مقالة منهجية

التحضير والخصائص والسمية وتقييم الفعالية للقاح ورم مستحلب نانوي ذاتي التجميع ذاتيا في المختبر وفي الجسم الحي

DOI:

10.3791/64299

⸱

سبتمبر 28, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University of Chinese PLA

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم طرقا مفصلة لإعداد وتقييم لقاح ورم مستحلب نانوي ذاتي التركيب في المختبر وفي الجسم الحي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جذبت الببتيدات Epitope اهتماما واسع النطاق في مجال لقاحات الأورام بسبب سلامتها وخصوصيتها العالية وإنتاجها المريح. على وجه الخصوص ، يمكن لبعض الحواتم المقيدة ب MHC I أن تحفز نشاط الخلايا الليمفاوية التائية السامة الفعالة لإزالة الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، تعد إدارة الأنف تقنية توصيل فعالة وآمنة للقاحات الأورام نظرا لملاءمتها وتحسين امتثال المريض. ومع ذلك ، فإن الببتيدات الخاتمة غير مناسبة للولادة الأنفية بسبب ضعف مناعتها ونقص كفاءة التوصيل. المستحلبات النانوية (NEs) هي أنظمة مستقرة ديناميكيا حراريا يمكن تحميلها بالمستضدات وتسليمها مباشرة إلى سطح الغشاء المخاطي للأنف. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) هو الخماسي الأساسي للامينين ، وهو ببتيد ملزم بالأنتغرين تعبر عنه الخلايا الظهارية التنفسية البشرية. في هذه الدراسة ، تم تحضير لقاح ورم الببتيد NE ذاتي التجميع ذاتيا للأنف يحتوي على الببتيد الاصطناعي IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) بطريقة استحلاب منخفضة الطاقة. يمكن أن يؤدي الجمع بين IKVAV و OVA257-264 إلى تعزيز امتصاص المستضد بواسطة الخلايا الظهارية المخاطية للأنف. هنا ، نضع بروتوكولا لدراسة الخصائص الفيزيائية والكيميائية بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) ، ومجهر القوة الذرية (AFM) ، وتشتت الضوء الديناميكي (DLS) ؛ الاستقرار في وجود بروتين الميوسين. السمية من خلال فحص صلاحية الخلايا لخلايا BEAS-2B وأنسجة الأنف والرئة للفئران C57BL / 6 ؛ الامتصاص الخلوي بواسطة مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM) ؛ الافراج عن ملامح عن طريق تصوير الحيوانات الصغيرة في الجسم الحي ؛ والتأثير الوقائي والعلاجي للقاح باستخدام نموذج E.G7 الحامل للورم. نتوقع أن يوفر البروتوكول أدلة تقنية ونظرية للتطوير المستقبلي للقاحات الغشاء المخاطي الببتيد الببتيد الجديدة للخلايا التائية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باعتبارها واحدة من أهم ابتكارات الصحة العامة ، تلعب اللقاحات دورا رئيسيا في مكافحة العبء العالمي للأمراض البشرية1. على سبيل المثال ، في الوقت الحاضر ، يتم اختبار أكثر من 120 لقاحا مرشحا لأمراض COVID-19 ، تمت الموافقة على بعضها في العديد من البلدان2. تشير التقارير الأخيرة إلى أن لقاحات السرطان قد حسنت بشكل فعال تقدم علاجات السرطان السريرية لأنها توجه الجهاز المناعي لمرضى السرطان للتعرف على المستضدات على أنها غريبة على الجسم3. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام العديد من حوامل الخلايا التائية الموجودة داخل أو خارج الخلايا السرطانية لتصميم لقاحات الببتيد ، والتي أظهرت مزايا في علاج السرطانات النقيلي بسبب نقص السمية الكبيرة المرتبطة بالعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي 4,5. منذ منتصف تسعينيات القرن العشرين ، أجريت التجارب قبل السريرية والسريرية لعلاج الورم بشكل رئيسي باستخدام لقاحات الببتيد المستضد ، ولكن القليل من اللقاحات تظهر تأثير علاجي مناسب على مرضى السرطان6. علاوة على ذلك ، فإن لقاحات السرطان التي تحتوي على حوامل الببتيد لديها مناعة ضعيفة وكفاءة توصيل غير كافية ، وقد يكون ذلك بسبب التدهور السريع للببتيدات خارج الخلية التي تنتشر بسرعة من موقع الإعطاء ، مما يؤدي إلى عدم كفاية امتصاص الخلايا المناعيةللمستضد 7. لذلك ، من الضروري التغلب على هذه العقبات باستخدام تكنولوجيا توصيل اللقاحات.

OVA 257-264 ، حاتمة MHC من الفئة الأولى257-264 المعبر عنها كبروتين اندماج ، هي نموذج8 مستخدم بشكل متكرر. بالإضافة إلى ذلك ، يعد OVA257-264 أمرا بالغ الأهمية للاستجابة المناعية التكيفية ضد الأورام ، والتي تعتمد على استجابة الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL). يتم التوسط فيه بواسطة خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد في الورم ، والتي يسببها ببتيد OVA257-264 . يتميز بعدم كفاية الجرانزيم B ، الذي تطلقه الخلايا التائية السامة ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمجللخلايا المستهدفة 8. ومع ذلك ، فإن إعطاء الببتيد OVA257-264 المجاني قد يحفز القليل من نشاط CTL لأن امتصاص هذه المستضدات يحدث في خلايا غير محددة بدلا من الخلايا المقدمة للمستضد (APCs). يؤدي نقص التحفيز المناعي المناسب إلى نشاط CTL5. لذلك ، يتطلب تحريض نشاط CTL الفعال تقدما كبيرا.

بسبب الحاجز الذي توفره الخلايا الظهارية والإفراز المستمر للمخاط ، تتم إزالة مستضدات اللقاح بسرعة من مخاط الأنف 9,10. يعد تطوير ناقل لقاح فعال يمكنه المرور عبر الأنسجة المخاطية أمرا بالغ الأهمية لأن الخلايا المقدمة للمستضد تقع تحت ظهارة الغشاء المخاطي9. الحقن عن طريق الأنف من اللقاحات يحفز نظريا مناعة الغشاء المخاطي لمكافحة عدوى الغشاء المخاطي11. بالإضافة إلى ذلك ، يعد التسليم الأنفي طريقة فعالة وآمنة لإدارة اللقاحات نظرا لملاءمتها ، وتجنب الإدارة المعوية ، وتحسين امتثال المريض7. لذلك ، فإن الولادة الأنفية هي وسيلة جيدة لإعطاء اللقاح النانوي الببتيد الجديد.

تم ابتكار العديد من المواد الحيوية الاصطناعية للجمع بين حواجز الأنسجة الخلوية والتفاعلات بين الخلايا والخلايا. تم إدخال بعض البروتينات النشطة بيولوجيا ، مثل Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) ، كجزء من بنية الهيدروجيل لمنح النشاط الحيوي12. من المحتمل أن يساهم هذا الببتيد في ارتباط الخلية والهجرة والنمو13 ويربط الإنتغرينات α 3β1 وα 6β1 للتفاعل مع أنواع الخلايا السرطانية المختلفة. IKVAV هو ببتيد التصاق خلوي مشتق من سلسلة بروتين الغشاء القاعدي اللامينينα 1 التي كانت تستخدم في الأصل لنمذجة البيئة المكروية العصبية وتسبب التمايز العصبي14. لذلك ، فإن العثور على وسيلة توصيل فعالة لهذا اللقاح الجديد أمر مهم لمكافحة المرض.

كما تم تركيب أنظمة المستحلب المبلغ عنها مؤخرا ، مثل W805EC و MF59 ، لتوصيل تجويف الأنف للقاح الأنفلونزا المعطل أو المستضد السطحي لالتهاب الكبد B المؤتلف وتوضيحها لتحفيز كل من المناعة المخاطية والجهازية15. تتميز المستحلبات النانوية (NEs) بمزايا الإدارة السهلة والتشكيل المشترك المريح مع المواد المساعدة الفعالة مقارنة بأنظمة توصيل الجسيمات المخاطية16. تم الإبلاغ عن لقاحات المستحلب النانوي لتغيير النمط الظاهري التحسسي بطريقة مستدامة تختلف عن إزالة التحسس التقليدية ، مما يؤدي إلى تأثيرات قمعية طويلة المدى17. أفاد آخرون أن المستحلبات النانوية جنبا إلى جنب مع المستضدات المناعية المهيمنة الخاصة ب MTB يمكن أن تحفز استجابات قوية للخلايا المخاطية وتمنح حماية كبيرة18. لذلك ، تم تصميم لقاح نانوي جديد ذاتي التجميع داخل الأنف مع الببتيد الاصطناعي IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA ، الببتيد الذي يتكون من IKVAV المرتبط ب OVA257-264). من المهم تقييم هذا اللقاح النانوي الجديد بشكل منهجي.

الغرض من هذا البروتوكول هو إجراء تقييم منهجي للخصائص الفيزيائية والكيميائية والسمية واستقرار اللقاح النانوي ، واكتشاف ما إذا كان امتصاص المستضد والآثار الوقائية والعلاجية يتم تعزيزها باستخدام الوسائل التقنية ، وتوضيح المحتويات التجريبية الرئيسية. في هذه الدراسة ، أنشأنا سلسلة من البروتوكولات لدراسة الخصائص الفيزيائية والكيميائية والاستقرار ، وتحديد حجم سمية خلايا I-OVA NE إلى BEAS-2B بواسطة CCK-8 ، ومراقبة قدرة خلايا BEAS-2B على تقديم المستضد للقاح باستخدام المجهر متحد البؤر ، وتقييم ملامح إطلاق هذا اللقاح النانوي الجديد في الجسم الحي وفي المختبر، والكشف عن التأثير الوقائي والعلاجي لهذا اللقاح باستخدام نموذج الفأر الحامل للورم E.G7-OVA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت التجارب على الحيوانات وفقا لإرشادات المختبر للمراجعة الأخلاقية لرعاية الحيوان (GB / T 35892-2018) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية وأخلاقيات المختبر التابعة للجامعة الطبية العسكرية الثالثة. تم القتل الرحيم للفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من بنتوباربيتال الصوديوم 1٪.

1. إعداد I-OVA NE

  1. Admix 1 mg من monophosphoryl lipid A (MPLA) مع 100 ميكرولتر من DMSO ، دوامة لمدة 5 دقائق ، واتركها تقف لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT) لتذوب تماما.
  2. أضف Tween 80 و I-OVA كميا واخلطهما.
    ملاحظة: تم خلط Tween 80 و I-OVA بنسبة كتلة 25: 119.
  3. أضف السكوالين إلى الخليط المحضر في الخطوة 1.2 (7: 3 ، Smix: السكوالين).
  4. أضف 100 ميكرولتر من محلول MPLA (10 مجم / مل) إلى الخليط المحضر في الخطوة 1.3.
  5. تحضير لقاح المستحلب النانوي باستخدام طرق استحلاب منخفضة الطاقة19: أضف المحلول المختلط إلى قطرات الماء بنسبة 70٪ تقريبا من الحجم الكلي وحركه برفق للحصول على خليط شفاف وسهل التدفق.
    ملاحظة: تم تحضير عنصر التحكم BNE (مستحلب فارغ) بنفس الطريقة ، مع استبدال الماء ب I-OVA.

2. التوصيف الفيزيائي الكيميائي والاستقرار

ملاحظة: تقييم توزيع حجم القطيرات وإمكانات زيتا والبيانات الفيزيائية والكيميائية الأخرى للقاح I-OVA NE باتباع الخطوات 2.1-2.3 ؛ إجراء التوصيف المورفولوجي للقاح I-OVA NE باتباع الخطوات 2.4-2.7 ؛ وفحص البنية ثلاثية الأبعاد للقاح I-OVA NE باتباع الخطوات 2.8-2.9.

  1. امزج 50 مجم من بروتين الميوسين مع 100 مل من الماء للحقن لتحضير محلول الميوسين بنسبة 0.05٪.
  2. خفف 4 ملغ/مل I-OVA NE 200 أضعاف مع 0.05 ملغ/مل من بروتين الميوسين أو الماء منزوع الأيونات.
  3. راقب أحجام الجسيمات وإمكانات زيتا ومؤشر تعدد التشتت (PDI) وحركة الرحلان الكهربائي عند 25 درجة مئوية باستخدام محلل نانوي19.
  4. تمييع 10 ميكرولتر من I-OVA NE 200 أضعاف مع 2 مل من الماء منزوع الأيونات.
  5. ضع 5 ميكرولتر من لقاح I-OVA NE المخفف مسبقا (الخطوة 2.4) على شبكة نحاسية مغلفة بالكربون ، وقم بتغطيتها ب 10 ميكرولتر من حمض الفوسفوتونجستيك 1٪ لمدة 3 دقائق.
  6. قم بإزالة حمض الفوسفوتونجستيك الزائد باستخدام ورق الترشيح.
  7. الحصول على الصور باستخدام TEM. ضع عينة 10 ميكرولتر مخففة 50 مرة على شبكة من النحاس الكربوني 100 شبكة واتركها تقف في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق قبل إضافة 10 ميكرولتر من حمض الفوسفوتونجستيك (1٪ ، درجة الحموضة 7.4). فحص جميع العينات بواسطة TEM بجهد 120 كيلو فولت.
  8. توصيف التشكل الجزيئي ل I-OVA NEباستخدام مجهر القوة الذرية عالي الدقة. الحصول على الصور الملونة ل I-OVA NE في ظل الظروف التالية: لتحقيقات التنغستن (ثابت القوة: 0.06 N·m-1) ؛ نطاق المسح: 450 نانومتر × 450 نانومتر ؛ وضع التنصت: وضع التصوير. وطريقة المسح: المسح الضوئي نقطة بنقطة في RT.

3. مقايسات السمية في المختبر وفي الجسم الحي

ملاحظة: تم تقييم السمية في المختبر للقاح I-OVA NE باتباع الخطوات 3.1-3.9 ، وتم تقييم السمية في الجسم الحي للقاح I-OVA NE باتباع الخطوات 3.10-3.13.

  1. إحياء الخلايا الظهارية البشرية BEAS-2B باتباع الخطوات 3.1.1-3.1.4 واستزراعها في وسط نمو كامل عند 37 درجة مئويةفي حاضنة CO 2 بنسبة 5٪.
    ملاحظة: لتحضير وسط النمو الكامل، أضف مصل الأبقار الجنيني (FBS) والبنسلين/الستربتومايسين إلى وسط RPMI-1640 بتركيزات نهائية تبلغ 10٪ و1٪ على التوالي.
    1. قم بتشغيل الحمام المائي واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. قم بإزالة قوارير الخلية المجمدة في النيتروجين السائل وتذوب بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
    2. بعد الذوبان ، قم بسحب الخلايا بسرعة في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل ، وأضف 2 مل من وسط النمو الكامل ، وأجهزة الطرد المركزي عند 129 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 2 مل من وسط النمو الكامل لإعادة تعليق الخلايا ، وأجهزة الطرد المركزي عند 129 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 6 مل من وسط النمو الكامل لإعادة تعليق الخلايا ، ونقل الخلايا إلى قارورة ثقافة T25 لزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
  2. عندما تصل كثافة الخلية إلى 80٪ -90٪ ، تخلص من وسط المزرعة واغسل الخلايا مرتين باستخدام 2 مل من برنامج تلفزيوني. أضف 1 مل من 0.25٪ تربسين لهضم الخلايا لمدة 1-2 دقيقة. عند ملاحظة تقريب الخلايا ، أضف على الفور 4 مل من وسط النمو الكامل لتحييد التربسين.
  3. امزج العينات وشفطها في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 129 × جم لمدة 5 دقائق.
  4. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط الكامل RPMI-1640. استخدم 20 ميكرولتر لعد الخلايا ، وقم بتخفيف الخلايا إلى 1 × 105 خلايا / مل.
  5. صفيحة خلايا BEAS-2B بكثافة 1 × 104 خلايا / بئر في 96 لوحة بئر في 100 ميكرولتر من وسط RPMI-1640 الكامل واحتضان الألواح مسبقا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
  6. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 100 ميكرولتر من I-OVA NE ، و 100 ميكرولتر من I-OVA + BNE (مختلط جسديا) ، و 100 ميكرولتر من I-OVA المخفف مسبقا بوسط نمو كامل بتركيزات نهائية مختلفة (0.5 مجم / مل ، 1 مجم / مل ، 2 مجم / مل ، 4 مجم / مل ، 8 مجم / مل) ، مع BNE كعنصر تحكم. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: أضف 100 ميكرولتر من وسط النمو الكامل إلى مجموعات التحكم السلبية و 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (1 × 105 / مل) إلى مجموعات التحكم الإيجابية.
  7. قم بإزالة الوسط وإضافة 90 ميكرولتر من وسط النمو الكامل و 10 ميكرولتر من محلول CCK-8 إلى كل بئر من اللوحة.
  8. احتضان اللوحة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
  9. قم بقياس امتصاص كل بئر عند 450 نانومتر باستخدام قارئ لوحة يحمل علامة الإنزيم.
  10. احسب نسبة البقاء على قيد الحياة لخلايا BEAS-2B كما هو موضح في المعادلة التالية:
    (عينة OD450 - التحكم السلبي OD450 / التحكم الإيجابي OD450 - التحكم السلبي OD450) × 100٪
  11. قسم الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 6 أسابيع بشكل عشوائي إلى خمس مجموعات (n = 5 في كل مجموعة) وقم بتخديرها باستخدام 4٪ isoflurane للتحريض. الحفاظ على التخدير مع 2 ٪ إيزوفلوران. استخدام مرهم كبريتات نيومايسين على عيون الفئران لمنع الجفاف.
  12. استخدم أطراف ماصة 10 ميكرولتر لإجراء التحصين الأنفي للفئران باستخدام 10 ميكرولتر / فتحة الأنف من I-OVA و I-OVA + BNE و IOVA NE عند 4 مجم / مل طوال الأيام الثلاثة. استخدم BNE و PBS كعنصر تحكم تجريبي.
    ملاحظة: توفير الدعم الحراري حتى يتعافى الحيوان من التخدير.
  13. القتل الرحيم لجميع الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغ / كغ 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم في اليوم 4.
  14. قطع عينات بسمك 3 مم تقريبا من أنسجة الأنف بالمقص ، وإزالة أنسجة الرئة.
  15. إصلاح أنسجة الأنف وأنسجة الرئة بأكملها في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة. قم بتجفيف الأنسجة من خلال كحول متسلسل وتدرج زيلين ثم قم بتضمينه في البارافين. شريحة كتل الشمع النهائي على قطاعة البارافين بسمك 4 ميكرومتر.
  16. تلطيخ الأقسام مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H &E). بعد ذلك ، لاحظ السمية المخاطية ، بما في ذلك احتقان الدم ، والوذمة ، وتسلل العدلات ، والأضرار الهيكلية في الغشاء المخاطي للأنف وأنسجة الرئة ، تحت المجهر (100x و 200x)7.

4. في المختبر امتصاص الخلوية

  1. خلايا الصفيحة BEAS-2B بكثافة 5 × 10 5 خلايا / بئر في 12 لوحة بئر مع أغطية في 2 مل من وسط النمو الكامل واحتضان الألواح مسبقا طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة5٪.
  2. أضف 100 ميكرولتر من I-OVA NE المسمى FITC (نقاء: 98.3٪ ، من إنتاج الشركة ، 4 مجم / مل) أو I-OVA (4 مجم / مل) إلى 900 ميكرولتر من معلق الخلية وضعه عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
    ملاحظة: قم بإعداد I-OVA NE المسمى FITC كما هو موضح في الخطوة 4.1. أضف 1 مل من وسط النمو الكامل إلى المجموعات الضابطة.
  3. يغسل ثلاث مرات باستخدام 0.1 متر PBS (1 مل / بئر) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بعد العلاج.
  4. إصلاح هذه العينات مع 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة في الظلام. بعد التثبيت ، قم بإزالة بارافورمالدهايد واغسله 3 مرات باستخدام 0.1 متر PBS (1 مل / بئر) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. احتضان العينات مسبقا باستخدام DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) بتركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام/مل لمدة 10 دقائق في الظلام، ثم اغسلها 5 مرات باستخدام 0.1 M PBS (1 مل/بئر) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بعد العلاج.
  6. احصل على الامتصاص الخلوي بواسطة CLSM باستخدام إعدادات المعلمات التالية: حجم الإطار: 512 بكسل × 512 بكسل, سرعة المسح الضوئي: 8; خطوة الخط: 1 ؛ المتوسط: 2.

5. في الجسم الحي الافراج عن

  1. تخدير الفئران عارية مع 4 ٪ من الغاز isoflurane والحفاظ على التخدير في 2 ٪ isoflurane. تحصين الفئران العارية عن طريق الأنف ب 10 ميكرولتر من I-OVA المسمى PE عند 4 مجم / مل أو I-OVA NE المسمى PE عند 4 مجم / مل في كل منخر.
  2. في 0 ساعة ، 0.5 ساعة ، 1.5 ساعة ، 3 ، 6 ساعات ، 9 ساعات ، 12 ساعة ، و 24 ساعة ، التقط جميع الفئران تحت التخدير بواسطة نظام IVIS.
  3. قم بإجراء مسح للخلفية مباشرة قبل إعطاء الأنف لتوفير قيمة عتبة (الحد الأدنى = 1.06 × 106) لضبط الصور التي تم جمعها في جميع النقاط الزمنية.
  4. انقر فوق برنامج Living Image لبدء التسلسل وانقر فوق تهيئة لتهيئة نظام IVIS
  5. عند تهيئته ، يكون مصباح حالة درجة الحرارة في لوحة التحكم في اكتساب IVIS أحمر. عندما يتغير ضوء حالة درجة الحرارة إلى اللون الأخضر ، يمكن إجراء التصوير.
  6. انقر فوق معالج التصوير ثم اختر مضان في مربع الحوار الذي يظهر.
  7. اضبط المعلمات التالية: وقت التعرض: ثانية تلقائية ، الربين: 8 ، F / Stop: 2 ، مجال الرؤية: D.
  8. حدد مرشح الإثارة 620 نانومتر ومرشح الانبعاثات 670 نانومتر. انقر فوق الحصول على تسلسل للحصول على الصورة.
  9. قم بمعالجة الصور الحية لجميع الفئران وبيانات الإشعاع باستخدام برنامج Living Image.
    1. بعد الحصول على الصورة ، انقر فوق أدوات عائد الاستثمار في لوحة الأدوات ، وحدد دائرة ، وقم بعمل دائرة عائد الاستثمار .
    2. انقر فوق قياس عائد الاستثمار للحصول على قيمة كمية لمنطقة عائد الاستثمار .

6. في الجسم الحي فعالية مضادة للورم

  1. قم بتحديث وزراعة خلايا سرطان الغدد الليمفاوية للفأر E.G7-OVA من EL4 مع وسط نمو كامل باتباع الخطوات 2.1.1-2.1.4.
    ملاحظة: لتحضير وسط النمو الكامل لخلية E.G7-OVA ، امزج وسط RPMI 1640 مع 2 mM L-glutamine المعدل ليحتوي على 1.5 جم / لتر بيكربونات الصوديوم ، 4.5 جم / لتر جلوكوز ، 10 mM HEPES ، و 1.0 mM بيروفات الصوديوم واستكمل ب 0.05 mM 2-mercaptoethanol و 0.4 mg / mL G418 ، 90٪ ، ومصل الأبقار الجنيني ، 10٪.
  2. الاستزراع الفرعي للخلايا بنسبة 1: 2 عندما تصل الخلايا إلى كثافة تتراوح بين 1 × 106 خلايا / مل و 1 × 107 خلايا / مل.
  3. تقييم التأثير الوقائي الوقائي على الفئران كما هو موضح في الخطوات 6.3.1-6.3.4..
    1. قسم الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 6 أسابيع بشكل عشوائي إلى خمس مجموعات (n = 8 في كل مجموعة). تخدير الفئران العارية بغاز إيزوفلوران 4٪ والحفاظ على التخدير بنسبة 2٪ إيزوفلوران. حلق جزئيا شعر الظهر ومرهم كبريتات النيومايسين على عيون الفئران لمنع الجفاف.
    2. تحصين الفئران داخل الأنف ب 10 ميكرولتر من 1 ملغ / مل I-OVA أو BNE + I-OVA أو I-OVA NE في كل منخر ، BNE (مخفف أربع مرات مع PBS) ، أو تحكم PBS 3 مرات مع فاصل 7 أيام بين كل تحصين.
    3. تلقيح جميع الفئران تحت الجلد في الظهر الأيمن مع 5 × 105 E. G7-OVA الخلايا في اليوم السابع بعد التحصين النهائي.
    4. في 0 و 6 و 9 و 12 و 15 و 18 يوما بعد التحصين النهائي ، راقب أحجام الورم عن طريق قياس محورين من الورم باستخدام الفرجار الرقمي ، وسجل بقاء الفئران لمدة 30 يوما (بعد التحصين النهائي).
  4. تقييم التأثير الوقائي العلاجي على الفئران بعد تلقيح خلايا E.G7-OVA كما هو موضح في الخطوات 6.4.1-6.4.3. لتجميع الفئران والتعامل معها ، راجع الخطوة 6.3.1.
    1. في اليوم 0 ، قم بحقن الفئران C57BL / 6 تحت الجلد في الظهر الأيمن بخلايا E.G7-OVA (5 × 105 خلايا / فأر).
    2. في 0 و 7 و 14 يوما بعد الحقن ، قم بتحصين جميع الفئران المحصنة عن طريق الأنف ب 10 ميكرولتر من I-OVA أو BNE + I-OVA أو I-OVA NE (جميعها بتركيزات 1 مجم / مل) أو BNE أو PBS ثلاث مرات في كل منخر.
    3. في 0 و 6 و 9 و 12 و 15 و 18 يوما بعد الحقن ، راقب حجم الورم وسجل بقاء الفئران لمدة 30 يوما.
      ملاحظة: إذا تجاوز حجم الورم 3000 مم3 ، فيجب القتل الرحيم للفئران لأسباب إنسانية ، وسيتم اعتبار هذه الفئران ميتة في منحنى البقاء على قيد الحياة. يتم حساب حجم الورم بواسطة صيغة إهليلجية معدلة كما هو موضح في المعادلة التالية:
      الحجم = π/6 × الطول × العرض2
      حيث يمثل L طول الورم ، ويمثل W عرض الورم (وحدة الطول: مم ، وحدة الحجم: مم3).

7. التحليل الإحصائي

  1. تحليل الاختلافات في البيانات بين المجموعات المختلفة باستخدام البرامج الإحصائية المناسبة مع ANOVA أحادي الاتجاه أو مقارنات Tukey المتعددة أو اختبار t للطالب. استخدم طريقة كابلان-ماير لتقدير نتائج البقاء على قيد الحياة ومقارنة المجموعات بإحصائيات رتبة اللوغاريتم. عبر عن جميع النتائج كمتوسط ± SD. يتم تمثيل أهمية قيم P P < 0.05 و P < 0.01 و P < 0.001 باستخدام * و ** و ** ، على التوالي ، على المؤامرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفقا للبروتوكول ، أكملنا التحضير والتقييم التجريبي في المختبر وفي الجسم الحي لتوصيل اللقاح النانوي لورم الأنف. تعد TEM و AFM و DLS وسائل فعالة لتقييم الخصائص الأساسية لإمكانات زيتا السطحية وحجم جسيمات اللقاح النانوي (الشكل 1). الخلايا الظهارية BEAS-2B هي نموذج فحص مفيد لاختبار السمية في المختبر للقاحات الأنفية (الشكل 2A). توضح الصور المجهرية الملطخة ب H&E أن I-OVA NE لم يكن له سمية مخاطية واضحة ، بما في ذلك تلف الأنسجة أو النزيف أو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمتع اللقاحات النانوية التي تعمل بأغشية الخلايا المناعية بمزايا كبيرة في العلاج الموجه للأمراض ، ويتم تقليل الآثار الجانبية من خلال خصائص مثل الانتحاء الفريد للورم ، وتحديد أهداف محددة ، والدورة الدموية المطولة ، والتفاعلات المحسنة بين الخلايا ، والسمية الجهازية المنخفضة. يمكن أيضا دمجها بسهولة مع وحدات العلاج الأخرى لعلاج السرطانات بشكل تعاوني16,20. يمكن الحصول على السمات المرغوبة من خلال التحكم في الخصائص الفيزيائية والكيميائية مثل القياس والشكل والشحنة الكهرب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل رقم 31670938 ، 32070924 ، 32000651 من برنامج المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين ، رقم 2014jcyjA0107 ورقم 2019jcyjA-msxmx0159 من برنامج مشروع مؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ ، رقم 2020XBK24 ورقم 2020XBK26 من المشاريع الخاصة بجامعة الجيش الطبية ، ورقم 202090031021 ورقم 202090031035 من البرنامج الوطني للابتكار وريادة الأعمال لطلاب الجامعات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
96-بئر لوحاتCorning Incorporated ، الولايات المتحدة الأمريكيةCLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate readerBio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA  مجموعات Bio-Rad 6.0
CCK-8Dojindo ، اليابانCK04
أجهزة الطرد المركزي 5810 REppendorf ، ألمانيا   ؛5811000398
DAPISigma-Aldrich ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةD9542
مصل بقري الجنين (FBS)Hyclone (Life Technology ، الولايات المتحدة الأمريكية)SH30088.03
FITC I-OVAShanghai Botai
Biotechnology Co.، Ltd.		NA
HF 90/240 حاضنةشفاء القوة, سويسراNA
HPLC شنغهاي بوتاي التكنولوجيا الحيوية المحدودةE2695
المجهر المقلوبنيكون ، اليابانDSZ5000X
IPC-208جامعة تشونغ تشينغ ، الصين
NA IVIS system  ؛شركة Caliper Life Science LimitedNA
JEM-1230 TEMJEOL Limited Company of Japan1230 TEM
Malvern NANO ZSMalvern Instruments Ltd. ، المملكة المتحدةNA
MPLA& nbsp ؛ شركة Invivogen
Lit.		tlrl-mpla
مرهم كبريتاتنيومايسين شنغهاي CP العامة للأدوية المحدودةH31022262
OVA257 &ndash ؛ 264شنغهاي بوتاي
التكنولوجيا الحيوية المحدودة		NA
RPMI 1640Hyclone متوسط (Life Technology ، الولايات المتحدة الأمريكية)SH30809.01
اقتران الببتيد الاصطناعي (I-OVA) من IKVAV-PAShanghai Botai
Biotechnology Co.، Ltd.		NA
Zeiss LSM800 مجهر مضان متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزرزايس ، ألمانياZeiss LSM800
علامة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160(2022).
  3. Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
  4. Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363(2022).
  5. Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
  6. Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
  7. Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
  8. Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
  9. Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
  10. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
  11. Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
  12. Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220(2022).
  13. Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
  14. Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
  15. Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954(2008).
  16. Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
  17. O'Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
  18. Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
  19. Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  20. Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
  21. Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920(2021).
  22. George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
  23. Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).
  24. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477(2022).
  25. Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731(2020).
  26. Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
  27. Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
  28. Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020(2022).
  29. Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
  30. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  31. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).
  32. Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IKVAV BEAS2B

مقالات ذات صلة