لتوليد صور مجهرية فائقة الحل للحمض النووي الجيني في نوى الخلية. أخيرا ، يوضح البروتوكول كيف يمكن دمج فسيفساء Voronoi لبيانات SMLM مع تقديرات الحمض ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتورة ساندرا ريتز على السماح لنا باستخدام مرفق IMB للتصوير الأساسي ، والدكتورة شيه يا تشن للسماح لنا باستخدام مجهر SMLM المصمم خصيصا ، والدكتور ليونارد كوبين (IMB) لتوفير الخلايا الليفية البشرية ، والدكتور كريستوف نيهرز (IMB) لتوفير خط الخلايا C3H10T1/2 ، والدكتور جان نيومان على MATLAB-Script الذي قمنا بتعديله لهذا العمل. نود أيضا أن نشكر الدكتورة ماريون كريمر والدكتور توماس كريمر والدكتور كريستوف كريمر على المناقشات المثمرة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>زراعة خلايا
&-طبق 35 مم، قاعدة زجاجية عالية من نوع Grid-500إيبيدي81168
C3H 10T1/2مختبر نيهرس (IMB)
DMEMثيرموفيشر12320032
dPBSثيرموفيشر14190144
FBSتقنيات الحياة16000-044
هيلامنشأة النواة المجهرية (IMB)
HFBمختبر كيوبن (IMB)
إل-جلوتامينسيغما-ألدرتشG7513
الأحماض والفيتامينات غير الأساسية لحمض الأمينات الهوائية
بيروفيات الصوديومS8636
<قوي>تحضير عينات
الكاتالازميرك2593710
الجلوكوزثيرموفيشر241922500
إزاز الجلوكوز أوكسيدازميرك49180
بارافورمالدهيدسيغما-ألدرتش158127
كوكتيل RNaseثيرموفيشرAM2286
سايتوكس أورانجثيرموفيشرS11368
مجموعة عينات الميكروسفيرات الفلورية TetraSpeckثيرموفيشرT7284
ترايتون X-100ثيرموفيشر327372500
<قوي>برمجيات
BioFormatsOpenMicroscopy.orgالبرمجيات مفتوحة المصدر https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1CellProfiler.orgالبرمجيات مفتوحة المصدر https://cellprofiler.org
فيجيnih.govالبرمجيات مفتوحة المصدر https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
بريnih.govالبرمجيات مفتوحة المصدر https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021أعمال الرياضياتبرنامج تجاري - يتطلب "صندوق أدوات معالجة الصور"
R v.4.. 0.3r-project.orgالبرمجيات مفتوحة المصدر https://www.r-project.org
ThunderSTORM الإصدار 1.3البرمجيات مفتوحة المصدر https://zitmen.github.io/thunderstorm/
<قوي>المجاهر:
AF 7000لايكا
لايكا جيرس ديلايكا
مجهر SMLMمختبر كريمرتم بناؤها خصيصا بواسطة الدكتور س-واي. تشين

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Passarge, E. Emil Heitz and the concept of heterochromatin: longitudinal chromosome differentiation was recognized fifty years ago. American Journal of Human Genetics. 31 (2), 106-115 (1979).
  2. Cremer, T., Cremer, M. Chromosome territories. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (3), 003889(2010).
  3. Vecchio, L., Solimando, L., Biggiogera, M., Fakan, S. Use of halogenated precursors for simultaneous DNA and RNA detection by means of immunoelectron and immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (1), 45-55 (2008).
  4. Solimando, L., et al. Spatial organization of nucleotide excision repair proteins after UV-induced DNA damage in the human cell nucleus. Journal of Cell Science. 122, 83-91 (2009).
  5. Niedojadlo, J., et al. Transcribed DNA is preferentially located in the perichromatin region of mammalian cell nuclei. Experimental Cell Research. 317 (4), 433-444 (2011).
  6. Padeken, J., Heun, P. Nucleolus and nuclear periphery: velcro for heterochromatin. Current Opinion in Cell Biology. 28, 54-60 (2014).
  7. Zhang, Y., et al. Overview of histone modification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1283, 1-16 (2021).
  8. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Frontiers in Bioscience (Landmark Ed). 25 (6), 1058-1109 (2020).
  9. Saul, D., Kosinsky, R. L. Epigenetics of aging and aging-associated diseases). International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 401(2021).
  10. Eckersley-Maslin, M. A., Alda-Catalinas, C., Reik, W. Dynamics of the epigenetic landscape during the maternal-to-zygotic transition. Nature Reviews, Molecular Cell Biology. 19 (7), 436-450 (2018).
  11. Stevens, T. J., et al. 3D structures of individual mammalian genomes studied by single-cell Hi-C. Nature. 544 (7648), 59-64 (2017).
  12. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  13. Cremer, C., Masters, B. R. Resolution enhancement techniques in microscopy. The European Physical Journal H. 38 (3), 281-344 (2013).
  14. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  15. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  16. Szczurek, A., et al. Super-resolution binding activated localization microscopy through reversible change of DNA conformation. Nucleus. 9 (1), 182-189 (2018).
  17. Szczurek, A., et al. Imaging chromatin nanostructure with binding-activated localization microscopy based on DNA structure fluctuations. Nucleic Acids Research. 45 (8), 56(2017).
  18. Levet, F., et al. SR-Tesseler: a method to segment and quantify localization-based super-resolution microscopy data. Nature Methods. 12 (11), 1065-1071 (2015).
  19. Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
  20. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  21. Team, R. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).
  22. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Maeshima, K., et al. The physical size of transcription factors is key to transcriptional regulation in chromatin domains. Journal of Physics. Condensed Matter. 27 (6), 064116(2015).
  27. Itoh, Y., Woods, E. J., Minami, K., Maeshima, K., Collepardo-Guevara, R. Liquid-like chromatin in the cell: What can we learn from imaging and computational modeling. Current Opinion in Structural Biology. 71, 123-135 (2021).
  28. Strickfaden, H., Xu, Z. Z., Hendzel, M. J. Visualization of miniSOG tagged DNA repair proteins in combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI). Journal of Visualized Experiments. (103), e52893(2015).
  29. Xie, L., et al. BRD2 compartmentalizes the accessible genome. Nature Genetics. 54 (4), 481-491 (2022).
  30. Heo, S. J., et al. Nuclear softening expedites interstitial cell migration in fibrous networks and dense connective tissues. Science Advances. 6 (25), (2020).
  31. Gelléri, M., et al. True-to-scale DNA-density maps correlate with major accessibility differences between active and inactive chromatin. bioRxiv. , (2022).
  32. Derenzini, M., Olins, A. L., Olins, D. E. Chromatin structure in situ: the contribution of DNA ultrastructural cytochemistry. European Journal of Histochemistry. 58 (1), 2307(2014).
  33. Cremer, T., et al. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589, 2931-2943 (2015).
  34. Shah, F. A., Johansson, B. R., Thomsen, P., Palmquist, A. Ultrastructural evaluation of shrinkage artefacts induced by fixatives and embedding resins on osteocyte processes and pericellular space dimensions. Journal of Biomedical Materials Research A. 103 (4), 1565-1576 (2015).
  35. Gavelis, G. S., et al. Dinoflagellate nucleus contains an extensive endomembrane network, the nuclear net. Scientific Reports. 9 (1), 839(2019).
  36. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: a novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801-810 (2009).
  37. Gorisch, S. M., Richter, K., Scheuermann, M. O., Herrmann, H., Lichter, P. Diffusion-limited compartmentalization of mammalian cell nuclei assessed by microinjected macromolecules. Experimental Cell Research. 289 (2), 282-294 (2003).
  38. Lenart, P., et al. Nuclear envelope breakdown in starfish oocytes proceeds by partial NPC disassembly followed by a rapidly spreading fenestration of nuclear membranes. The Journal of Cell Biology. 160 (7), 1055-1068 (2003).
  39. Verschure, P. J., et al. Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are accessible to large macromolecules. EMBO Reports. 4 (9), 861-866 (2003).
  40. Strickfaden, H., et al. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  41. Lin, Y. R., et al. M33 condenses chromatin through nuclear body formation and methylation of both histone H3 lysine 9 and lysine 27. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1868 (11), 119100(2021).
  42. Strickfaden, H., Sharma, A. K., Hendzel, M. J. A charge-dependent phase transition determines interphase chromatin organization. bioRxiv. , (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Density MappingCell NucleiSingle Molecule LocalizationSuper Resolution MicroscopyChromatin StructureVoronoi TessellationFPALM ImagingEpigenetic ModificationsCell Cycle StagesHeterochromatin Euchromatin

Related Articles