تمكن مقايسات Pyrosequencing من التنميط الجيني القوي والسريع لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة للحمض النووي للميتوكوندريا في الخلايا أو الأنسجة غير المتجانسة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التنميط الجيني لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة في جينوم الميتوكوندريا عن طريق البيروسي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ارتبطت الطفرات في جينوم الميتوكوندريا (mtDNA) بالأمراض الوراثية الموروثة من الأم. ومع ذلك ، فقد زاد الاهتمام بتعدد أشكال mtDNA في السنوات الأخيرة بسبب القدرة التي تم تطويرها مؤخرا على إنتاج نماذج عن طريق طفرات mtDNA وتقدير جديد للارتباط بين الانحرافات الجينية للميتوكوندريا والأمراض الشائعة المرتبطة بالعمر مثل السرطان والسكري والخرف. Pyrosequencing هي تقنية التسلسل عن طريق التوليف التي تستخدم على نطاق واسع عبر مجال الميتوكوندريا لتجارب التنميط الجيني الروتينية. إن قدرتها على تحمل التكاليف النسبية عند مقارنتها بطرق التسلسل المتوازي الضخمة وسهولة التنفيذ تجعلها تقنية لا تقدر بثمن في مجال علم الوراثة الميتوكوندريا ، مما يسمح بالقياس الكمي السريع للبلازما غير المتجانسة مع زيادة المرونة. على الرغم من التطبيق العملي لهذه الطريقة ، فإن تنفيذها كوسيلة للتنميط الجيني mtDNA يتطلب ملاحظة بعض الإرشادات ، على وجه التحديد لتجنب بعض التحيزات ذات الأصل البيولوجي أو التقني. يحدد هذا البروتوكول الخطوات والاحتياطات اللازمة في تصميم وتنفيذ مقايسات البيروسكونيكز لاستخدامها في سياق قياس التغاير الجنسي.
المقدمة
يوجد جينوم الميتوكوندريا في شكل جزيئات دائرية صغيرة (16.5 كيلو بايت) (mtDNA) موجودة في الجزء الأعمق من الميتوكوندريا المسماة المصفوفة وتشفر 13 وحدة فرعية من السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ، بالإضافة إلى tRNAs و rRNAs اللازمة لترجمتها في الموقع بواسطة ريبوسوم الميتوكوندريا1. يمثل هذا الجينوم حوالي 1٪ من جميع البروتينات اللازمة لوظيفة الميتوكوندريا ، والباقي مشفر بواسطة الحمض النووي النووي (nDNA). من المفترض عموما أن الميتوكوندريا مشتقة من حدث اندماج تكافلي داخلي بين سلف ألفا بروتيني وخلية حقيقية النواة سلف. بمجرد حدوث هذا التعايش الافتراضي ، تم نقل المعلومات الوراثية للميتوكوندريا تدريجيا إلى النواة على مدار الدهور ، وهو ما يفسر الاكتنا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تقديم الموافقة المستنيرة لاستخدام خلايا cybrid البشرية 3243A>G و m.5024C>T MEFs الخالدة المستخدمة في هذه الدراسة. لم تكن الموافقة الأخلاقية مطلوبة في هذه الحالة حيث لم يتم جمع خلايا المريض في جامعة كامبريدج. ومع ذلك ، قد يتطلب استخدام الخلايا الليفية البشرية موافقة أخلاقية. يوصى بشدة باتباع أفضل الممارسات لإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل عند تحضير عينة الحمض النووي ل pyrosequencing. يمكن أن يؤدي التضخيم المتكرر باستخدام مواد أولية متطابقة إلى تلوث الأمبليكون وإدخال التحيز إلى التنميط الجيني اللاحق إذا لم يتم ملاحظة الفصل الصارم بين مناطق ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل وما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل. يستخدم خط الأنابيب المعروض هنا معدات محددة من مصنع وحيد ؛ ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يقدم هذا القسم مثالا على تحسين مقايسة pyrosequencing لطفرة mtDNA المسببة للأمراض البشرية ، بالإضافة إلى بيانات التسلسل من التنميط الجيني للخلايا الليفية الجنينية للفأر غير المتجانسة (m.5024C >T) (MEFs) المعالجة بنوكلياز إصبع الزنك الميتوكوندريا (mtZFNs). يوضح تحسين الفحص للخلايا البشرية ومقارنة مقايستين مختلفتين كيفية اختيار الأكثر دقة ، في حين أن التنميط الجيني لخلايا MEF المعدلة وراثيا في المثال الثاني بمثابة مثال تطبيقي للكشف عن تحولات البلازما غير المتجانسة بعد تدخل العلاج الجيني.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويتمثل أحد الجوانب الحاسمة لنجاح البروتوكول في تجنب التلوث، لا سيما عند استخدام كميات منخفضة من المواد الأولية. يوصى باستخدام غطاء للأشعة فوق البنفسجية وأطراف ماصة مفلترة عند تحضير العينات حيثما أمكن ذلك ، وكذلك للحفاظ على مناطق التضخيم المسبق وما بعد التضخيم منفصلة. يجب دائما تضمين القياسات الفارغة وعينات من التغاير المعروف (مثل الحمض النووي من النوع البري) لاستخدامها كمعايير للتحقق من التحيز التقني أو البيولوجي.
التحيز الفني الجدير بالملاحظة المتأصل في الفحص هو زيادة إشارة الإنارة الناتجة ع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
M.M. هو مؤسس مشارك ومساهم وعضو في المجلس الاستشاري العلمي لشركة Pretzel Therapeutics، Inc. P.S.-P. و P.A.N. تقديم خدمات استشارية لشركة Pretzel Therapeutics، Inc.
شكر وتقدير
نود أن نعرب عن تقديرنا لسيلفيا مارشيه وكونستانزا لامبرتي (معهد علم الأعصاب "كارلو بيستا" ، مؤسسة IRCCS ، ميلانو) لإعداد وتوفير خلايا cybrid m.3243A>G المستخدمة كأمثلة توضيحية لهذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لأعضاء مجموعة علم الوراثة الميتوكوندريا (MRC-MBU ، جامعة كامبريدج) للمناقشة المفيدة خلال هذا البحث. تم دعم هذا العمل بتمويل أساسي من مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MC_UU_00015/4 و MC_UU_00028/3). P.A.N. و P.S.-P. بالإضافة إلى ذلك ، يتم دعمها من قبل مؤسسة Lily ومؤسسة Champ ، على التوالي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 | كواشف QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG (4 × 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 مجموعة خرطوشة | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 أقراص | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 الخرز المغناطيسي ؛ | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 (1) | QIAGEN | 9024325 |
المراجع
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
