يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تضخيم إشارة التيراميد للتلطيخ المناعي للفسفرة المعتمدة على ZBP1 ل RIPK3 و MLKL بعد عدوى HSV-1 في الخلايا البشرية

2.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64332

⸱

أكتوبر 20, 2022

 ,  ,  , 
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

في هذه المقالة

ملخص

يتيح تضخيم إشارة التيراميد أثناء تلطيخ الفلورسنت المناعي الكشف الحساس عن RIPK3 و MLKL المفسفر أثناء التنخر الناجم عن ZBP1 بعد الإصابة بفيروس HSV-1.

الملخص

يعد كيناز بروتين سيرين / ثريونين المتفاعل مع مستقبلات الكيناز 3 (RIPK3) ومجاله المختلط المختلط (MLKL) من المنظمين المهمين لمرض التنخر ، وهو شكل التهابي من موت الخلايا له وظائف مهمة مضادة للفيروسات. الفسفرة الذاتية ل RIPK3 تحفز الفسفرة وتفعيل بروتين الجلاد المكون للمسام من necroptosis MLKL. يؤدي الاتجار وقلة الغلومير من MLKL المفسفرة في غشاء الخلية إلى تحلل الخلية ، وهو سمة من سمات موت الخلايا النخرية. يتم تنشيط مستشعر الحمض النووي ZBP1 عن طريق الارتباط بالحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل على شكل Z (Z-RNA) بعد الإصابة بفيروسات الحمض النووي الريبي والحمض النووي. يقيد تنشيط ZBP1 الإصابة بالفيروس عن طريق إحداث موت الخلايا المنظم ، بما في ذلك التنخر ، للخلايا المضيفة المصابة. يسمح الفحص المجهري المناعي بتصور خطوات إشارات مختلفة في اتجاه مجرى التنخر بوساطة ZBP1 على أساس كل خلية. ومع ذلك ، فإن حساسية الفحص المجهري الفلوري القياسي ، باستخدام الأجسام المضادة الحالية المتاحة تجاريا ضد RIPK3 و MLKL البشري ، تمنع التصوير القابل للتكرار لهذه العلامات. هنا ، نصف إجراء تلطيخ محسن لسيرين (S) المفسفر RIPK3 (S227) و MLKL (S358) في خلايا HT-29 البشرية المصابة بفيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1). يسمح إدراج خطوة تضخيم إشارة التيراميد (TSA) في بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي بالكشف المحدد عن RIPK3 المفسفر S227. علاوة على ذلك ، يزيد TSA بشكل كبير من حساسية الكشف عن MLKL المفسفر S358. معا ، تتيح هذه الطريقة تصور هذين الحدثين الحرجين للإشارات أثناء تحريض التنخر الناجم عن ZBP1.

المقدمة

تفاعل مستقبلات سيرين / ثريونين بروتين كيناز 3 (RIPK3) ومجال كيناز السلالة المختلطة (MLKL) هي منظمات مركزية لموت الخلايا النخرية 1,2. Necroptosis هو شكل من أشكال lytic والتهابات من موت الخلايا المنظم تشارك في المناعة المضادة للفيروسات والتهاب ذاتي. يؤدي تنخر الخلايا المصابة بالفيروس إلى إيقاف تكاثر الفيروس على الفور. يؤدي تحلل الخلايا بعد تحريض التنخر أيضا إلى إطلاق أنماط جزيئية مرتبطة بالضرر ، والتي تحفز المناعة المضادة للفيروسات 3,4. يبدأ Necroptosis من خلال تنشيط RIPK3 بعد تفاعلات تفاعل RIP المتجانسة (RHIM) بوساطة واحد من ثلاثة جزيئات تنشيط المنبع: RIPK1 (عند مشاركة مستقبلات TNF 1 [TNFR1]) ، β الإنترفيرون الذي يحتوي على محول يحتوي على مجال TIR (TRIF ؛ عند اشتباك المستقبلات الشبيهة بالرقم 3 و 4) ، أو مستشعر الحمض النووي المضاد للفيروسات Z-DNA بروتين ملزم 1 (ZBP1) 1,2 . تستمر إشارات Necroptosis من خلال سلسلة من أحداث الفسفرة بدءا من الفسفرة الذاتية ل RIPK3. تعد الفسفرة الذاتية ل RIPK3 البشري في سيرين (S) 227 داخل مجال كيناز الخاص بها شرطا أساسيا للنخر من خلال تمكين التفاعل مع MLKL وتستخدم بشكل شائع كعلامة كيميائية حيوية لتنشيط RIPK3 البشري وموت الخلايا النخرية 1,5. بمجرد تنشيطه ، يقوم RIPK3 بفسفرة حلقة تنشيط MLKL عند ثريونين (T) 357 و S3581. يؤدي هذا إلى تغيير في تشكيل MLKL ، مما يؤدي إلى تعرض مجال حزمة الحلزون الأربعة N-terminal. ثم يقوم MLKL بقليل القلة والاتجار إلى غشاء الخلية حيث يشكل مسام من خلال إدخال الحزم الحلزونية الأربعة المكشوفة في طبقة الدهون المزدوجة ، مما يؤدي في النهاية إلى موت الخلية 2,6.

ZBP1 هو مستشعر حمض نووي مضاد للفيروسات يتعرف على الأحماض النووية اليسرى على شكل Z بما في ذلك الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في تشكيل Z (Z-RNA). يحدث ارتباط Z-RNA عبر نطاقين Zα متمركزين في النهاية N ل ZBP1. يعتقد أن Z-RNA المتراكم أثناء الإصابة بفيروس الحمض النووي الريبي والحمض النووي يشرك مباشرة ZBP1 7,8. يقوم ZBP1 المنشط بتجنيد RIPK3 من خلال RHIMs المركزية الخاصة به ويحفز موت الخلايا المنظم ، بما في ذلك التنخر 9,10. اعتمدت الفيروسات العديد من آليات الهروب لمواجهة تنخر الخلية المضيفة11 الناجم عن ZBP1. على سبيل المثال ، تحتوي الوحدة الفرعية 1 لاختزال الريبونوكليوتيد 1 لفيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1) ، والمعروفة باسم ICP6 والمشفرة بواسطة UL39 ، على RHIM في نهايتها N التي تتداخل مع تنشيط RIPK3 بوساطة ZBP1 في الخلايا البشرية12،13،14،15. لا يقيد ZBP1 تكاثر الفيروس فحسب ، بل أظهرت دراسات الفئران أن تنشيط ZBP1 يسبب أمراضا التهابية ويحفز مناعة السرطان16،17،18،19،20،21. وبالتالي ، فإن البروتوكولات التي تكتشف أحداث الإشارات التي تحدث أثناء التنخر الناجم عن ZBP1 في الخلايا البشرية هي قيمة لتقييم دور ZBP1 في هذه العمليات.

تم تطوير تضخيم إشارة التيراميد (TSA) ، الذي يشار إليه أيضا باسم ترسيب المراسل المحفز (CARD) ، لتحسين حد الكشف ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في المقايسات المناعية القائمة على الأجسام المضادة. أثناء TSA ، يمكن استخدام أي جسم مضاد أولي للكشف عن المستضد محل الاهتمام. يحفز بيروكسيديز الفجل (HRP) ، إلى جانب جسم مضاد ثانوي ، التراكم المحلي لجذور التيراميد البيوتينيلات في وجود بيروكسيد الهيدروجين. ثم تتفاعل جذور البيوتين تيراميد المنشطة هذه مع بقايا التيروزين القريبة لتشكيل روابط تساهمية. تشمل ركائز التيراميد-البيوتين المحتملة المستضد نفسه ، والأجسام المضادة الأولية والثانوية ، والبروتينات المجاورة. وبالتالي ، في حين أن TSA يحسن بشكل كبير من حساسية الفحص ، يتم فقد بعض الدقة المكانية. في الخطوة الأخيرة ، يتم الكشف عن جزيئات البيوتين باستخدام الستربتافيدين المسمى بالفلورسنت. يودع تفاعل HRP العديد من جزيئات تيراميد-بيوتين على المستضد محل الاهتمام أو بالقرب منه. هذا يزيد بشكل كبير من عدد مواقع ربط الستربتافيدين فلوروكروم ، وبالتالي تضخيم حساسية الفحص بشكل كبير (الشكل 1). بدلا من ذلك ، يمكن أن يقترن التيراميد مباشرة بالفلوروكروم ، مما يلغي الحاجة إلى الفلوروفورات المقترنة بالستربتافيدين. كانت الكيمياء الهيستولوجية المناعية للبروتين والتهجين في الموقع DNA / RNA من بين الطرق الأولى التي تم من خلالها استخدام TSA لتحسين شدة الإشارة22,23. في الآونة الأخيرة ، تم دمج TSA مع قياس التدفق الخلوي داخل الخلايا24 وقياس الطيف الكتلي25.

هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن سيرين 227 RIPK3 البشري المفسفر (p-RIPK3 [S227]) و MLKL البشري المفسفر (p-MLKL [S358]) عند تنشيط ZBP1 بواسطة عدوى HSV-1 باستخدام الفحص المجهري المناعي. نحن نستخدم خط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري HT-29 الحساس للنخر والذي تم تحويله للتعبير بثبات عن ZBP1 البشري. أصيبت هذه الخلايا بسلالة HSV-1 تعبر عن بروتين ICP6 الطافر (HSV-1 ICP6mutRHIM) حيث تم استبدال أربعة أحماض أمينية أساسية داخل RHIM الفيروسي (VQCG) بألانين (AAAA) ، مما يجعل ICP6 غير قادر على منع التنخر بوساطة ZBP113،14،15. للتغلب على مشكلة انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء للأجسام المضادة المتاحة تجاريا حاليا والموجهة ضد p-RIPK3 و p-MLKL في التلوين المناعي26 ، نقوم بإجراء خطوة تضخيم إشارة التيراميد (TSA) (الشكل 1) ، مما يؤدي إلى الكشف القوي عن p-RIPK3 البشري (S227) ويحسن حساسية الكشف عن p-MLKL البشري (S358) بترتيب من حيث الحجم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد تيراميد البيوتينيل

  1. تحضير تيراميد البيوتينيل بدءا من البيوتين تيراميد. لعمل محلول مخزون 10 مللي متر ، قم بإذابة 3.6 مجم من البيوتين تيراميد في 1 مل من DMSO. قم بتخزين المنتج المذاب في حصص عند -20 درجة مئوية للحفاظ على الجودة.

2. الحفاظ على خلايا HT-29 في الثقافة

ملاحظة: تم إنشاء HT-29 المعرب عن ZBP1 عن طريق النقل باستخدام متجه27 بترميز ZBP1 البشري.

  1. احتفظ بخلايا HT-29 المعبرة عن ZBP1 في وسط 5A من McCoy مع L-glutamine و sodium-pyruvate و 10٪ مصل بقري جنيني (يشار إليه من الآن فصاعدا باسم الوسط الكامل) واحتفظ به في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. من الناحية المثالية ، استخدم خلايا ذات رقم مرور منخفض (أقل من 10). اترك الخلايا تتعافى لمدة 5 أيام على الأقل بعد دورة الذوبان قبل بدء التجربة.
  2. لفصل الخلايا عن قارورة المزرعة ، قم بإزالة الوسط واغسل الخلايا ب 5 مل من PBS (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية). بعد ذلك ، أضف الكمية المناسبة من التربسين / EDTA (0.05٪ تربسين و 0.032٪ EDTA ، على التوالي ، مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) إلى الخلايا (2 مل لدورق T75 ، 3 مل لدورق T175).
  3. احتضان الخلايا باستخدام التربسين / EDTA لمدة تصل إلى 10 دقائق في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، انقر فوق القارورة وتحقق بصريا مما إذا كانت الخلايا منفصلة عن القارورة باستخدام مجهر مع تكبير موضوعي 4x-20x.
  4. إذا لم يتم فصل الخلايا بالكامل ، قم بحضينها لمدة 5 دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية. عند فصل الخلايا، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 6 مل من الوسط الكامل إلى القارورة.
  5. اجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 15 مل. عد الخلايا باستخدام صبغة زرقاء تريبان لتقييم الجدوى ؛ يوصى بتخفيف 1: 5. تابع التجربة فقط إذا تجاوزت صلاحية الخلايا 90٪.

3. بدء التجربة والبذر وتحفيز الخلايا

  1. قم بزرع 90000 خلية معبرة عن ZBP1 HT-29 في وسط كامل في لوحة بئر بمساحة سطح 1 سم² تسمح بإجراء فحص مجهري متطور. استخدم حجما نهائيا يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر.
  2. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ضع في اعتبارك أن بعض الآبار الإضافية تحتاج إلى بذر لضوابط التلوين ، والتي يتم شرحها بمزيد من التفصيل في الخطوة 5.6.
  3. عندما تصل الخلايا إلى 70٪ -80٪ التقاء ، أضف حافزا محفزا للنخر إلى الخلايا. هنا ، أصيبت الخلايا ب HSV-1 ICP6mutRHIM (تعدد العدوى [MOI] من 5 ، والتي تعرف بأنها وحدات تشكيل البلاك (pfu) مقسومة على عدد الخلايا ؛ تم تحديد كمية pfu باستخدام مقايسة البلاك على خلايا Vero) لمدة 6 ساعات أو 8 ساعات أو 10 ساعات.
  4. كعنصر تحكم إيجابي في تحريض التنخر ، قم بتحفيز الخلايا لمدة 4 ساعات باستخدام كوكتيل يحفز التنخر يحتوي على 30 نانوغرام / مل TNF ، و 20 ميكرومتر من مثبط عموم الكاسباز zVAD-fmk ، و 5 ميكرومتر من SMAC محاكاة BV6.
  5. كعنصر تحكم سلبي في تلطيخ p-RIPK3 (S227) ، قم بتضمين GSK'840 (1 ميكرومتر) لمنع نشاط كيناز RIPK3 ومنع الفسفرة الذاتية ل S227. من الناحية المثالية ، أضف المانع في حالة غير معالجة وبعد تحفيز التنخر. يمكن إضافة المانع في وقت واحد مع العدوى الفيروسية.
  6. تحضير المحفزات في وسط كامل ، مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. استخدم حجما نهائيا يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر لجميع المحفزات.

4. إصلاح الخلايا

  1. قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من 1x PBS. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولتر من 4٪ PFA (متوازن بالفعل في درجة حرارة الغرفة) إلى الخلايا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم خلايا تنفصل بسهولة ، فيمكن تحسين تثبيت الخلايا على النحو التالي. قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط من البئر ، لذلك يبقى حجم 100 ميكرولتر على اللوحة. أضف 100 ميكرولتر من 4٪ PFA إلى الخلايا. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط / المثبت من الآبار واستبدله ب 150 ميكرولتر من 4٪ PFA. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة لضمان التثبيت الكامل للخلايا.
  2. بعد التثبيت ، قم بإزالة 4٪ PFA واغسل الخلايا 3x مع 200 ميكرولتر من 1x PBS. يمكن تخزين العينات في فائض (>200 ميكرولتر) من 1x PBS عند 4 درجات مئوية طوال الليل حتى مزيد من المعالجة.

5. النفاذية والتلوين الأولي

  1. قم بإزالة PBS وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية (0.5٪ Triton X-100 في PBS). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  2. قم بإزالة المخزن المؤقت للنفاذية ، وبعد ذلك ، اغسل الآبار ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان غرفة التصوير مع مخزن مؤقت للغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل (20-30 حركة هزازة في الدقيقة).
  3. لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة الأولية ، أضف 100 ميكرولتر من وسط الحجب واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. بدلا من ذلك ، يمكن استبدال خطوة الحظر هذه بالحظر بنسبة 3٪ BSA ، 0.1٪ Triton-X-100 في PBS لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. اغسل الآبار 3x مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان خطوات الغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.
  5. بعد إزالة المخزن المؤقت للغسيل ، أضف الأجسام المضادة الأولية إلى غرفة التصوير واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. استخدم حجما نهائيا يبلغ 100 ميكرولتر لتغطية البئر. أثناء الحضانة الليلية عند 4 درجات مئوية ، لا تضع غرفة التصوير على شاكر مختبر مائل.
    ملاحظة: يشترك Anti-p-MLKL (S358 ؛ التخفيف: 1: 200) ومضاد p-RIPK3 (S227 ؛ التخفيف: 1: 200) في الأرانب كنوع مضيف ، وبالتالي ، لا ينبغي دمجهما في بئر واحد. لمراقبة العدوى الفيروسية، اجمع جسما مضادا أوليا ضد بروتين فيروسي من اختيارك مع p-MLKL (S358) أو p-RIPK3 (S227). هنا ، أصيبت الخلايا بعدوى HSV-1 متبوعة بتلطيخ ICP0 (التخفيف: 1:50 ، الأنواع المضيفة: الفأر).
  6. ضع في اعتبارك ضوابط التلوين اللازمة في هذه المرحلة. قم دائما بتضمين حالة عدم وجود جسم مضاد أساسي لتصور الخلفية المحتملة لخطوة تضخيم TSA لتعيين عتبة التقنيع (انظر الخطوة 9).
    ملاحظة: في حالة وجود بروتوكول تلطيخ مشترك (على سبيل المثال ، الجمع بين p-MLKL [S358] أو p-RIPK3 [S227] مع جسم مضاد ضد بروتين فيروسي) ، استخدم البقع المفردة أيضا. يعد استخدام البقع المفردة أمرا مهما لتصحيح إشارة النزيف المحتملة في قنوات التصوير الأخرى.

6. تضخيم إشارة تيراميد (TSA)

  1. قم بإزالة مزيج الأجسام المضادة الأساسي واغسل الآبار 3x مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان خطوات الغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.
  2. قم بإزالة مخزن الغسيل المؤقت وأضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المسمى HRP للتعرف على أنواع الأجسام المضادة الأولية التي تحتاج إلى تضخيم. لتضخيم إشارة p-RIPK3 (S227) أو p-MLKL (S358) ، أضف 100 ميكرولتر من مضاد الأرنب HRP واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.
    ملاحظة: سيتم تضخيم p-MLKL (S358) أو p-RIPK3 (S227) فقط. سيتم تصور تلطيخ البروتين الفيروسي باستخدام طريقة تلطيخ غير مباشرة قياسية.
  3. بعد ذلك ، اغسل الآبار 3x ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان خطوات الغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.
  4. في الخطوات التالية ، أضف التيراميد البيوتينيل إلى اللوحة المجهرية. باستخدام مجموعة HRP المقترنة بالأجسام المضادة الثانوية ، سيؤدي التفاعل الأنزيمي إلى تكوين جذور تيراميد على مقربة من الهدف الأساسي (هنا ، p-MLKL [S358] أو p-RIPK3 [S227]).
  5. لتنشيط النشاط الأنزيمي ل HRP ، أضف ركيزة مؤكسدة مع التيراميد البيوتينيل. لتحقيق ذلك ، استكمل المخزن المؤقت TSA (0.1 M حمض البوريك [درجة الحموضة 8.5]) مع 0.03 M H 2 O2؛ على وجه التحديد ، خذ 5 مل من المخزن المؤقت TSA وأضف 5 ميكرولتر من 30٪ H 2O2.
  6. الآن ، قم بتخفيف البيوتين تيراميد في المخزن المؤقت TSA المكمل H 2 O2الذي يتراوح من 1: 1,000 إلى 1: 20,000.
    ملاحظة: يجب تحسين عامل التخفيف للبيوتين-تيراميد لكل دفعة.
  7. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل من الآبار وأضف البيوتين تيراميد المخفف إلى الآبار إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على شاكر مختبر مائل.
  8. بعد ذلك ، اغسل الآبار 3x مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان خطوات الغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.

7. الفلوروفورات

ملاحظة: نظرا لأن إشارة الجسم المضاد الأساسي يتم تحويلها إلى مجموعة البيوتين ، يتم تصور p-MLKL (S358) و p-RIPK3 (S227) باستخدام الستربتافيدين المقترن بالفلوروفور (الفلوروفور 568 ، التخفيف: 1: 500). بالإضافة إلى ذلك ، يتم تلطيخ النوى ب DAPI (5 ميكروغرام / مل). إذا تم تضمين بروتين فيروسي في بروتوكول التلطيخ ، فقم بتضمين جسم مضاد ثانوي مناسب يحمل علامة فلورسنت ضد الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي. في النتائج التمثيلية ، تم استخدام الماوس المضاد لبرنامج ICP0. كجسم مضاد ثانوي للماعز مضاد للفأر مقترن بالفلوروفور 633 (التخفيف: 1: 1,000).

  1. اصنع مزيج التلوين في محلول الغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS) يحتوي على الأجسام المضادة والبقع المذكورة أعلاه. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل ، وأضف 100 ميكرولتر من مزيج التلوين ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على شاكر مختبر مائل. حافظ على غرفة التصوير محمية من الضوء من هذه الخطوة فصاعدا.
  2. بعد ذلك ، اغسل الآبار 2x باستخدام محلول غسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان خطوات الغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.
  3. أخيرا ، اشطف الآبار 2x باستخدام 1x PBS. تخزين العينات في فائض (> 200 ميكرولتر) من 1x PBS حتى التصوير. بدلا من ذلك ، اغمر العينات في وسط التركيب للحفاظ على التلطيخ. غرفة التصوير جاهزة الآن للتصور على مجهر متحد البؤر.

8. التصوير باستخدام مجهر متحد البؤر

  1. قم بتشغيل المجهر متحد البؤر والليزر قبل 10 دقائق على الأقل من التصوير.
  2. استخدم هدف الانغماس للحساسية. يفضل استخدام التكبير الموضوعي 40x أو 63x. قبل التصوير ، قم بتنظيف أهداف الغمر باستخدام منظف العدسات باستخدام كرات قطنية مناسبة. يمكن أن تؤدي الأهداف المتسخة (على سبيل المثال ، بسبب الغبار) إلى صور أقل جودة.
  3. ضع كمية زائدة من الزيت في قاع غرفة التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، أضف قطرة من الزيت على الهدف من الاختيار.
  4. ضع غرفة التصوير على المجهر. ابحث عن مجال التركيز البؤري باستخدام تلطيخ DAPI أو باستخدام التصوير الساطع. إذا لزم الأمر ، تحرك في جميع أنحاء غرفة التصوير لضمان الانتشار المناسب لزيت الغمر.
  5. قم بإعداد مسارات التصوير اللازمة على المجهر. اعتمادا على المجهر ، قد تختلف الخطوات التالية (الجدول 1).
    ملاحظة: عند إعداد مسارات التصوير ، قم ببرمجة المسارات بحيث يتم قياس التلوين النووي أخيرا. قد يساهم الليزر 405 نانومتر في التبييض الضوئي ، وبالتالي فقدان إشارة محددة في جميع القنوات.
  6. لتحليل خلية كاملة لوجود p-RIPK3 (S227) أو p-MLKL (S358) ، قم بقياس مكدسات z التي تمتد على ارتفاع الخلية. هنا ، تم تصنيع مداخن z من 40 شريحة كل 0.16 ميكرومتر ، مما أدى إلى نطاق 6.22 ميكرومتر.

المسارليزرشعاع الخائنراووق
pRIPK3 (S227) / pMLKL (S358)561ميغا بايت -405 +BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
الجين الفيروسي: ICP0633ميغا بايت -405 +BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
النواة: DAPI405ميغا بايت -405 +BP 420-480 + BP 495-550
إم بي إس 488/561/633

الجدول 1: مسارات التصوير لتصور الخلية.

9. تحليل البيانات والقياس الكمي

  1. قم بتحميل الصور المجهرية إلى البرنامج. استخدم التركيز الموسع لتصور جميع معلومات z-stack في صورة 2D.
  2. بعد ذلك ، قم ببرمجة بروتوكول التحليل لاستخراج المعلومات التالية: عدد الخلايا لكل صورة ، ومجموع voxels التي تظهر p-RIPK3 (S227) + أو p-MLKL (S358) + تلطيخ. يمثل voxel حجما ثلاثي الأبعاد ، يعرف بأنه المكافئ ثلاثي الأبعاد للبكسل.
  3. لتحديد عدد الخلايا لكل صورة ، قم بتقسيم النواة. لتقليل الضوضاء في نتائج التجزئة ، أضف حدا على الحجم إلى التجزئة (>100 ميكرومتر مكعب). يمثل عدد النوى المجزأة عدد الخلايا في الصورة.
  4. لتحديد مقدار p-RIPK3 (S227) + أو p-MLKL (S358) + voxels، قم ببرمجة تجزئة قائمة على العتبة. اضبط العتبة بحيث لا يتم التقاط أي إشارة في صور عدم وجود جسم مضاد أساسي (NP).
  5. قم بتكييف العتبة باستخدام الصور من الحالة الوهمية غير المعالجة. لضمان الكشف الحساس عن زيادة الإشارة بسبب تحفيز التنخر ، قلل من التقاط فوكسل p-RIPK3 (S227) + أو p-MLKL (S358) + في ظروف وهمية عن طريق تعيين عتبة أعلى. تحقق دائما من بروتوكول التحليل المبرمج في عدة صور من الحالة الوهمية والعدوى الفيروسية المسببة للنخب.
  6. قم بتشغيل التحليل على جميع مجموعات الصور. قم بتصدير القياس الكمي للفوكسل وتجزئة النواة في ملف .txt لمزيد من المعالجة في برنامج جداول البيانات.
  7. قم بعمل جدول محوري للبيانات يوضح اسم الصورة ، والقياس الكمي للنواة ، ومجموع الفوكسل المكتشف.
  8. بعد ذلك ، قسم مجموع voxels الموجبة على عدد الخلايا في الصورة. ينتج عن هذا قيمة نسبية للفوكسل الموجب لكل خلية. لتصور زيادة الطي ، قسم القيمة النسبية ل p-RIPK3 (S227) + أو p-MLKL (S358) + voxels لكل خلية على متوسط الحالة غير المعالجة (وهمية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إن الكشف المناعي عن فسفرة MLKL وخاصة فسفرة RIPK3 في الخلايا البشرية يمثل تحديا تقنيا26. نقدم هنا بروتوكول تلطيخ محسن ل p-RIPK3 البشري (S227) و p-MLKL (S358) عند تنشيط ZBP1. يتضمن البروتوكول خطوة TSA لتحسين حد الكشف وحساسية إشارات الفلورسنت. للتحقق من صحة الطريقة ، تم إجراء مقارنة جنبا إلى جنب بين التألق المناعي بوساطة TSA مع تلطيخ الفلورسنت القياسي غير المباشر لكل من p-RIPK3 (S227) و p-MLKL (S358).

أصيبت خلايا HT-29 التي تعبر عن ZBP1 البشري لمدة 9 ساعات بسلالة HSV-1 الط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف بروتوكول التلوين المناعي هذا استخدام تضخيم إشارة التيراميد (TSA) لزيادة الحساسية لأحداث الإشارات لمسار الإشارات النخرية البشرية التي يصعب اكتشافها ، بما في ذلك فسفرة RIPK3 و MLKL26. يؤدي تضمين خطوة TSA إلى تحسين عتبة الكشف بشكل كبير من p-RIPK3 (S227) و p-MLKL (S358) ويزيد من حساسية إجهاد p-MLKL (S358). كشفت TSA عن إشارة p-RIPK3 (S227) موجودة بالفعل في العينات المعالجة الوهمية. في الخلايا البشرية ، تعد الفسفرة الذاتية ل RIPK3 في S227 شرطا أساسيا لتنشيط التنخر من خلال تمكين تفاعل مستقر مع MLKL. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر VIB Bioimaging Core على التدريب والدعم والوصول إلى حديقة الأدوات. يتم دعم JN من خلال زمالة الدكتوراه من مؤسسة الأبحاث فلاندرز (FWO). تم دعم البحث في مجموعة JM من خلال منحة Odysseus II (G0H8618N) ، و EOS INFLADIS (40007512) ، ومنحة بحثية مبتدئة (G031022N) من مؤسسة الأبحاث فلاندرز (FWO) ، ومنحة إثبات المفهوم من CRIG للباحثين الشباب ، ومن جامعة غنت. تم دعم البحث في مجموعة P.V. من قبل EOS MODEL-IDI (30826052) و EOS INFLADIS (40007512) ومنح أبحاث FWO العليا (G.0C76.18N و G.0B71.18N و G.0B96.20N و G.0A9322N) و Methusalem (BOF16 / MET_V/007) و iBOF20 / IBF / 039 ATLANTIS و Foundation Against Cancer (F / 2016/865 و F / 2020/1505) واتحادات CRIG و GIGG و VIB.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوية >أجسام مضادة< قوية>
مضادة للأرانب HRPAgilent Technologies بلجيكاK4002Envision + System-HRP المسمى بوليمر مضاد للأرانب
مضاد للماعز مضاد للفأر DyLight 633Thermofisher35513جسم مضاد ثاني
HSV-1 ICP0سانتا كروزsc-53070فأر مضاد ل ICP0 (HSV-1) الجسم
المضادمصل الفأر IAV-PR8في الإنتاج المنزليxxالماوس المضاد ل IAV-PR8 الجسم المضاد متعدد النسيلة
pMLKLAbcamab187091الأرانب المضادة ل MLKL-phospho S358 الجسم المضاد
pRIPK3Abcamab209384الأرانب المضادة للجسم المضاد RIPK3-phospho S227
< قوي > الفلوروفور < / قوي >
DAPIThermofisherD21490لتصور نواة الخلايا
Streptavidin مقترنة ب Alexa Fluor 568ThermofisherS11226لفيسولالة جزيئات البيوتين
< قوية > مركبات< / قوية >
30٪ H 2< / sub >O2< / sub>SigmaH1009ركيزة مؤكسدة ، ضرورية لنشاط HRP
4٪ PFASANBIOAR1068لإصلاح / ربط الخلايا
ب Biotinyl-tyramideR & D Systems6241لتضخيم الإشارة ، ركيزة HRP
BV-6SelleckchemS7597BV6 IAP Inhibitor
         لزراعة الخلايا: لفصل الخلايا
         8.0 جم / لتر كلوريد الصوديوم
         0.4 جم / لتر ملح ثنائي الصوديوم من EDTA
EDTA 0.04٪في التركيبة1.1 جم / لتر Na2HPO4
  ؛        0.2 جم / لتر NaH2PO4
         0.2 جم / لتر KCl
         0.2 جم / لتر جلوكوز
مصل الأبقار الجنينيTICOFBS EU XXXلزراعة الخلايا ، والحفاظ على زراعة الخلايا ؛ رقم الدفعة: 90439
GSK'840مثبط كيناز AOB0917 AobiousRIPK3
L-GlutamineSigma-AldrichG7513لزراعة الخلايا ، والحفاظ على ثقافة الخلية
MAXblockActive Motif15252حل الحجب
PBSGibco10444402
بيروفات الصوديومسيجما-ألدريتشS8636لزراعة الخلايا ، والحفاظ على زراعة الخلايا
TNF- & ألفا ؛في جزيء الإنتاجالمنزلي -الإشارات ، قادر على تحفيز موت الخلايا بالاشتراك مع BV6 و zVAD
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50MLلاختراق الخلايا
Trypan blueMerck11732لعد الخلايا ، تستخدم كعلامة حية / ميتة عند 0,1٪
TrypsineSigma-AldrichT4424لزراعة الخلايا: لفصل الخلايا
zVADBachemBACE4026865.0005Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 بئر قاع زجاجي عاليiBidi80807لثقافة الخلايا
كرات تحضير القطن بحجم متوسطعلوم المجهر الإلكتروني71001-10لتنظيف الأهداف
Immersol 518 F / 30 & deg; CZEISS444970-9000-000لتصور العينة بتكبير عال
منظف العدسةZEISS000000-0105-200لتنظيف الأهداف
LSM880 مجهرلتصور العينة
<قوي>Software
ExcelOfficexxلمعالجة البيانات
المنشور 9Graphpadxxلتحليل البيانات - الاختبار الإحصائي وتوليد الرسم البياني
Volocity 6.3Volocityxxلإجراء التقديرات الكمي
Zen blackZEISSxxللحصول على الصور ومعالجتها
Zen blueZEISSxxلتصور الصور
<قوية>فيروسات < / قوية>
HSV-1 (mutRHIM) سلالة Fالتي تنتجها   الدكتور Jiahuai Hanفي النسخ المتماثل في المنزلHSV-1 كمحفز للتشريح ؛ المجال الأساسي RHIM ل UL39 / ICP6 متحور (VQCG >AAAA)
HSV-1 (WT) سلالة Fالتي أنتجها الدكتور جياهوي هانفي النسخ المتماثل المنزليHSV-1 (WT) كعنصر تحكم سلبي لتحريض التشريع (تثبيط ICP6)
IAV PR8في مخزون المنزلفي النسخ المتماثلIAV كمحفز للتشريع
المنزلية متحد البؤر سريع Airyscan

المراجع

  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
  3. Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
  4. Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
  5. Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783(2021).
  6. Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
  7. Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
  8. Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
  9. Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
  10. Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
  11. Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
  12. Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
  13. Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
  14. Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
  15. Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816(2018).
  16. Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913(2020).
  17. Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
  18. de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
  19. Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
  20. Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
  21. Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
  22. Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
  23. Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
  24. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
  25. Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207(2020).
  26. Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
  27. De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
  28. Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
  29. Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
  30. Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
  31. Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211(2021).
  32. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  33. Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ZBP1 RIPK3 MLKL HT 29
تضخيم إشارة التيراميد للتلطيخ المناعي للفسفرة المعتمدة على ZBP1 ل RIPK3 و MLKL بعد عدوى HSV-1 في الخلايا البشرية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.