مقالة منهجية

الفصل التلقائي وجمع المواد المرتبطة بالسرطان من العينات السريرية

2.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64325

⸱

يناير 13, 2023

 ,  ,  , 
1Clinomics Inc.

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه الورقة تطبيق المعدات الآلية لفصل وجمع المواد بسهولة وكفاءة ، مثل الحمض النووي الخالي من الخلايا والخلايا السرطانية المنتشرة ، من الدم الكامل.

الملخص

في الآونة الأخيرة ، تم استخدام الخزعات السائلة لتشخيص الأمراض المختلفة ، بما في ذلك السرطان. تحتوي سوائل الجسم على العديد من المواد ، بما في ذلك الخلايا والبروتينات والأحماض النووية الناشئة من الأنسجة الطبيعية ، ولكن بعض هذه المواد تنشأ أيضا من المنطقة المريضة. يلعب فحص وتحليل هذه المواد في سوائل الجسم دورا محوريا في تشخيص الأمراض المختلفة. لذلك ، من المهم فصل المواد المطلوبة بدقة ، ويتم تطوير العديد من التقنيات لاستخدامها لهذا الغرض.

لقد قمنا بتطوير نوع مختبر على قرص من الأجهزة والنظام الأساسي المسمى CD-PRIME. هذا الجهاز آلي وله نتائج جيدة لتلوث العينات واستقرار العينة. علاوة على ذلك ، فهي تتمتع بمزايا عائد الاستحواذ الجيد ، ووقت التشغيل القصير ، وقابلية التكاثر العالية. بالإضافة إلى ذلك ، اعتمادا على نوع القرص المراد تركيبه ، يمكن فصل البلازما التي تحتوي على الحمض النووي الخالي من الخلايا أو الخلايا السرطانية المنتشرة أو خلايا الدم الطرفية أحادية النواة أو المعاطف المفرغة. وبالتالي ، يمكن الحصول على مجموعة متنوعة من المواد الموجودة في سوائل الجسم لمجموعة متنوعة من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك دراسة omics.

المقدمة

يعد الكشف المبكر والدقيق عن الأمراض المختلفة ، بما في ذلك السرطان ، أهم عامل في وضع استراتيجية العلاج1،2،3،4. على وجه الخصوص ، يرتبط الكشف المبكر عن السرطان ارتباطا وثيقا بزيادة فرص البقاء على قيد الحياة للمريض5،6،7،8. في الآونة الأخيرة ، كانت الخزعات السائلة في دائرة الضوء للكشف المبكر عن السرطان. تخضع الأورام الصلبة لتكوين الأوعية الدموية وتطلق مواد مختلفة في الدم. على وجه الخصوص ، تم العثور على الحمض النووي المتداول (ctDNAs) ، والحمض النووي الريبي المتداول (ctRNAs) ، والبروتينات ، والحويصلات مثل exosomes ، والخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) في دم مرضى السرطان 2,9. على الرغم من وجود اختلافات في كمية هذه المواد ، إلا أنها تلاحظ باستمرار ليس فقط في المراحل المبكرة ولكن أيضا في المراحل اللاحقة 6,10. ومع ذلك ، فإن هذه الفروق الفردية عالية جدا. على سبيل المثال ، كمية الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) التي تحتوي على ctDNA أقل من 1,000 نانوغرام ، وعدد CTCs أقل من 100 في 10 مل من الدم الكامل من مرضى السرطان11،12،13. وصفت العديد من الدراسات السرطان باستخدام هذه المواد الموجودة بكميات أقل (أي cfDNA و ctDNA و CTCs). للحصول على نتائج دقيقة ، من المهم فصل كميات صغيرة من المواد بدقة عالية النقاء13,14. تستخدم طرق الطرد المركزي التقليدية بشكل شائع ، ولكن يصعب التعامل معها ولها نقاء منخفض اعتمادا على مهارة المستخدم. منذ اكتشاف CTCs ، تم تطوير العديد من تقنيات الفصل ، مثل الطرد المركزي أو فصل درجة الكثافة ، والمناعة ، وطرق الموائع الدقيقة. تم تطوير العديد من تقنيات الاحتواء منذ اكتشاف CTCs. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هذه التقنيات محدودة عندما يكون من الضروري عزل الخلايا عن الرقائق والأغشية المختلفة المستخدمة لعزلها15. أيضا ، تتطلب طرق وضع العلامات معدات مثل FACS ، وهناك حدود لعملية المصب بسبب تلوث العلامات.

في الآونة الأخيرة ، زاد استخدام الخزعات السائلة ، وتجري دراسات مختلفة للكشف المبكر عن السرطان. على الرغم من أن هذه الطريقة بسيطة ، إلا أنه لا تزال هناك صعوبات في التحليل النهائي ، وتحاول دراسات مختلفة التغلب على هذه الصعوبات16,17. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب العديد من المواقع ، بما في ذلك المستشفيات ، طرقا آلية وقابلة للتكرار وعالية النقاء ملائمة للاستخدام. هنا ، قمنا بتطوير مختبر على قرص للفصل الآلي للمواد من عينات الدم بعد خزعة سائلة. تعتمد هذه الأجهزة على مبدأ الطرد المركزي ، الموائع الدقيقة ، والتقاط الخلايا بحجم المسام. هناك ثلاثة أنواع من الأقراص: يمكن ل LBx-1 الحصول على البلازما ومعطف بافي ، بينما يمكن ل LBx-2 الحصول على البلازما و PBMC من الدم الكامل بحجم أقل من 10 مل ؛ يمكن ل FAST-auto أيضا الحصول على CTCs باستخدام غشاء قابل للإزالة من القرص. يمكن استخدام ما يصل إلى أربعة من كل قرص في تشغيل واحد. قبل كل شيء ، تتمثل ميزة هذا الجهاز والطريقة في أنه يمكنه الحصول على مجموعة متنوعة من المواد المشتقة من السرطان من نفس العينة باستخدام كمية صغيرة من الدم. هذا يعني أن دم المريض يحتاج إلى سحب مرة واحدة فقط. بالإضافة إلى ذلك ، لديها ميزة استبعاد الأخطاء بسبب الاختلافات في فترة أخذ عينات الدم. هذه المنصة سهلة الاستخدام وتوفر نتائج دقيقة للخزعات السائلة والتطبيقات النهائية. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم استخدام الجهاز والخرطوشة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على جميع عينات الدم الكاملة من مرضى سرطان الرئة. يتم إجراء البحث والتحليل في Clinomics من قبل معهد أبحاث جينوم السرطان ، وتقود موافقة الحكومة على أبحاث IRB لجنة المراجعة المؤسسية لمركز أسان الطبي (IRB NO. 2021-0802) مع رقم IRB المسجل للبحث في Clinomics.

1. إعداد عينة

  1. اجمع 9 مل من الدم الكامل في أنبوب جمع الدم المستقر EDTA أو cfDNA.
  2. امزج جيدا عن طريق قلب الأنبوب لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات.
  3. قم بتخزين العينات في درجة حرارة الغرفة (RT ؛ للتخزين قصير الأجل) أو 4 درجات مئوية (للتخزين طويل الأجل). لا تجمد وتذوب.

2. إعداد الجهاز

  1. اضغط على مفتاح الطاقة لتشغيل الجهاز.
    ملاحظة: تظهر شاشة تحميل على لوحة اللمس، ويتم تهيئة الجهاز. أبق يديك بعيدا عن الجهاز أثناء التهيئة. تظهر شاشة اختيار الخرطوشة بعد اكتمال تهيئة الجهاز.
  2. حدد وضع العينة المراد استخدامه. قم بتغيير عدد العينات بالضغط على السهم.

3. تشغيل الجهاز وجمع العينات

  1. تحميل خرطوشة LBx-1
    1. حدد نوع الخرطوشة على لوحة شاشة اللمس الخاصة بالجهاز. قم بتغيير عدد العينات بالضغط على زر السهم.
    2. افتح باب الجهاز وأدخل جميع الخراطيش المراد استخدامها بترتيب الرقم الموجود على حامل الخرطوشة. تأكد من إدخال الخرطوشة وحامل الخرطوشة بشكل صحيح. إذا لم يتم إدخال الخرطوشة بشكل صحيح ، فقد يتسبب ذلك في تلف كبير للأداة.
    3. للحصول على إجمالي أربع خراطيش ، ضع الخرطوشة الوهمية في المساحة الفارغة لحامل الخرطوشة.
    4. استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها.
    5. أغلق الباب واضغط على زر RUN على شاشة لوحة اللمس. تغلق الأداة الصمامات الموجودة على الخراطيش ، والتي تستغرق حوالي 30 ثانية.
    6. اتبع الرسالة لفتح الباب وإزالة عجلة الدعم وإزالة الخرطوشة المغلقة بالصمام من حامل الخرطوشة.
    7. ضع الخرطوشة على الطاولة واستعد لحقن عينة الدم بأكملها. ماصة بحد أقصى 10 مل من عينة الدم الكاملة باستخدام ماصة مصلية.
      تنبيه: مخاطر التعامل مع الدم. خلال الإجراء الكامل للتعامل مع عينات الدم والكواشف ، من المهم ارتداء معطف المختبر والقفازات المختبرية. يجب دراسة MSDS المقدمة بدقة من قبل عمال المختبر.
    8. أدخل طرف الماصة في عمق مدخل عينة الخرطوشة وحقن عينة الدم بأكملها ببطء.
      ملاحظة عند استخدام أكثر من أو يساوي 9 مل من عينة الدم الكاملة ، لا يلزم إضافة محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). عند استخدام أقل من 9 مل من عينة الدم الكاملة ، أضف PBS لجعل الحجم الإجمالي 9 مل. على سبيل المثال ، عند استخدام 7.2 مل من الدم الكامل ، يرجى إضافة 1.8 مل من PBS إلى مدخل العينة. يمكن استخدام ماصة مصلية أو طرف ماصة لحقن الدم الكامل و PBS. عند استخدام أقل من 8 مل من عينة الدم الكاملة ، قد لا يتم استرداد معطف بافي حتى بإضافة 1 مل من PBS. لإعداد gDNA ، استخدم 200 ميكرولتر من الدم الكامل ، والذي تم فصله قبل هذه الخطوة.
    9. أدخل الخراطيش المراد استخدامها بترتيب الرقم الموجود على حامل الخرطوشة. استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها. أغلق الباب، ثم اضغط على الزر موافق ( OK ) .
      ملاحظة: يتم فصل البلازما ومعطف بافي عن الدم الكامل تلقائيا ، الأمر الذي يستغرق حوالي 30 دقيقة.
      تنبيه خطر أثناء العملية. يمكن أن يؤدي فتح الباب أو لمس الجهاز أثناء عمليات الدوران عالية السرعة إلى حدوث إصابات خطيرة. هناك أيضا خطر الإصابة بسبب التحميل غير المتماثل للدوار. في حالة حدوث اهتزازات وضوضاء غير عادية عند بدء الجهاز في إثراء الخلايا المساعدة أو وضع الخبير ، فقد يكون وضع الخرطوشة غير متماثل. اضغط على الفور على مفتاح التشغيل لإيقاف الخرطوشة وتثبيتها بشكل صحيح.
    10. ابحث عن الرسالة التي تظهر على الشاشة مصحوبة بصوت إنذار ، والذي يظهر عند اكتمال فصل البلازما ومعطف بافي.
    11. أوقف المنبه عن طريق فتح الباب أو الضغط على زر STOP . افتح الباب ، وأزل الخرطوشة ، وضعها على الطاولة.
    12. استرجع 3 مل من البلازما من مخرج البلازما باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل. استرجع طبقة بافي 3 مل من مخرج المعطف بافي باستخدام طرف ماصة 1 مل.
  2. تحميل خرطوشة LBx-2
    1. حدد اسم الخرطوشة على لوحة شاشة اللمس الخاصة بالجهاز. قم بتغيير عدد العينات بالضغط على زر السهم.
    2. افتح الباب وأدخل الخراطيش المراد استخدامها بترتيب الرقم الموجود على حامل الخرطوشة.
    3. للحصول على إجمالي أربع خراطيش ، ضع الخرطوشة الوهمية في المساحة الفارغة لحامل الخرطوشة.
    4. استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها. تأكد من إدخال الخرطوشة بشكل صحيح في حامل الخرطوشة. إذا لم يتم إدخال الخرطوشة بشكل صحيح ، فقد يتسبب ذلك في تلف كبير للأداة.
    5. أغلق الباب واضغط على زر RUN على شاشة لوحة اللمس. تغلق الأداة الصمامات الموجودة على الخرطوشة ، والتي تستغرق حوالي 30 ثانية.
    6. اتبع الرسالة لفتح الباب وإزالة عجلة الدعم وإزالة الخرطوشة المغلقة بالصمام من حامل الخرطوشة ووضعها على الطاولة.
    7. ضع الخرطوشة على الطاولة واستعد لحقن محلول تدرج الكثافة وعينة الدم بأكملها. تحقق من حجم محلول تدرج الكثافة و PBS المراد حقنه اعتمادا على حجم عينة الدم الكاملة (الجدول التكميلي 1).
    8. ماصة محلول تدرج الكثافة باستخدام ماصة مصلية. أدخل طرف الماصة بعمق في مدخل الخرطوشة وقم بحقن محلول تدرج الكثافة ببطء.
    9. بعد حقن محلول تدرج الكثافة ، ماصة عينة الدم بأكملها باستخدام ماصة مصلية. أدخل طرف الماصة في عمق مدخل عينة الخرطوشة وحقن عينة الدم بأكملها ببطء.
      ملاحظة: عند استخدام أقل من 9 مل من عينة الدم الكاملة ، أضف برنامج تلفزيوني بالرجوع إلى هذا الجدول (الجدول التكميلي 1).
    10. أدخل الخراطيش المراد استخدامها بالترتيب وفقا للرقم الموجود على حامل الخرطوشة. استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها. أغلق الباب، ثم اضغط على الزر موافق ( OK ) .
    11. يتم فصل البلازما و PBMC عن الدم الكامل تلقائيا ، الأمر الذي يستغرق حوالي 30 دقيقة. ابحث عن الرسالة التي تظهر مصحوبة بصوت إنذار ، عند اكتمال فصل البلازما و PBMC.
    12. أوقف المنبه عن طريق فتح الباب أو الضغط على زر STOP . افتح الباب ، وأزل الخرطوشة ، وضعها على الطاولة.
    13. استرجع 3 مل من البلازما من مخرج البلازما باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل. استرجع 3 مل من PBMC من منفذ PBMC باستخدام طرف ماصة 1 مل.
  3. تحميل خرطوشة FAST-auto
    1. حدد الخرطوشة على لوحة الشاشة التي تعمل باللمس الخاصة بالجهاز. قم بتغيير عدد العينات بالضغط على زر السهم.
    2. افتح الباب وأدخل الخراطيش المراد استخدامها بترتيب الرقم الموجود على حامل الخرطوشة. للحصول على إجمالي أربع خراطيش ، ضع الخرطوشة الوهمية في المساحة الفارغة لحامل الخرطوشة.
    3. استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها.
    4. أغلق الباب واضغط على زر RUN على شاشة لوحة اللمس. تغلق الأداة الصمامات الموجودة على الخرطوشة ، والتي تستغرق حوالي 30 ثانية.
    5. اتبع الرسالة لفتح الباب وإزالة عجلة الدعم وإزالة الخرطوشة المغلقة بالصمام من حامل الخرطوشة.
    6. ضع الخرطوشة على الطاولة واستعد لحقن محلول PBS وعينة الدم الكاملة. ماصة 6 مل من محلول PBS باستخدام ماصة مصلية. أدخل طرف الماصة في عمق مدخل PBS للخرطوشة وحقن ببطء 6 مل من محلول PBS.
    7. بعد حقن محلول PBS ، ماصة 3 مل من الدم الكامل أو عينة PBMC التي تم الحصول عليها من LBx-2 باستخدام ماصة مصلية ، والتي تم شطفها مسبقا بنسبة 1٪ BSA لمنع الالتصاق بالبقايا. أدخل طرف الماصة في عمق مدخل عينة الخرطوشة وحقن عينة الدم بأكملها ببطء.
    8. أدخل الخراطيش المراد استخدامها بترتيب الرقم الموجود على حامل الخرطوشة. استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها. أغلق الباب، ثم اضغط على الزر موافق ( OK ) .
    9. يتم إثراء CTCs من الدم الكامل تلقائيا ، الأمر الذي يستغرق حوالي 15 دقيقة. ابحث عن رسالة تظهر مصحوبة بصوت إنذار عند اكتمال إثراء CTCs. أوقف المنبه عن طريق فتح الباب أو الضغط على زر STOP .
    10. افتح الباب ، وأزل الخرطوشة ، وضعها على الطاولة. أدخل مزيل اللوحة الخلفية (BPR) في الثقوب الأربعة الموجودة في مقدمة الخرطوشة. اضغط على الجناح الأزرق الداكن بإبهام كلتا يديه ، ثم اضغط على الجسم الأزرق الفاتح حتى ينقر.
    11. قم بإزالة جسم الخرطوشة بعناية عن طريق رفعه لأعلى. التقط غشاء المرشح برفق شديد من الحافة باستخدام ملقط. يرجى التأكد من استخدام الحافة الخارجية (جزء الحافة العريضة 1 مم) لغشاء المرشح لقرص غشاء المرشح وتثبيته.
    12. ضع بعناية غشاء المرشح (الذي توجد عليه CTCs المخصبة) في أنبوب سعة 1.5 مل لتحضير الحمض النووي. إذا لزم الأمر ، قم باستعادة الدم المصفى إلى مخرج الدم باستخدام طرف ماصة 1 مل.

4. صيانة النظام

  1. التحضير لتنظيف وتطهير الأداة
    1. قم بتنظيف جميع الأسطح التي يمكن الوصول إليها للأداة والملحقات مرة واحدة في الأسبوع باستخدام الإيثانول والأنسجة المجففة ، وكذلك على الفور عند تلوثها.
    2. نظف الوعاء وعمود الدوار بانتظام باستخدام الكحول (الإيثانول والأيزوبروبانول) أو المطهرات الكحولية.
  2. تنظيف وتطهير الأداة
    ملاحظة: للاطلاع على استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل عام والملاحظات الأخرى الموجودة على الجهاز، راجع الجدول التكميلي 2.
    1. قم بإيقاف تشغيل الجهاز باستخدام مفتاح الطاقة الرئيسي. افصل قابس الطاقة عن مصدر الطاقة.
    2. افتح الباب وقم بتنظيف وتطهير جميع الأسطح التي يمكن الوصول إليها للأداة ، بما في ذلك كابل الطاقة ، باستخدام قطعة قماش مبللة وعوامل التنظيف الموصى بها.
    3. افحص عمود الدوار بحثا عن التلف. افحص الأداة بحثا عن التآكل والتلف.
    4. قم بتوصيل الجهاز بمصدر الطاقة فقط إذا كان جافا تماما من الداخل والخارج.
  3. افصل قابس الطاقة الرئيسي وقم بإزالة حامل المصاهر. يقع حامل المصهر فوق مقبس الطاقة. استبدل المصهر المستخدم بآخر احتياطي من الحاوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الهدف من هذه التقنية هو عزل المواد المرتبطة بالسرطان بسهولة وبشكل تلقائي من الدم الكامل. على وجه الخصوص ، يمكن لأي شخص استخدام هذه التقنية في جميع مجالات البحث والتحليل المناسبة. يعد الفصل المتزامن والقابل للتكرار لمواد متعددة في عينة دم واحدة أمرا مهما في الخزعات السائلة. تستخدم أقراص LBx-1 و LBx-2 لعزل البلازما ومعطف بافي أو PBMC من الدم الكامل. يوضح الشكل 1 المواد المفصولة بواسطة تطبيق هذا الجهاز. أولا ، تم الحصول على البلازما من 10 مل من الدم باستخدام LBx-1 أو تم الحصول على PBMCs باستخدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعتمد كمية وتركيز cfDNA و CTC على الفرد والمرحلة ونوع السرطان. كما يعتمد على حالة المريض2،4،5،10،20. على وجه الخصوص ، في المراحل المبكرة أو السرطانية ، تكون تركيزات المواد المرتبطة بالسرطان منخفضة للغاية ، لذلك هناك احتمال كبير أنه لا يمكن اكتشافها. ومع ذلك ، فإن الاكتشاف المبكر له تأثير إيجابي للغاية على بقاء المريض ووضع استراتيجية العلاج. نظرا لأن cfDNA و CT...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل.

شكر وتقدير

تم دعم هذه المخطوطة جزئيا من قبل الصندوق الكوري لتطوير الأجهزة الطبية (KMDF، المنحة رقم. RS-2020-KD000019) والمعهد الكوري لتطوير الصناعة الصحية (KHIDI، رقم المنحة. HI19C0521020020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1٪ BSA (ألبومين مصل الأبقار)Sigma-AldrichA3059
1.5 مل أنبوب الطرد المركزيالدقيق AxygenMCT-150-C-S
15 مل أنبوب مخروطيSPL50015
4150 نظام TapeStationAgilentG2992AAشاشة DNA خال من الخلايا (Agilent ، 5067-5630) ، عازلة عينة الحمض النووي الخالية من الخلايا (Agilent ، 5067-5633)
Apostle MiniMax عالية الكفاءة خالية من الخلايا الحمض النووي العزل  ApostleA17622-2505 مل × 50 نسخة إعدادية
BD Vacutainer أنابيب جمع الدمBD367525EDTA أنبوب جمع الدم (10 مل)
BioViewCCBSClinomicsBioView نظام Bioview المخصص. معدات التخصيص القائمة على المجهر Allegro Plus
CD45 الجسم المضاد أحادي النسيلة (HI30) ، PE-Alexa Fluor 610InvitrogenMHCD4522
FAST خرطوشة السياراتClinomicsCLX-M3001
LBx-1 خرطوشةClinomicsCLX-M4101
LBx-2 خرطوشةClinomicsCLX-M4201
OPR-2000 أداةClinomicsCLX-I2001
غطاء زجاجيMarienfeld SuperiorHSU-0101040
DynaMag 2 حامل مغناطيسيحراري فيشر Scientific12321D
Ficoll Paque SolutionGE الرعاية الصحية17-1440-03حل التدرج الكثافة
طرف المرشح ، 10 & Lباستخدام أطراف الماصات AxygenAX-TF-10المزودة بحواجز الهباء الجوي للمساعدة في منع التلوث المتبادل.
طرف الفلتر, 200 & Lباستخدام أطراف الماصات AxygenAX-TF-200المزودة بحواجز الهباء الجوي للمساعدة في منع التلوث المتبادل.
طرف الفلتر, 100 & ميكرو; Lالماصات AxygenAX-TF-100المزودة بحواجز الهباء الجوي للمساعدة في منع التلوث المتبادل.
طرف المرشح ، 1000 & الميكرو ؛ Lباستخدام أطراف الماصات AxygenAX-TF-1000المزودة بحواجز الهباء الجوي للمساعدة في منع التلوث المتبادل.
FITC مضاد للإنسان CD326 (EpCAM) الأجسام المضادةBioLegend324204
FITC الفأر المضاد للإنسان السيتوكيراتينBD Biosciences347653
محلول الفورمالديهايد (35 بالوزن ٪ في H2O)Sigma Aldrich433284
Kimtech Science WipersYuhan-Kimberly41117
قفاز اللاتكسMicroflex63-754
رف فصل الخرزة المغناطيسيةV & P ScientificVP 772F2M-2
السحب اليدوي  (0.5-10 وميكرو ؛ L)Eppendorf3120000020
السحب اليدوي   ؛ (2-20 & micro; ل)Eppendorf3120000038
السحب اليدوي   ؛ (10-100 وميكرو ؛ ل)Eppendorf3120000046
السحب اليدوي   ؛ (20-200 & مايكرو; L)Eppendorf3120000054
السحب اليدوي   ؛ (100-1000 وميكرو ؛ L)Eppendorf3120000062
تركيب الوسط مع DAPI & nbsp ؛ - مائي ، Fluoroshieldabcamab104139
Normal Human IgG ControlR & D Systems1-001-A
OLYMPUS BX-UCBOlympus9217316
Cytokeratin الجسم المضاد أحادي النسيلة (AE1 / AE3) ، Alexa Fluor 488Invitrogen53-9003-82
PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)Corning21-040CVC
Portable PipetAid Drummond4-000-201
زجاج منزلقMarienfeld متفوقةHSU-1000612
StainTray تلطيخ مربعSimportM920
ماصة مصلية معقمة (10 مل)SPL91010
Triton & nbsp ؛ حل X-100Sigma Aldrich93443
TWEEN  20سيجما ألدريتشP7949
الدمالمخزن عند 4-8 درجة ؛ C عن طريق الجمع في EDTA أو أنبوب مستقر cfDNA : إذا كان الدم الكامل غير كاف في 9 مل ، أضف PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) بقدر الضرورة.
X-Cite 120Q (مصباح إضاءة الفلورة)Excelitas010-00157
شريط يوصى يوصى يوصى باستخدام أطراف يوصى Pan الكامل

المراجع

  1. Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21(2018).
  2. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
  3. Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
  4. Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
  5. Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36(2017).
  6. Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
  7. Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
  8. Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63(2016).
  9. Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
  10. Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24(2014).
  11. Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455(2021).
  12. Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
  13. Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
  14. Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
  15. Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
  16. Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013(2016).
  17. Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505(2016).
  18. Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
  19. Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
  20. Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
  21. Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1(2018).
  22. Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
  23. Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
  24. Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
  25. Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
  26. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8(2019).
  28. Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
  29. Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553(2019).
  30. Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة