هنا ، نقدم بروتوكولا لنموذج الماوس لفقدان السمع الناجم عن الضوضاء (NIHL). للحث على NIHL ، قمنا بتطوير جهاز جديد وبسيط باستخدام البلاستيك المموج ، وقفص مصيدة الفئران ، ومكبر صوت. تم استخدام استجابة جذع الدماغ السمعية والتصوير المناعي لتقييم وظيفة السمع وتلف خلايا الشعر الخارجية ، على التوالي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الظروف التجريبية المعدلة لفقدان السمع الناجم عن الضوضاء في الفئران وتقييم وظيفة السمع وتلف خلايا الشعر الخارجية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد النموذج الحيواني لفقدان السمع الناجم عن الضوضاء (NIHL) مفيدا لأخصائيي علم الأمراض والمعالجين وعلماء الصيدلة والباحثين في السمع لفهم آلية NIHL تماما ، وبالتالي تحسين استراتيجيات العلاج المقابلة. تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء بروتوكول محسن لتطوير نموذج فأر من NIHL. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J في هذه الدراسة. تعرضت الفئران غير المخدرة لضوضاء عالية (1 و 6 كيلو هرتز ، معروضة في وقت واحد عند 115-125 ديسيبل SPL-A) بشكل مستمر لمدة 6 ساعات يوميا لمدة 5 أيام متتالية. تم تقييم الوظيفة السمعية بعد يوم واحد وأسبوع واحد من التعرض للضوضاء ، باستخدام استجابة جذع الدماغ السمعي (ABR). بعد قياس ABR ، تم التضحية بالفئران ، وتم جمع أعضاء كورتي الخاصة بهم من أجل تلطيخ التألق المناعي. من قياسات استجابة جذع الدماغ السمعية (ABR) ، لوحظ فقدان السمع بشكل كبير بعد 1 يوم من التعرض للضوضاء. بعد 1 أسبوع ، انخفضت عتبات السمع للفئران التجريبية إلى ~ 80 ديسيبل SPL ، والتي كانت لا تزال مستوى أعلى بكثير من الفئران الضابطة (~ 40 ديسيبل SPL). من نتائج التصوير المناعي ، تبين أن خلايا الشعر الخارجية (OHCs) تالفة. باختصار ، أنشأنا نموذجا ل NIHL باستخدام ذكور الفئران C57BL / 6J. تم تطوير جهاز جديد وبسيط لتوليد وتوصيل ضوضاء نقية ثم تم استخدامه. أظهرت القياسات الكمية لعتبات السمع والتأكيد المورفولوجي لأضرار OHC أن الضوضاء المطبقة نجحت في إحداث فقدان السمع المتوقع.
المقدمة
يعاني حوالي 1.3 مليار شخص في جميع أنحاء العالم من فقدان السمع بسبب التعرض للضوضاء1. في هذه الدراسة ، كنا نهدف إلى إنشاء عملية واضحة خطوة بخطوة لتحفيز وتأكيد فقدان السمع الناجم عن الضوضاء (NIHL). ينتج NIHL عن تنكس / تدمير خلايا الشعر (HCs) والخلايا العصبية العقدية الحلزونية (SGNs) ، وتلف في الأهداب المجسمة HC ، و / أو فقدان نقاط الاشتباك العصبي بين HCs الداخلية للقوقعة و SGNs. قد تسبب هذه التشوهات أيضا طنين الأذن وضعف إدراك الكلام (خاصة في بيئة صوتية معقدة) إلى جانب NIHL. قد تتأثر الوظائف الاجتماعية والنفسية والمعرفية بالتتابع بهذه العيوب الفسيولوجية2،3،4،5،6.
في الدراسات قبل السريرية المتعلقة ب NIHL القائمة على الفئران ، فإن سلالات الفئران الأكثر شيوعا هي CBA / CaJ2،3،6،7 و C57BL / 6 4،5،8. علاوة على ذلك ، يتم استخدام ذكور الفئران 3،4،7 بشكل أكثر شيوعا منالفئران الأنثوية ، لأن الإستروجين له تأثير وقائي على السمع. لذلك ، استخدمنا الفئران الذكور فقط في هذه الدراسة9. بعد الرجوع إلى الأدبيات ، اخترنا 1 كيلو هرتز و 6 كيلو هرتز كترددات للضوضاء المطبقة. كانت شدة الضوضاء المطبقة 115 ديسيبل SPL-A (المحيطة بالقفص) إلى 125 ديسيبل SPL-A (في وسط القفص). بعد تعريض فئران التجارب للضوضاء بشكل مستمر لمدة 6 ساعات في اليوم ، لمدة 5 أيام متتالية ، أشارت الزيادة المثلى في عتبة السمع إلى المدى الأمثل ل NIHL في فئران التجارب. يتم وصف عمليات التعامل مع الحيوانات ، وبناء الإعداد التجريبي ، وإحداث الضوضاء بوضوح خطوة بخطوة في البروتوكول المقدم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان في كلية ماكاي الطبية. تم شراء ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع من المركز الوطني لحيوانات المختبر (مدينة تايبيه الجديدة ، تايوان). تم تربية جميع الفئران وإيوائها وفقا لبروتوكول الحيوان القياسي.
1. تحريض NIHL في الفئران
- تحضير القفص للفئران التجريبية
- للقيام بذلك ، استخدم قفص مصيدة الفئران بأبعاد 14 سم × 17 سم × 24 سم. قطع أربع قطع من الألواح البلاستيكية المموجة إلى أحجام مناسبة ، مما يجعلها تتناسب مع القفص (13 سم × 23 سم و 13 سم × 16 سم).
- لمنع الفئران من قطع أقدامها بواسطة الشبكة الشبكية ، ضع قطعتين في الأسفل وعلى الجانب الخلفي ، على التوالي. ضع القطعتين الأخريين متشابكتين بشكل عمودي مع بعضهما البعض ، لتقسيم المساحة داخل القفص إلى أرباع.
- قم بإجراء هذه الدراسة في صندوق عازل للصوت. ضع مكبر صوت 8.5 سم أمام القفص ، وضع كل من السماعة والقفص في صندوق عازل للصوت.
- افتح برنامج تطبيق CLIO
- حرك المؤشر إلى أيقونة مكبر الصوت ، ثم انقر فوق TwoSin. أدخل قيمة Freq 1 إلى 1000 هرتز وقم بتغييرها ، و Freq 2 إلى 6000 هرتز ، وانقر فوق "موافق" لبدء تشغيل الصوت.
- ضمن علامة التبويب Leq ، قم بتغيير dBV إلى dBSPL. بعد ضبط الوقت على واجهة البرنامج ، انقر فوق زر المثلث الأخضر لتشغيل الصوت.
- ضع ميكروفونا أمام السماعة على مسافة 8.5 سم لمعايرة مستوى الضوضاء (انظر الملف التكميلي 1). اضبط مستوى الضوضاء على 125 ديسيبل SPL-A وراقب باستمرار لمدة لا تقل عن 3 دقائق للتأكد من أن مستوى الضوضاء مستقر بدرجة كافية. استخدم مولدا ومحللا ومضخما لإنشاء الضوضاء والتحكم فيها. (الشكل 1)
ملاحظة: قم بهذه الخطوة في صندوق عازل للصوت لتجنب تلف سمع المشغل. - ضع أربعة ذكور من الفئران C57BL / 6J في القفص (واحد لكل ربع سنة) للتعرض للضوضاء. قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي في كل ربع سنة أثناء التعرض للضوضاء. ضع ميكروفونا في الجزء العلوي من القفص لمراقبة مستوى الضوضاء أثناء التعرض للضوضاء (الشكل 2).
ملاحظة: قم بهذه الخطوة في صندوق عازل للصوت لتجنب تلف سمع المشغل. - تعريض الفئران للضوضاء بترددات 1 كيلو هرتز و 6 كيلو هرتز بشكل مستمر لمدة 6 ساعات في اليوم ، لمدة 5 أيام متتالية.
- قم بقياس عتبات السمع للفئران بعد يوم واحد من التعرض للضوضاء (أي في اليوم 6) عن طريق قياس ABR. كرر قياسات ABR هذه مرة أخرى بعد أسبوع واحد من التعرض للضوضاء (أيفي اليوم 13). بعد قياسات ABR ، ضح بجميع الفئران المعنية وحصد قوقعتها (الشكل 3).
2. التقييم القائم على استجابة جذع الدماغ السمعي (ABR) لعتبة السمع
- استخدم نظام اختبار ABR التجاري المصمم خصيصا للحيوانات الصغيرة10.
- حقن خليط من التيلتامين وزولازيبام (40 ملغ/كغ) وزيلازين (9.3 ملغ/كغ) داخل الصفاق في الفئران للتخدير العام.
ملاحظة: يستغرق تقييم ABR ~ 2 ساعة. تأكد من توفير الدعم الحراري عبر وسادة التدفئة وتطبيق مرهم العين لمنع الجفاف أثناء تخدير الفأر. - قياس ABR في الماوس تحت التخدير العام. ضع أقطاب إبرة تحت الجلد (12 مم) عند الرأس ، خلف صيوان الأذن اليسرى ، والظهر بالقرب من الذيل لقياس عتبة السمع.
- تقديم المنبهات الصوتية باستخدام مكبر صوت يوضع على بعد 1 سم من الأذن اليسرى للحيوان.
- استخدم راسم الذبذبات للتحكم في المحفزات الصوتية. اختر موجة جيبية للمنبهات و 10 k لمقياس النافذة. أدر مقبض التردد للحصول على التردد المطلوب للمحفزات الصوتية.
- اضبط شدة التحفيز عن طريق تدوير مقبض AMLP على مولد الوظائف. احصل على شدة التحفيز المطلوبة عن طريق تحويل مقبض AMLP إلى جهد مناسب ، محسوب من المعايرة.
- اجمع قياسات ABR تحت سلسلة من شدة التحفيز ، من 10 ديسيبل SPL إلى 100 ديسيبل SPL ، بحجم خطوة 10 ديسيبل.
ملاحظة: قم بقياس عتبة السمع في صندوق عازل للصوت. افترض أن الحد الأدنى لمستوى شدة التحفيز الذي يمكن أن يؤدي إلى ظهور موجة V ملحوظة في الإشارة المجمعة هو عتبة ABR10,11 (الشكل 4). بعد تقييم ABR ، راقب الحيوان حتى يتعافى من التخدير (~ 1 ساعة).
3. الفحص المجهري
- إصلاح الأنسجة المحصودة
- بعد قياسات ABR ، التضحية بالفأر عن طريق حقن خليط من التيلتامين وزولازيبام (100 مجم / كجم) والزيلازين (23.25 مجم / كجم) للفحص المجهري.
- احصد القوقعة من الفأر واغمرها على الفور في 10٪ فورمالديهايد (FA) للتثبيت (قوقعتان / مل) لمدة 8 ساعات على الأقل عند 4 درجات مئوية.
- بعد التثبيت ، استبدل محلول FA بمحلول حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك 10٪ (EDTA) لإزالة الكلس لمدة 3-4 أيام عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك، تحقق من كل قوقعة بملاقط للتأكد من أن القوقعة قد طرت بدرجة كافية.
- ضع القوقعة في طبق بتري مملوء بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، وقطع العضو الحلزوني الشكل لكورتي (OC) (كل قوقعة منزوعة الكلس) إلى ثلاثة أقسام - المنعطف القاعدي ، والدوران الأوسط ، والدوران القمي - تلطيخ الأنسجة.
- تحت مجهر تشريح (التكبير: 8x-35x) ، قم بإزالة الهياكل العظمية (سكالا الدهليزي ، سكالا تيمباني ، وموديولوس) من القوقعة منزوعة الكلس واحصل على الأنسجة الرخوة ، بما في ذلك OC (سمك: حوالي 40 ميكرومتر).
- تلطيخ القوقعة المناعية
- تحضير المخزن المؤقت للحظر: قم بإعداد 2٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) و 0.2٪ من محاليل Triton X-100 في PBS.
- انقل الأنسجة المراد تلطيخها من طبق بتري إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ، واغمر الأنسجة في 0.1 مل من المخزن المؤقت للحجب لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT).
- تحضير المخزن المؤقت للأجسام المضادة الأولية Myo7A: قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي Myo7A في المخزن المؤقت للحجب بنسبة حجم 1: 200.
- عالج الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للأجسام المضادة الأولية Myo7A لمدة 2 ساعة في RT.
- شطف الأنسجة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- تحضير الجسم المضاد الثانوي Myo7A (Myo7A-Rb-488) والجسم المضاد للفيلويدين (phalloidin-594): تمييع الجسم المضاد الثانوي Myo7A (1: 400) والجسم المضاد phalloidin (1: 200) في المخزن المؤقت للحظر.
- عالج الأنسجة ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي Myo7A ومخزن الأجسام المضادة phalloidin لمدة 2 ساعة في RT.
- بعد علاج الأجسام المضادة + phalloidin ، شطف الأنسجة في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات ، لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- انقل الأنسجة المغسولة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى طبق بتري مملوء ب PBS باستخدام ماصة نقل بلاستيكية سعة 1 مل مع طرف مقطوع.
- للتحضير للفحص المجهري ، قم بفتح الأنسجة ، وضعها على شريحة زجاجية ، وأضف 15 ميكرولتر من وسط فلوروماونت 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) على الأنسجة لتغطيتها بالكامل. ضع غطاء زجاجي برفق على المنديل. اتركي الشريحة طوال الليل في RT قبل إغلاقها بطلاء الأظافر.
- الحصول على الصور
- الحصول على صور 2D باستخدام المجهر مضان تستقيم وبرنامج الحصول على الصور.
- قبل إجراء الفحص المجهري ، قم بتوسيط الأنسجة في مجال الرؤية واضبط الحساسية على ISO 100. اضبط وقت التعرض في البداية بالنقر فوق الزر "الوضع التلقائي " الخاص بالبرنامج ، ثم قم بالضبط يدويا بالنقر فوق الزر "ضبط " لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
- اضبط الطول الموجي للضوء الساقط لإثارة الفلوروفورات عن طريق تدوير مكعب التألق. تم استخدام الألوان الزائفة لتمييز الانبعاث من ملصقات الفلورسنت المختلفة (الضوء الأزرق: DAPI ؛ الضوء الأخضر: Myo7A ؛ الضوء الأحمر: phalloidin).
- عن طريق مسح عينة الأنسجة ، قم بإنشاء وجمع بيانات التصوير كملفات صور .tif و .jpg.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحول في عتبة السمع ABR
تم قياس عتبة السمع للفئران باستخدام ABR المتفجر إما يوم واحد أو أسبوع واحد بعد التعرض للضوضاء. لوحظت زيادة كبيرة في عتبة السمع في جميع الترددات الثلاثة المختبرة (12 كيلو هرتز: 84.29 ± 2.77 ديسيبل SPL ؛ 24 كيلو هرتز: 91.43 ± 0.92 ديسيبل SPL ؛ 32 كيلو هرتز: 98.57 ± 1.43 ديسيبل SPL) بعد يوم واحد من التعرض للضوضاء (أي اليوم السادس). حدث التعافي الجزئي للسمع بعد أسبوع واحد من التعرض للضوضاء (أي اليوم الثالث عشر) ، لكن عتبات السمع كانت لا تزال مرتفعة بأكثر من 30 ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن تقسيم NIHL إلى نوعين: NIHL المؤقت ، والذي يظهر تحولا زمنيا لعتبة السمع ، و NIHL الدائم ، والذي يتميز بتحول عتبة السمع الدائم. ويعتقد أن فقدان السمع الذي لاحظناهفي اليوم 6 (1 يوم بعد التعرض للضوضاء) هو مزيج من هذين النوعين. في هذه الحالة ، ستظهر عتبة السمع انتعاشا تدريجيا بمرور الوقت بسبب المكون الزمني لفقدان السمع. في دراساتنا التجريبية الأولية ، النتائج المكتسبة بنفس الإعداد والحيوانات ، تعافى فقدان السمع الناتج عن التعرض للضوضاء لمدة يومين تماما في أسبوعين ، مما يشير إلى أن NIHL الدائم لم يتم إنشاؤه بال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
نشكر المنح المقدمة من وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST) التابعة لحكومة تايوان (MOST 110-2314-B-715-005 ، MOST 111-2314-B-715-009-MY3) ، والمنح البحثية الداخلية من كلية ماكاي الطبية (MMC-RD-110-1B-P030 ، MMC-RD-111-CF-G002-03).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1/4 "مجموعة ميكروفون قياسية للمجال الحر CCP | GRAS | 428158 | للصوت للتعرض |
| للضوضاء ، AMI100D | BIOPAC | لاستجابة جذع الدماغ السمعية | |
| مكبر للصوت الحيوي ، BIO100C | BIOPAC | للاستجابة السمعية لجذع الدماغ | |
| الأبقار الألبومين | SIGMA | A9647 | تلطيخ التألق المناعي |
| برنامج Cellens | أوليمبوس لعلوم | الحصول على الصور | |
| المموج | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | تلطيخ التألق المناعي |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك | SIGMA | E5134 | إزالة الكلس |
| مضخم الاستجابة المستحث ، ERS100C | BIOPAC | لاستجابة | |
| جذع الدماغ السمعيةالفورمالديهايد | APLHA | F030410 | تثبيت نظام |
| الحصول على بيانات القوقعة عالية الأداء ، MP160 | BIOPAC | للاستجابة السمعية لجذع الدماغ | |
| كابل التمديد المعياري ، MEC110C | BIOPAC | لاستجابة جذع الدماغ السمعي | |
| Myo7A الجسم المضاد الأساسي | Proteus | 25-6790 | تلطيخ التألق المناعي |
| Myo7A الجسم المضاد الثانوي | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | تلطيخ التلوين المناعي |
| ، أحادي القطب 12 مم TP ، EL452 | BIOPAC | للاستجابة السمعية لجذع الدماغ | |
| الجسم المضاد للفالودين | Alexa Fluor | A12381 | تلطيخ التألق المناعي |
| ملحي مخزن بالفوسفات | SIGMA | P4417 | |
| قفص | 14 سم × 17 سم × 24 سم | ||
| ROMPUN- حقن الزيلازين ، محلول ؛ | Bayer HealthCare، LLC | ||
| مكبر للصوت ، MT-1000 | unika | للتعرض للضوضاء | |
| مولد / محلل صوت / متفرقات ، FW-02 | CLIO | 620300719 | للتعرض للضوضاء |
| غرفة عازلة للصوت | IEA تقنية | كهربائية للتعرض للضوضاء ومكبر صوت ABR | |
| ؛ | IEA الكهربائية الصوتية | لوحدة محفز التعرض | |
| للضوضاء ، STM100C | BIOPAC | للاستجابة السمعية لجذع الدماغ | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | مجموعة تلطيخ التلوين المناعي |
| ، OUT101 | BIOPAC | لاستجابة جذع الدماغ | |
| مجهر مستقيم ، الحصول على صور BX53 | Olympus | ||
| زولتيل | فيرباك |
المراجع
- World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
- Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy. Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).
- Amanipour, R. M., et al. Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).
- Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).
- Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. Estrogen and hearing: a summary of recent investigations. Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).
- Tsai, S. C. -S., et al. The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice. Hearing Research. 413, 108254(2022).
- Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood. Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).
- Yu, S. -K., et al. Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
