القياس الكمي في الوقت الحقيقي لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها بعد نقل mRNA الاصطناعي

تلعب حركية الخلايا السرطانية دورا مهما في ورم خبيث ^1,2. إن انتشار الخلايا السرطانية إلى الأنسجة السليمة المجاورة والبعيدة يجعل علاج السرطان صعبا ويساهم في تكرار ^3,4. لذلك ، من الضروري فهم آليات حركة الخلايا السرطانية وتطوير الاستراتيجيات العلاجية ذات الصلة. نظرا لأن العديد من الخلايا السرطانية قد غيرت ملامح التعبير الجيني ، فمن الأهمية بمكان فهم التغييرات في ملف تعريف التعبير الجيني التي تؤدي إلى تغيير حركة الخلايا السرطانية ^5,6.

تم تطوير العديد من المقايسات لقياس هجرة الخلايا في المختبر. توفر بعض المقايسات معلومات محدودة فقط بسبب السماح فقط بالقياسات في نقاط زمنية محددة ، بينما يقدم البعض الآخر معلومات شاملة عن حركة الخلايا السرطانية في الوقت الفعلي⁷. على الرغم من أن العديد من فحوصات حركية الخلايا هذه يمكن أن توفر نتائج كمية في وقت معين أو نقطة النهاية ، إلا أنها تفشل في توفير معلومات مفصلة بما فيه الكفاية عن التغيرات الديناميكية في معدل هجرة الخلايا خلال الفترة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الصعب فحص التغييرات المحتملة في معدل هجرة الخلايا اعتمادا على التصميم التجريبي وأنواع الخلايا وأرقام الخلايا. علاوة على ذلك ، يمكن التحقيق في آثار العلاجات غير المعقدة من خلال القياس الكمي البسيط لمقايسات الحركة التقليدية ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى تقدير كمي أكثر تعقيدا لدراسة التأثيرات المعقدة لمختلف العلاجات المشتركة⁸.

تم تطوير أداة لمراقبة التيار الكهربائي لقاع بئر لوحة العيار الدقيق المغطى بأقطاب كهربائية دقيقة⁹. يعيق التصاق الخلايا بسطح البئر تدفق الإلكترون ، وترتبط المعاوقة بالارتباط الكمي والنوعي للخلايا. يسمح وجود الأقطاب الكهربائية الدقيقة في قاع البئر بقياس التصاق الخلايا وانتشارها وتكاثرها. يسمح وجود الأقطاب الكهربائية الدقيقة تحت غشاء صغير يسهل اختراقه في الغرفة العلوية بقياس هجرة الخلايا وغزوها إلى الغرفة السفلية ، مع طلاء الغرفة العلوية ببروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM) للسماح بالغزو¹⁰.

في السابق ، ثبت أن القياسات في الوقت الفعلي القائمة على المعاوقة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها توفر بيانات في الوقت الفعلي خلال التجربة بأكملها ، بالإضافة إلى مقارنات وتقديرات فورية في ظل ظروف تجريبية مختلفة¹¹. في ورقة الطريقة هذه ، تم حث ضربة قاضية للجينات لاختبار دور البروتينات ذات الأهمية في هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. نظرا لأن تأثير ضربة قاضية للجين الكامل في ظل الظروف التجريبية المختبرة استغرق 3-4 أيام بعد التثقيب الكهربائي باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNAs) ⁸ ، فقد تم إعادة طلاء الخلايا بعد التثقيب الكهربائي وإعادة حصادها بعد 3 أيام للقياس في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها.

منظم CT10 للكيناز (Crk) و Crk-like (CrkL) عبارة عن بروتينات محول تتوسط تفاعلات البروتين والبروتين في اتجاه مجرى مسارات كيناز مستقبلات عامل النمو المختلفة ومسارات التيروزين كيناز غير المستقبلة¹². تساهم المستويات المرتفعة من بروتينات Crk و CrkL في سوء التشخيص في العديد من أنواع السرطان البشرية ، بما في ذلك الورم الأرومي الدبقي¹³. ومع ذلك ، فمن غير الواضح كيف تؤدي بروتينات Crk و CrkL المرتفعة إلى سوء التشخيص. لذلك ، من المهم تحديد تأثير التعبير المفرط ل Crk و CrkL على وظائف الخلايا السرطانية. في السابق ، تم إجراء دراسة ضربة قاضية للجينات لإثبات أن المستويات الداخلية لبروتينات Crk و CrkL مطلوبة لهجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي وغزوها⁸. هنا ، تم تطوير نظام فحص معدل لمعالجة تأثير التعبير المفرط ل Crk و CrkL على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها.

في الآونة الأخيرة ، جذب التوليف في المختبر ل mRNA وتطبيقاته العلاجية اهتماما متجددا بسبب تطوير لقاحات mRNA ضد SARS-CoV-2 (استعرضه Verbeke et ^al.14). بالإضافة إلى ذلك ، تم إحراز تقدم ملحوظ في استخدام mRNA الاصطناعية في السرطان وأمراض أخرى^15,16. يعد التثقيب الكهربائي للخلايا طريقة فعالة لتوصيل mRNA الاصطناعي والحث على التعديل الجيني العابر (تمت مراجعته بواسطة Campillo-Davo et al.17) ، ويتيح استخدام mRNA الاصطناعي التعبير الجيني السريع والفعال في الخلايا الليفية الخالدة ¹⁸. تجمع ورقة الطريقة هذه بين الإفراط في التعبير الجيني باستخدام mRNA الاصطناعي مع تحليلات الخلايا في الوقت الفعلي لدراسة هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. ومع ذلك ، فإن المخطط التجريبي المستخدم في siRNAs لا يعمل مع نقل mRNA الاصطناعي ، حيث يزداد مستوى البروتينات الخارجية بسرعة وينخفض تدريجيا عند نقل mRNA الاصطناعي¹⁸. لذلك ، تم تعديل الطريقة لإجراء تحليل في الوقت الفعلي لهجرة الخلايا وغزوها مباشرة بعد النقل دون زراعة الخلايا بشكل إضافي.

توضح ورقة الطريقة هذه أن الجمع بين القياسات في الوقت الفعلي القائمة على المعاوقة مع نقل الخلايا السرطانية باستخدام mRNAs الاصطناعية يوفر تحليلا سريعا وشاملا لآثار تنظيم الجينات على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. تصف ورقة الطريقة هذه الإجراءات التفصيلية لقياس كيفية تأثر هجرة وغزو خلايا الورم الأرومي الدبقي بالتعبير المفرط عن Crk و CrkL. من خلال فحص التأثيرات المعتمدة على التركيز ل mRNA الاصطناعية على هجرة الخلايا السرطانية ، تصف الورقة بوضوح كيف أن الزيادة في مستويات البروتين تحفز هجرة الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم نهج لتغيير تركيز هلام ECM لتقييم آثار التغيرات في التعبير الجيني على غزو الخلايا السرطانية.

1. تخليق الحمض النووي الريبوزي المرسال

ملاحظة: بالنسبة لتخليق mRNA ، يجب معالجة جميع الكواشف والمعدات بشكل خاص لتعطيل RNases قبل الاستخدام. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والأدوات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. خطي الحمض النووي
   ملاحظة: تم استنساخ الحمض النووي للفأر ل CrkI و CrkL في متجه التعبير pFLAG-CMV-5a لإضافة علامة FLAG epitope في المحطة C واستنساخها في ناقل pcDNA3.1 / myc-His لدمج مروج T7 ، كما هو موضح سابقا ^18,19.
   1. أضف 10 ميكرولتر من محلول تفاعل 10x ، و 1.5 ميكرولتر من PmeI (10000 وحدة / مل) ، و 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لخطي الحمض النووي البلازميد مع إنزيم التقييد. أضف الماء الخالي من النيوكلياز ليصل حجم التفاعل إلى 100 ميكرولتر.
   2. امزج عن طريق النقر ، وتدويره لأسفل ، واحتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
   3. قم بتدويرها وإضافة 5 ميكرولتر من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) و 1 ميكرولتر من البروتيناز K (20 مجم / مل ، درجة الحمض النووي الريبي) إلى خليط التفاعل. امزج عن طريق النقر ، وقم بتدويره لأسفل ، واحتضانه على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   4. تحت غطاء الدخان ، أضف 100 ميكرولتر من المرحلة السفلية من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل إلى خليط تفاعل البلازميد للاستخراج. دوامة ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 18800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل المرحلة العليا إلى أنبوب جديد.
   5. كرر الخطوة 1.1.4 مع الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل في 24: 1.
   6. في الأنبوب الجديد ، ارفع حجم التفاعل إلى 300 ميكرولتر بإضافة 200 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، ثم أضف 30 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 M و 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.
   7. تخلط عن طريق الدوامة ، ثم توضع في -20 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة لترسيب الإيثانول للحمض النووي.
   8. أجهزة الطرد المركزي عند 18800 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، واشطف الحبيبات ب 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. كرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية تماما.
   9. جفف مع فتح الغطاء لمدة 2 دقيقة ، أضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، وأعد تعليق حبيبات الحمض النووي.
   10. أوجد تركيز الحمض النووي (DNA) باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
   11. تحقق من حجم وكمية الحمض النووي الخطي باستخدام هلام الأغاروز الكهربائي.
2. تخليق الحمض النووي الريبي باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T7
   1. أضف 2 ميكرولتر لكل من 10x عازلة للنسخ ، و ATP ، و GTP ، و UTP ، و CTP ، و T7 و 1 ميكروغرام من الحمض النووي الخطي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف الماء الخالي من النيوكلياز ليصل حجم التفاعل إلى 20 ميكرولتر.
   2. امزج عن طريق النقر ، والدوران لأسفل ، واحتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتخليق الحمض النووي الريبي.
   3. قم بتدويرها لأسفل ، أضف 1 ميكرولتر من DNase (2 وحدة / ميكرولتر) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة قالب الحمض النووي.
3. ترسيب كلوريد الليثيوم للحمض النووي الريبي
   1. أضف 10 ميكرولتر من كلوريد الليثيوم (7.5 M) إلى خليط التفاعل. امزج عن طريق النقر ، والدوران لأسفل ، واحتضان خليط التفاعل عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. أجهزة الطرد المركزي عند 18800 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، واشطف الحبيبات ب 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. كرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية تماما.
   3. جفف مع فتح الغطاء لمدة 2 دقيقة ، أضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، وأعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي.
4. متوجا
   1. سخني عينة الحمض النووي الريبي عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم ضعها على الثلج للتبريد.
   2. أضف 5 ميكرولتر لكل من 10x عازلة للتغطية ، و 10 mM GTP ، و 1 mM (10x) S-adenosylmethionine (SAM) ، و 2 ميكرولتر لكل من مزيج إنزيم السد ومزيج إنزيم O-methyltransferase ، و 1.25 ميكرولتر من مثبط RNase. امزج عن طريق النقر ، والدوران لأسفل ، واحتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
5. بولي (أ) مخلفات
   1. قم بتدوير العينة ، ثم أضف 6 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، و 20 ميكرولتر من 5x E-PAP buffer ، و 10 ميكرولتر من 25 mM MnCl₂ ، و 10 ميكرولتر من 10 mM ATP ، و 4 ميكرولتر من إنزيم مخلفات E-PAP poly (A). امزج عن طريق النقر ، والدوران لأسفل ، واحتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
6. ترسيب كلوريد الليثيوم والقياس الكمي للحمض النووي الريبوزي المرسال الاصطناعي
   1. أضف 50 ميكرولتر من كلوريد الليثيوم (7.5 م) ، وقم بإجراء ترسيب كلوريد الليثيوم كما هو موضح في الخطوات 1.3.1-1.3.3.
   2. قياس تركيز الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
   3. تحقق من حجم وكمية mRNA باستخدام الفورمالديهايد (1٪ -2٪) أغاروز (1٪) هلام الكهربائي.

2. طلاء هلام المصفوفة خارج الخلية (ECM) لألواح غزو الخلية والهجرة (CIM)

ملاحظة: لوحة غزو الخلايا وهجرتها (CIM) عبارة عن لوحة مكونة من 16 بئرا مصنعة تجاريا لتحليل الخلايا في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة. بالنسبة لفحص غزو الخلية ، قم بتغطية ألواح CIM بهلام ECM ، كما هو موضح سابقا ولكن مع بعض التعديلات¹¹.

1. قم بإزالة حصة من مخزون جل ECM من الفريزر واحتفظ بها على الجليد.
2. قم بتخفيف جل ECM (10 مجم / مل) إلى تركيز عمل (100 ميكروغرام / مل) عن طريق خلط 990 ميكرولتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco (بدون مصل أو مضادات حيوية) مع 10 ميكرولتر من جل ECM في أنبوب طرد مركزي دقيق. تخلط عن طريق ماصة لطيفة.
3. أضف 60 ميكرولتر من جل ECM المخفف إلى كل بئر من الآبار ال 16 للغرفة العلوية للوحة CIM. قم بتطبيق طريقة السحب العكسي مع تجنب فقاعات الهواء^20,21.
   ملاحظة: قم بتحسين تركيز جل ECM لكل خط خلية. بالنسبة لخطوط خلايا الورم الأرومي الدبقي ، تم استخدام 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر جل ECM للتحسين.
4. ضع الحجرة العلوية للوحة CIM مع غطاء اللوحة على ورقة بلاستيكية واقية داخل حاضنة CO₂ لمدة 4 ساعات تقريبا لتشكيل طبقة هلام.
   تنبيه: أثناء طلاء لوحة CIM بهلام ECM ، يجب ألا يكون لأقطاب الغرفة العلوية للوحة CIM اتصال مباشر بأيدي المجرب أو أسطح الجهاز ، بما في ذلك خزانة السلامة البيولوجية أو حاضنة CO₂ .

3. تحضير الخلايا السرطانية

ملاحظة: يجب أن تبقى جميع مواد زراعة الخلايا معقمة. حصاد الخلايا السرطانية وتقشيرها كهربائيا تحت خزانة أمان بيولوجي مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، كما هو موضح سابقا ولكن مع بعض التعديلات¹¹.

1. ثقافة الخلايا السرطانية
   1. زراعة خلايا U-118MG في 10 مل من DMEM تحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ مضادات حيوية لكل طبق زراعة أنسجة البوليسترين 100 مم × 20 مم عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ بنسبة 5٪ (حالة استزراع).
2. استنزاف مصل الخلايا السرطانية
   ملاحظة: يجب تقليل تعرض الخلايا للجاذبات الكيميائية الموجودة في FBS قبل فحوصات هجرة الخلايا وغزوها باستخدام تركيز عال من FBS.
   1. أزل الوسط القديم ، وأضف 10 مل من DMEM المسخن مسبقا الذي يحتوي على 0.5٪ FBS و 1٪ مضاد حيوي لكل طبق (وسط مصل منخفض).
   2. كرر الخطوة 3.2.1.
   3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ 5٪ لمدة 4 ساعات أو أكثر.
3. حصاد الخلايا السرطانية
   1. قم بإزالة الوسط القديم ، وأضف 8 مل من محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات (DPBS) لكل طبق ، وقم بإزالة DPBS ، وأضف 0.05٪ trypsin-EDTA المسخن مسبقا (2 مل / طبق) لتغطية السطح ، واحتضانه في حاضنة CO₂ لمدة 30 ثانية.
   2. قم بنضح التربسين-EDTA بعناية ، وأضف وسط مصل منخفض (7 مل / طبق) ، ثم اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل أو 15 مل.
   3. قسمة حجم صغير من الخلايا ، واستخدم عداد خلايا آلي محمول باليد لحساب الخلايا.
   4. احسب العدد الإجمالي للخلايا والحجم المطلوب ل 10000 خلية / ميكرولتر.
   5. قم بتدوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لها عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واستنشاق المادة الطافية ، وإضافة الحجم المحسوب من DMEM الذي يحتوي على 0.5٪ FBS (بدون مضادات حيوية) ، وإعادة تعليق حبيبات الخلية برفق.
   6. نقل 110 ميكرولتر من تعليق الخلية ، الذي يحتوي على 1.1 مليون خلية ، إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لكل علاج.
   7. كرر الخطوة 3.3.6 لنقل الخلايا إلى أربعة أنابيب طرد مركزي دقيقة لأربعة علاجات مختلفة.
      ملاحظة: تحتوي لوحة CIM على إجمالي 16 بئرا. تصميم أربع معالجات مختلفة للمقارنة بحيث يمكن تخصيص أربعة آبار من لوحة CIM لكل معالجة. استخدم الخلايا الكهربائية في التجارب التالية: تحليلات اللطخة الغربية (0.3 مليون خلية لكل طبق زراعة أنسجة 35 ملم) ، وأربعة آبار من فحوصات هجرة الخلايا في الوقت الفعلي (0.1 مليون خلية / بئر) ، وأربعة آبار من فحوصات غزو الخلايا في الوقت الفعلي (0.1 مليون خلية / بئر) لكل علاج. اضبط عدد الخلايا التي تحتاج إلى الكهرباء إذا تغير التصميم التجريبي.

4. التثقيب الكهربائي للخلايا السرطانية

1. لإزالة الوسط ، أضف 1 مل من DPBS إلى تعليق الخلية في كل أنبوب ، وقم بتدوير تعليق الخلية ثلاث مرات لمدة 10 ثوان في كل مرة أثناء تدوير الأنبوب 180 درجة كل 10 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي صغير ، وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة صغيرة.
   ملاحظة: من المهم تشكيل حبيبات خلية مدمجة ولكن يمكن إنعاشها بسهولة.
2. أضف 110 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق R إلى حبيبات الخلية للحصول على 0.1 مليون خلية في 10 ميكرولتر.
3. أضف mRNA الاصطناعي إلى حبيبات الخلية للحصول على تركيز 0.2-20 نانوغرام / ميكرولتر اعتمادا على مستوى التعبير المطلوب. امزج وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق عن طريق النقر أو السحب اللطيف.
   ملاحظة: استخدم تركيزات مختلفة من mRNA الاصطناعي ، وافحص تعبير البروتين باستخدام تحليل اللطخة الغربية ، وحدد تركيز mRNA الاصطناعي الذي يؤدي إلى مستوى التعبير المطلوب من أجل التحقيق في العلاقة المحددة بين تعبير البروتين والتأثيرات البيولوجية.
4. قم بإلكتروبور 10 ميكرولتر من تعليق الخلية بنظام التثقيب الكهربائي عند 1350 فولت لمدة 10 مللي ثانية مع ثلاث نبضات في كل مرة.
5. نقل الخلايا الكهربائية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مع 1.1 مل من DMEM يحتوي على 0.5٪ FBS.
6. كرر التثقيب الكهربائي حتى يتم ثقب بقية تعليق الخلية بالكهرباء. اجمع الخلايا الكهربائية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق للحصول على 1.1 مليون خلية في 1.1 مل.
   ملاحظة: يمكن استخدام كل من أطراف التثقيب الكهربائي 100 ميكرولتر و 10 ميكرولتر لإلكتروب كمية كبيرة من الخلايا ، ولكن يتم تضمين أطراف التثقيب الكهربائي ل 10 ميكرولتر و 100 ميكرولتر في مجموعتين منفصلتين ويجب شراؤها بشكل منفصل. يتم تضمين المخزن المؤقت لإعادة التعليق R في كلتا المجموعتين.
7. عند الانتهاء من جميع التثقيب الكهربائي المعني ، أعد تعليق الخلايا المجمعة برفق.
8. لوحة 0.3 مليون خلية في طبق زراعة أنسجة البوليسترين 35 مم × 10 مم مع 2 مل من DMEM تحتوي على 5٪ FBS ، وزراعة الخلايا لمدة يوم واحد تحت حالة المزرعة لإعداد محللات الخلية الكلية وتحليل اللطخة الغربية.
9. احتفظ ببقية الخلايا الكهربية في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي جاهزا.

5. إعداد محلل الخلايا في الوقت الفعلي والبرنامج ولوحات CIM

ملاحظة: قم بإعداد محلل الخلايا في الوقت الحقيقي ولوحتي CIM ، كما هو موضح سابقا¹¹.

1. توازن محلل الخلايا في الوقت الحقيقي
   1. انقل محلل الخلايا في الوقت الفعلي إلى حاضنة CO₂ قبل عدة ساعات من الاستخدام لموازنة النظام في ظل ظروف الثقافة.
2. إعداد برنامج التحليل
   1. افتح برنامج التحليل بالنقر المزدوج على أيقونة برنامج تحليل الخلايا في الوقت الفعلي على سطح المكتب.
   2. بمجرد فتح خيار إعداد نمط التجربة الافتراضي ، حدد خيار تشغيل ثلاث تجارب بشكل منفصل.
      ملاحظة: كل مهد له نافذة منفصلة. هناك علامات تبويب مختلفة لإعداد الفاصل الزمني للقياس ومدته وتحليل البيانات والظروف التجريبية الأخرى.
   3. افتح كل مهد بالنقر فوق علامة التبويب رقم .
   4. انقر فوق علامة التبويب ملاحظات التجربة ، وحدد المجلد الذي سيتم حفظ البيانات فيه ، وأدخل اسم التجربة.
   5. انقر فوق علامة التبويب تخطيط ، وقم بإعداد آبار مكررة رباعية لكل حالة معالجة عن طريق تحديد أربعة آبار في وقت واحد وإدخال معلومات العينة ، ثم انقر فوق تطبيق.
   6. انقر فوق علامة التبويب " جدولة" | أضف خطوة لإعداد الوضع المكون من خطوتين لقياسات مقاومة الخلية. ثم ، انقر فوق Apply لإعداد الخطوة الأولى.
   7. انقر فوق إضافة خطوة مرة أخرى ، وأدخل 10 دقائق للفاصل الزمني و 48 ساعة لمدة الهجرة والغزو ، وانقر فوق تطبيق لإعداد الخطوة الثانية.
      ملاحظة: تستغرق الخطوة الأولى قياسا أساسيا لمرة واحدة (عملية مسح واحدة بفاصل زمني قدره 1 دقيقة). تقيس الخطوة الثانية مقاومة الخلية للتجربة (على سبيل المثال ، 289 عملية مسح بفاصل زمني مدته 10 دقائق لمدة 48 ساعة) في المهد. اضبط الفاصل الزمني والمدة حسب التصميم التجريبي.
   8. انتقل إلى الحامل التالي ، وقم بإعداده بتكرار الخطوات 5.2.3-5.2.7.
3. تحضير لوحات CIM
   1. قبل ساعة واحدة من بدء قياس مقاومة الخلية ، املأ آبار الغرفة السفلية للوحة CIM ب 160 ميكرولتر من DMEM تحتوي على مصل 10٪ أو جاذبات كيميائية أخرى.
   2. قم بتجميع الغرفة العلوية التي تحتوي على الآبار المطلية بالهلام ECM (للغزو) أو الآبار غير المطلية (للترحيل) مع الغرفة السفلية.
   3. أضف 50 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض إلى آبار الغرفة العلوية للوحة CIM لفحص هجرة الخلايا ، وضع لوحة CIM في مهد النظام.
   4. انقر فوق علامة التبويب الرسالة ، وتأكد من عرض رسالة Connections ok . لوحة CIM جاهزة الآن للتجربة.
   5. احتضان لوحة CIM المجمعة في حاضنة CO₂ لمدة 30-60 دقيقة قبل تحليل الخلية في الوقت الفعلي لتأقلم لوحة CIM مع حالة الثقافة.

6. تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي وتصدير البيانات

ملاحظة: قم بإجراء قراءة خط الأساس وبذر الخلايا وقياس مقاومة الخلية وتصدير البيانات كما هو موضح سابقا¹¹.

1. قراءة خط الأساس
   ملاحظة: يجب قراءة خط الأساس بعد تأقلم لوحة CIM وقبل إضافة الخلايا إلى آبار الغرفة العلوية.
   1. انقر فوق الزر "ابدأ" لكل مهد. عند ظهور نافذة حفظ باسم ، احفظ الملف التجريبي لتنفيذ قراءة الخط الأساسي.
2. بذر الخلايا
   1. قم بإزالة لوحة CIM من المهد ، وضعها في خزانة السلامة البيولوجية على حامل اللوحة.
   2. أضف 100 ميكرولتر (تحتوي على 100000 خلية) من الخلايا الكهربائية إلى آبار الغرفة العلوية للوحة CIM وفقا للبرنامج الموجود في وحدة التحكم. قم بتطبيق طريقة السحب العكسي مع تجنب فقاعات الهواء.
   3. اترك لوحة CIM أسفل خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للتأكد من انتشار الخلايا بالتساوي في قاع البئر.
3. قياس مقاومة الخلية
   1. انقل لوحة CIM المجمعة بالكامل إلى المهد المعني. انقر فوق الزر "ابدأ " لبدء قياس مقاومة الخلية للخطوة الثانية.
   2. انقر فوق علامة التبويب Plot ، ثم انقر فوق الزر Add All ، وحدد مربعات Average و STD DEV لتصور البيانات في الوقت الفعلي.
      ملاحظة: خيار التخطيط الافتراضي هو الوقت للمحور السيني وفهرس الخلية للمحور ص. يسمح قسم تحديد قطعة الأرض للمستخدم بتحديد خيارات بديلة للمحور ص: فهرس الخلية الطبيعي أو فهرس خلية دلتا. بمجرد إجراء المسح النهائي ، تكتمل التجربة ، ويتم حفظ النتائج تلقائيا.
4. تصدير البيانات للتحليل
   1. انقر فوق علامة التبويب Plot وحدد مربعات Average و STD DEV لنسخ البيانات لكل بئر على حدة.
   2. انقر بزر الماوس الأيمن فوق منطقة الرسم ، وحدد نسخ البيانات بتنسيق القائمة.
   3. افتح ملف جدول بيانات فارغا، والصق البيانات، ثم احفظ الملف.
   4. ارجع إلى برنامج التحليل ، وانقر فوق علامة التبويب Plate لكل مهد ، وحدد Release لإغلاق تجربة المهد.
   5. ارجع إلى ملف جدول البيانات، واضبط وقت البيانات الأولية بحيث يصبح وقت البدء في الخطوة الثانية هو وقت البدء الفعلي للقياس.

تلعب بروتينات Crk و CrkL أدوارا مهمة في حركة العديد من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية22 والخلايا التائية23 والخلايا الليفية 18,19 ومجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية 13. منذ أن تم الإبلاغ عن ارتفاع بروتينات Crk و CrkL في الورم الأرومي الدبقي24،25،26 ، تمت دراسة آثار الإفراط في التعبير عن CrkI ، وهو نوع لصق من Crk ، على هجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي في هذا العمل. تم تزويد خلايا U-118MG بالكهرباء بتركيزات مختلفة من CrkI mRNA الاصطناعية وتحليلها لمستويات البروتين وهجرة الخلايا. أدى التثقيب الكهربائي لخلايا الورم الأرومي الدبقي U-118MG بتركيزات متفاوتة من CrkI mRNA الاصطناعية إلى زيادة تعتمد على التركيز في بروتين CrkI الموسوم ب FLAG بعد يوم واحد من النقل (الشكل 1 أ). في حين أن 0.2 نانوغرام / ميكرولتر و 2 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المرسال أدى إلى تعبير غير قابل للكشف أو متواضع لبروتين CrkI الخارجي ، أدى 20 نانوغرام / ميكرولتر mRNA إلى مستوى تعبير أعلى بكثير من بروتين CrkI الداخلي.

أشارت نتائج مقايسة هجرة الخلايا باستخدام نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي إلى أن التثقيب الكهربائي مع 0.2 نانوغرام / ميكرولتر أو 2 نانوغرام / ميكرولتر CrkI mRNA لم يؤثر بشكل كبير على هجرة الخلايا. ومع ذلك ، أدى التثقيب الكهربائي باستخدام 20 نانوغرام / ميكرولتر CrkI mRNA إلى تحفيز واضح لهجرة الخلايا ، مع هجرة المزيد من الخلايا بين 2 ساعة و 13 ساعة (الشكل 1 ب). كشفت المقارنة بين مستوى بروتين CrkI وهجرة الخلايا أن هجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي قد حفزتها الزيادة في مستوى بروتين CrkI. يبدو أن مستوى بروتين CrkI يجب أن يكون أعلى من عتبة معينة لإحداث تحفيز كبير لهجرة الخلايا. إذا تم قياس هجرة الخلايا بطرق مختلفة لحساب أو مراقبة الخلايا المهاجرة في نقاط زمنية محددة ، فقد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الجهد لتحديد هذا النوع من التغيير في هجرة الخلايا.

لدراسة كيفية تأثير التعبير المفرط ل CrkL على غزو خلايا الورم الأرومي الدبقي من خلال طبقات هلام ECM بتركيزات مختلفة من بروتينات ECM ، تم كهربية خلايا U-118MG باستخدام CrkL mRNA الاصطناعية وتحليلها من حيث مستويات البروتين وغزو الخلايا من خلال طبقة هلام ECM. أدى التثقيب الكهربائي لخلايا الورم الأرومي الدبقي U-118MG مع CrkL mRNA الاصطناعي إلى تعبير قوي عن بروتين CrkL الموسوم ب FLAG بعد يوم واحد من النقل (الشكل 2 أ). مع زيادة تركيز بروتينات ECM ، تباطأ غزو خلايا التحكم (الشكل 2 ب). أظهرت خلايا CrkL المفرطة في التعبير أيضا انخفاضا يعتمد على تركيز هلام ECM في غزو الخلايا (الشكل 2C). أشارت المقارنة بين الخلايا الضابطة والخلايا المفرطة في التعبير عن CrkL بتركيزات مختلفة من هلام ECM إلى أن الإفراط في التعبير عن CrkL يحفز بشكل عام غزو الخلايا من خلال طبقة هلام ECM (الشكل 2D-G). ومع ذلك ، أصبح الفرق بين مجموعتي الخلايا واضحا في نقاط زمنية مختلفة اعتمادا على تركيز هلام ECM.

بالنسبة لهلام ECM 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر ، كان التحفيز بوساطة التعبير المفرط CrkL لغزو الخلايا واضحا بين 8 ساعات و 20 ساعة (الشكل 2D) ، لكن الفرق في غزو الخلايا كان ضئيلا بعد 32 ساعة. بالنسبة لهلام ECM 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر ، كان الفرق في غزو الخلايا مع وبدون التعبير المفرط ل CrkL ضئيلا في جميع الأوقات (الشكل 2E). بالنسبة لهلام ECM 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر ، كان الفرق في غزو الخلايا واضحا بين 24 ساعة و 36 ساعة (الشكل 2F). بالنسبة لجل ECM 1 ميكروغرام / ميكرولتر ، أصبح تأثير التعبير المفرط CrkL على غزو الخلايا واضحا قليلا عند 48 ساعة (الشكل 2G). تشير النتائج إلى أن نافذة اكتشاف الفرق بين الخلايا الضابطة وخلايا CrkL-overexpression تتحول إلى أوقات لاحقة مع زيادة تركيز هلام ECM. تشير النتائج أيضا إلى أن مجموعتي الخلايا تأثرتا بشكل مختلف بالزيادة في تركيز هلام ECM في نقاط زمنية مختلفة. على سبيل المثال ، عند 12 ساعة ، أظهرت خلايا CrkL-overexpression غزوا أعلى بكثير فقط عند 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر من هلام ECM (الشكل 2H). ومع ذلك ، في 24 ساعة ، أظهرت خلايا CrkL-overexpression غزوا أعلى قليلا أو مشابها عند تركيزات هلام ECM المختبرة (الشكل 2I). لذلك ، من المهم التحقيق في كل من الاختلافات المعتمدة على الوقت والمعتمدة على تركيز هلام ECM في غزو الخلايا للحصول على رؤية شاملة للاختلافات بين مجموعتي الخلايا مع وبدون التعبير المفرط ل CrkL. توضح هذه النتائج أن الجمع بين الإفراط في التعبير العابر باستخدام mRNA الاصطناعي مع تحليلات الخلايا في الوقت الفعلي القائمة على المعاوقة يوفر أداة قوية لتحليل العلاقة المحتملة بين الإفراط في التعبير الجيني وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها. إن فحص آثار تغيرات التركيز في هلام mRNA و ECM الاصطناعي من شأنه أن يوفر معلومات أكثر دقة وتفصيلا.

الشكل 1: آثار الإفراط في التعبير عن CrkI على هجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي. تم كهربية خلايا U-118MG بالتركيزات المشار إليها (نانوغرام / ميكرولتر) من CrkI mRNA الموسوم بالعلم. (أ) بالنسبة لتحليلات اللطخة الغربية ، تم استزراع الخلايا الكهربائية لمدة 1 يوم قبل تحضير محلول الخلية الكلي. تمت مقارنة مستويات البروتين عند النقل مع CrkI mRNA الاصطناعية. تم استخدام الأجسام المضادة ل Crk و Anti-CrkL للكشف عن كل من البروتينات الداخلية والبروتينات الموسومة ب FLAG ومقارنة النسبة بين البروتينات الداخلية والبروتينات الموسومة ب FLAG. تم استخدام Vinculin و α-tubulin كأدوات تحكم في التحميل. (ب) بالنسبة لتحليلات هجرة الخلايا، تم طلاء الخلايا الكهربية على صفيحة CIM دون مزيد من الثقافة. تم الحصول على قيم مؤشر الخلية من أربعة آبار لكل عينة ، ويظهر متوسط قيم SD ±. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: آثار الإفراط في التعبير عن CrkL على غزو خلايا الورم الأرومي الدبقي. تم إلكترومنت خلايا U-118MG باستخدام H2O الخالي من النيوكلياز أو 20 نانوغرام / ميكرولتر من CrkL mRNA الموسوم بالعلم. (أ) بالنسبة لتحليلات اللطخة الغربية ، تم استزراع الخلايا الكهربائية لمدة 1 يوم قبل تحضير محلول الخلية الكلي. تمت مقارنة مستويات البروتين عند النقل مع CrkL mRNA الاصطناعي. تم استخدام الأجسام المضادة ل Crk و Anti-CrkL للكشف عن كل من البروتينات الداخلية والبروتينات الموسومة ب FLAG ومقارنة النسبة بين البروتينات الداخلية والبروتينات الموسومة ب FLAG. تم استخدام Vinculin و α-tubulin كأدوات تحكم في التحميل. (ب-ز) لتحليل غزو الخلية ، تم طلاء الخلايا الكهربائية على لوحة CIM مع طلاء هلام ECM دون مزيد من الثقافة. تم الحصول على قيم مؤشر الخلية من أربعة آبار لكل عينة ، ويظهر متوسط قيم SD ±. (ب) تمت مقارنة بيانات غزو الخلايا من الخلايا الضابطة ذات تركيزات هلام ECM المختلفة. (ج) تمت مقارنة بيانات غزو الخلايا من خلايا CrkL-overexpression بتركيزات مختلفة من هلام ECM. (د-ز) تمت مقارنة بيانات غزو الخلايا بين الخلايا الضابطة والخلايا المفرطة في التعبير عن CrkL لتركيز هلام ECM المشار إليه. (H) مقارنة غزو الخلية عند 12 ساعة بين الخلايا الضابطة والخلايا التي تفرط في التعبير عن CrkL. (I) مقارنة غزو الخلية عند 24 ساعة بين الخلايا الضابطة والخلايا المفرطة في التعبير عن CrkL. الاختصارات: ECM = مصفوفة خارج الخلية. CIM = غزو الخلايا والهجرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: مخططات تخطيطية للإجراءات التجريبية بعد ضربة قاضية للجينات أو فرط التعبير الجيني. أ: الإجراء التجريبي لتحليل الخلية في الوقت الحقيقي بعد انتقال الحمض النووي الريبوزي الريبوزي (siRNA). نظرا لأن 3-4 أيام مطلوبة للحث على ضربة قاضية جينية كاملة بعد نقل siRNA في ظل الظروف التجريبية ، فقد تم إعادة طلاء الخلايا وزراعتها لمدة 3 أيام بعد التثقيب الكهربائي قبل أن تكون جاهزة لتحليلات الخلايا في الوقت الفعلي. (ب) الإجراء التجريبي لتحليل الخلايا في الوقت الحقيقي بعد نقل الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) التركيبي. نظرا لأن تعبير البروتين من نقل mRNA الاصطناعي سريع ، فقد تم استخدام الخلايا الكهربائية لتحليل الخلايا في الوقت الفعلي في نفس اليوم. لاحظ الفرق بين الإجراءين التجريبيين ؛ في حين تم إجراء تحليل الخلايا في الوقت الفعلي بعد 3 أيام من التثقيب الكهربائي للضربة القاضية الجينية باستخدام siRNAs ، تم إجراء تحليل الخلايا في الوقت الفعلي مباشرة بعد التثقيب الكهربائي للتعبير المفرط للجين باستخدام mRNA الاصطناعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.