Method Article

تحسين معلمات الفرز الخلوي للتدفق لعزل وتنقية الحويصلات الصغيرة خارج الخلية

DOI:

10.3791/64360

⸱

January 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory of Women’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 3Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول طريقة عزل سريعة ومحددة الحجم للحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق تحسين حجم فوهة رش الهواء وضغط سائل الغمد وضغط تدفق العينة والجهد والكسب ومعلمات عتبة التشغيل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن إطلاق الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEV) من جميع أنواع الخلايا وتحمل البروتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي. تعمل جزيئات الإشارة كمؤشرات للحالة الفسيولوجية والمرضية للخلية. ومع ذلك ، لا توجد طريقة قياسية لعزل sEV ، مما يمنع تحديد العلامات الحيوية النهائية ودراسات التدخل الدوائي. في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل وتنقية 50-200 نانومتر sEV بواسطة فارز خلايا التدفق. لهذا الغرض ، تم اختيار فوهة 50 ميكرومتر وضغط سائل غمد 80 رطل لكل بوصة مربعة للحصول على معدل فرز جيد وتيار جانبي مستقر. تم استخدام الكريات المجهرية للبوليسترين ذات الحجم القياسي لتحديد مجموعات من الجسيمات 100 و 200 و 300 نانومتر. مع التحسين الإضافي لعتبة تشغيل الجهد والكسب والتشتت الأمامي (FSC) ، يمكن فصل إشارة sEV عن ضوضاء الخلفية. توفر هذه التحسينات لوحة من إعدادات الفرز الحرجة التي تمكن المرء من الحصول على مجموعة تمثيلية من sEV باستخدام FSC مقابل التشتت الجانبي (SSC) فقط. لا تسمح طريقة العزل القائمة على قياس التدفق الخلوي بتحليل الإنتاجية العالية فحسب ، بل تسمح أيضا بالتصنيف المتزامن أو تحليل البروتين ل sEV بناء على تعبير العلامات الحيوية ، مما يفتح العديد من تطبيقات البحث النهائية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطلق الخلية حويصلات خارج الخلية (EVs) بأحجام مختلفة تؤدي إلى جزيئات إشارات وشوائب غشائية ، وهي مهمة للتواصل بين الخلايا1. تلعب المركبات الكهربائية ذات الأحجام المختلفة أيضا أدوارا بيولوجية مختلفة ، حيث يمكن ل 50-200 نانومتر sEV توزيع الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتينات بدقة على الموقع الصحيح خارج الخلية. يساعد sEV أيضا في تحديد آليات إفرازها ، والتي لا تتضمن فقط تنظيم العمليات الفسيولوجية الطبيعية مثل المراقبة المناعية ، وصيانة الخلايا الجذعية ، وتخثر الدم ، وإصلاح الأنسجة ولكن أيضا علم الأمراض الكامن وراء العديد من الأمراض مثل تطور الورم وورم خبيث 2,3. يعد العزل والتحليل الفع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة الخلية

  1. قم بإعداد وسط استزراع من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS). استزرع خلية سرطان البنكرياس البشرية ، PANC-1 ، في قارورة مزرعة 75 سم2 بكثافة 1 × 106 خلايا / مل. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. الاستزراع الفرعي للخلايا عندما تصل كثافة الخلية إلى 75٪ -80٪ تحت الملاحظة المجهرية. قم بإزالة الوسط ، وشطف 2x مع 3-5 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS ؛ 0.01 م ، درجة الحموضة 7.2-7.4).
  3. تخلص من المحلول ، وأضف 1-2 مل من محلول التربسين-EDTA ، واترك الخلايا تنفصل حتى تصبح مستديرة ومعلقة في الوسط تحت المجهر. يضاف وسط جديد ، ونضح ، ويوزع في....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 مخطط مخطط التدفق للبروتوكول التجريبي. في هذه الطريقة ، تم استخدام الكريات المجهرية للبوليسترين ذات الحجم القياسي كمعايير مرجعية لتوزيع حجم الجسيمات. في ظل حالة المعلمة الآلية المحددة ، يمكن تمييز إشارة الجسيمات بوضوح عن ضوضاء الخلفية في مخطط FSC مقابل SSC باستخدام الشكل اللوغاريتمي. استراتيجيات البوابات موضحة في الشكل 2. تشير R4 و R5 و R6 إلى مواضع المجهرية 100 نانومتر و 200 نانومتر و 300 نانومتر على التوالي. R7 هو حد الكشف عن الضوضاء الإلكترونية أق.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول طريقة محسنة لعزل وتنقية sEV بحجم الجسيمات المحدد من 50-200 نانومتر باستخدام فارز خلايا التدفق ، والذي تم التحقق من صحته بواسطة NTA. حلت الطريقة مشكلة عنق الزجاجة المتمثلة في الحصول على sEV بحجم جسيم موحد ونقاء عالي ، وتجنب التداخل من الجزيئات البيولوجية غير ذات الصلة الملفوفة في EVs كبيرة الحجم22. يمكن إجراء تحليلات سريعة وعالية الإنتاجية باستخدام قياس التدفق الخلوي ، والذي يمكنه التقاط 100000 جسيم في الثانية واتخاذ 70000 قرار فرز في الثانية17 ، مما يقلل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل صندوق البحث العلمي بجامعة تشجيانغ للطب الصيني (2020ZG29) ، ومشروع أبحاث الرفاهية العامة الأساسية لمقاطعة تشجيانغ (LGF19H150006 ، LTGY23B070001) ، ومشروع وزارة التعليم بمقاطعة تشجيانغ (Y202147028) ومشروع التكنولوجيا التجريبية لقسم مختبر جامعة تشجيانغ (SJS201712 ، SYB202130).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنبوب الطرد المركزيBeckman Coulter344058
قوارير الثقافةCorning  430641
Dulbecco s النسر المعدل وسطCorning Cellgro10-013-CV
مصل الأبقار الجنينيSUERSUER050QY
فارز خلايا التدفقBeckman CoulterMoflo Astrios EQ
خلية سرطان البنكرياس البشرية ،NANAPANC-1 من قبل البروفيسور Weijun Yang ، كلية علوم الحياة ، جامعة Zhejiang
حجم جسيمات الليزر وإمكانات زيتا محلل MalvernZetasizer Nano ZS 90
عازل للفوسفاتGibcoC20012500BT
كريات فلورية من البوليسترينبيكمان كولتر6602336
مجهر إلكتروني ناقلالحركة JEOLJEM-1200EX
محلول التربسين-EDTAجيبكو1713949
الجسيمات الفلورية فائقة قوس قزحبيكمان كولترB28479
جهاز طرد مركزي فائقبيكمان كولترأوبتيما-L80XP
دوار الطرد المركزي الفائقبيكمان كولترSW32TI
تم التبرع بخلايا PANC-1 محلول ملحي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Small Extracellular VesiclesFlow CytometryVesicle IsolationVesicle PurificationCytometric SortingNanoparticle TrackingWestern BlotPolystyrene MicrospheresForward ScatterSide Scatter

Related Articles