Method Article

معالجة القضايا العملية في المسافة البادئة الدقيقة القائمة على مجهر القوة الذرية على نباتات الغضروف المفصلي البشري

DOI:

10.3791/64371

⸱

October 28th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم نهجا خطوة بخطوة لتحديد ومعالجة المشكلات الأكثر شيوعا المرتبطة بالمسافات البادئة الدقيقة للقوة الذرية. نحن نمثل المشاكل الناشئة في نباتات الغضاريف المفصلية البشرية الأصلية التي تتميز بدرجات مختلفة من التنكس الناجم عن هشاشة العظام.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا شك أن مجهر القوة الذرية (AFM) هو حاليا أحد أقوى التقنيات وأكثرها فائدة لتقييم الإشارات الدقيقة وحتى النانوية في المجال البيولوجي. ومع ذلك ، كما هو الحال مع أي نهج مجهري آخر ، يمكن أن تنشأ تحديات منهجية. على وجه الخصوص ، يمكن أن تؤدي خصائص العينة وإعداد العينة ونوع الأداة ومسبار المسافة البادئة إلى قطع أثرية غير مرغوب فيها. في هذا البروتوكول ، نمثل هذه المشكلات الناشئة على نباتات الغضروف المفصلي الصحية وكذلك العظمية. تحقيقا لهذه الغاية ، نعرض أولا من خلال نهج خطوة بخطوة كيفية إنشاء وتصنيف وتصنيف أقراص الغضروف المفصلية خارج الجسم الحي بصريا وفقا لمراحل مختلفة من التنكس عن طريق تصوير مضان الفسيفساء 2D الكبير لنباتات الأنسجة بأكملها. تتمثل القوة الرئيسية للنموذج خارج الجسم الحي في أنه يشتمل على غضروف بشري قديم وأصلي يسمح بالتحقيق في التغيرات المرتبطة بهشاشة العظام من البداية المبكرة إلى التقدم. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا عرض المزالق الشائعة في إعداد الأنسجة ، وكذلك إجراء AFM الفعلي مع تحليل البيانات اللاحق. نوضح كيف يمكن للخطوات الأساسية ولكن الحاسمة مثل إعداد العينات ومعالجتها ، وخصائص العينة الطبوغرافية الناتجة عن الانحطاط المتقدم ، وتفاعل طرف العينة أن تؤثر على الحصول على البيانات. نخضع أيضا للتدقيق المشاكل الأكثر شيوعا في AFM ونصف ، حيثما أمكن ، كيفية التغلب عليها. إن معرفة هذه القيود ذات أهمية قصوى للحصول على البيانات الصحيحة وتفسيرها ، وفي النهاية تضمين النتائج في سياق علمي واسع.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا للحجم المتقلص باستمرار للأجهزة والأنظمة الإلكترونية ، اكتسب التطور السريع للتكنولوجيا والمعدات القائمة على الميكرو والنانو زخما. أحد هذه الأجهزة هو مجهر القوة الذرية (AFM) ، والذي يمكنه مسح الأسطح البيولوجية واسترداد المعلومات الطبوغرافية أو الميكانيكية الحيوية على مقياس نانو وميكرومتر 1,2. من بين ميزاتها الواسعة ، يمكن تشغيل هذه الأداة كأداة صغيرة وكذلك نانو إندينتر للحصول على معلومات حول الخواص الميكانيكية للأنظمة البيولوجيةالمختلفة 3،4،5،6. يتم جمع البيانات عن طريق الاتصال ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام اللقمة الفخذية التي تم جمعها من المرضى الذين يخضعون لتقويم مفاصل الركبة الكلي في مستشفى جامعة توبنغن ، ألمانيا. تم تضمين عينات الغضروف المفصلي فقط من المرضى الذين يعانون من أمراض المفاصل التنكسية وما بعد الصدمة في هذه الدراسة. تم الحصول على موافقة اللجنة الأخلاقية الإدارية والمؤسسية والمحلية قبل بدء الدراسة (المشروع رقم 674/2016BO2). تم تلقي موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى قبل المشاركة.

ملاحظة: يرد مخطط انسيابي لخطوات التجربة بترتيبها الزمني في الشكل 1.

1. معالجة الأنسجة وتوليد أقراص الغضاريف

  1. تحضير الأنسجة
    1. بعد الاستئصال بعد الجراحة ، ضع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام جهاز قطع عصامي ، تمكنا من زرع وتوليد أقراص غضروفية صغيرة (4 مم × 1 مم) من لقمات بشرية جديدة تحتوي على نمط مكاني خلوي واحد30 من سلاسل مفردة (SS ، الشكل 2A) ، سلاسل مزدوجة (DS) ، مجموعات صغيرة (SC) ، مجموعات كبيرة (BC ؛ الشكل 2 أ) ، ومنتشر (الشكل 2 ب). يوضح الشكل 3 أ غرسا تمثيليا للغضروف. تم اختيار الأقراص التي تعرض نوعا واحدا فقط من الأنماط باستخدام التصوير الفلوري من أعل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كمرض تدريجي ومتعدد العوامل ، يؤدي OA إلى تغييرات هيكلية ووظيفية في الغضروف المفصلي. طوال فترة الزراعة العضوية ، يصاحب ضعف الخواص الميكانيكية تغيرات هيكلية وكيميائية حيوية على سطح الغضروف المفصلي27,31. الأحداث المرضية المبكرة التي تحدث في الزراعة العضوية هي نضوب البروتيوغليكان إلى جانب اضطراب شبكة الكولاجين32،33،34. من الصعب تحديد مثل هذه التغييرات السطحية الدقيقة المبكرة.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جراحي العظام من قسم جراحة العظام في مستشفى جامعة توبنغن على تقديم عينات الأنسجة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BMerck KGaA, Darmstadt, Germany1397-89-3
Atomic Force microscop (AFM) head CellHesion 200 ، Bruker Nano GmbH ، برلين ، ألمانياJPK00518
غراء عينة متوافق حيويا   ؛Bruker Nano GmbH ، برلين ، ألمانياH000033
Calcein AMCayman ، Ann Arbor ، Michigan ، الولايات المتحدة الأمريكية14948صبغة نفاذية لغشاء الخلية ، تستخدم لفرز قرص الغضروف - تصوير المنظر العلوي
ناتئBruker Nano GmbH ، برلين ، ألمانياSAA-SPH-5UMاسم التردد: 30 كيلو هرتز ، ك: 0.2 نيوتن / م ، اسم الطول: 115 & mu ؛ م ، اسم العرض: 40 & مو ؛ م,  الهندسة: طرف أسطواني مستطيل مع 5 & mu ؛ م نهاية نصف قطر
الغضروف ctting جهاز  عصامي غيرمتوفر جهاز بلاستيك للقطع يحتوي على أجزاء محددة مسبقا من كاميرا CDD مقاس 4 مم × 1 مم
مدمجة في AFM كاميرا AFMThe Imaging Source Europe GmbH ، بريمن ، ألمانياDFK 31BF03
CDD مدمجة في المجهر الفلوريLeica Biosystems ، Wetzlar ، ألمانياDFC3000G
CryotomeLeica Biosystems ، Wetzlar ، ألمانياCM3050S  ؛
يمكن تنزيل برنامج معالجة البيانات الخاص ب AFMBruker Nano GmbH ، برلين ، ألمانيا، n/aالإصدار 5.0.86 ،   مجانا من الموقع الإلكتروني التالي https://customers.jpk.com
Dulbecco's Eagle's medium (DMEM)  Gibco ، Life Technologies ، دارمشتات ، ألمانيا41966052
المجهر الفلوري (Leica DMi8)Leica Biosystems ، Wetzlar ، ألمانيا11889113
حامل ناتئ الكتلة الزجاجيةBruker Nano GmbH ، برلين ، ألمانياSP-90-05كتلة زجاجية طويلة جدا ذات وجوه بزاوية ، مصممة خصيصا للاستخدام مع JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
مجهر تباين الطور المقلوب (مدمج في AFM)AxioObserver D1 ، المجهر كارل زايس ، جينا ، ألمانياL201306_03
وسط L-15 ليبوفيتز بدون L-glutamine   ؛Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانياF1315
زجاجية مجهريةSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCLS294775X50
وسط التركيب مع DAPIibidi GmbH ، Gr & auml ؛ felfing ، ألمانيا50011تركيب الوسائط مع DAPI النووي (4 & prime ؛ ، 6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining المستخدمة في أقراص الغضروف   ؛ تصوير المنظر الجانبي
Penicillin-StreptomycinSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةP4333
سخان أطباق Petri المرتبط ب AFM (سخان أطباق بتري)Bruker Nano GmbH ، برلين ، ألمانياT-05-0117
مشرطمنتجات ريشة الطبية ، أوساكا ، اليابان2023-01
تنورة سيليكونBruker Nano GmbH ، برلين ، ألمانياغشاءسيليكون واقي (D55x0.25) يتم وضعه على أساس قاعدة كتلة الزجاج لمنع التكثيف المتوسط في رأس AFM.
البرنامج الإحصائي - SPSSIBM ، Armonk ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكيةSPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
أطباق زراعة الأنسجة TPP تكنو المنتجات البلاستيكية AG ، Trasadingen ، سويسراTPP93040
Tissue-tek O.C.T. مركبSakura Finetek ، Alphen aan den Rijn ، هولنداSA6255012تضمين قابل للذوبان في الماء   ؛
شرائح وسيط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application o....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopyMicro IndentationArticular Cartilage ExplantsOsteoarthritis ProgressionCartilage Mechanical PropertiesFluorescence ImagingYoung s ModulusForce Distance CurvesSample PreparationCantilever Calibration

Related Articles