في هذا العمل ، تم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لدراسة المرونة المسامية لجل الأكتوميوسين في ظل ظروف خاضعة للرقابة. يتم تحديد ديناميكيات هلام actomyosin والمذيب المضمن ، والتي من خلالها يتم إثبات مرونة الشبكة المسامية. نناقش أيضا التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهميتها لميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ميكانيكا شبكات الأكتوميوسين المرنة (البورية) الانقباضية كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن للخلايا تغيير أشكالها بنشاط وتصبح متحركة ، وهي خاصية تعتمد على قدرتها على إعادة تنظيم بنيتها الداخلية بنشاط. تعزى هذه الميزة إلى الخصائص الميكانيكية والديناميكية للهيكل الخلوي الخلوي ، ولا سيما الهيكل الخلوي actomyosin ، وهو هلام نشط من خيوط الأكتين القطبية ، ومحركات الميوسين ، والبروتينات الملحقة التي تظهر خصائص الانكماش الجوهري. الرأي المقبول عادة هو أن الهيكل الخلوي يتصرف كمادة لزجة مرنة. ومع ذلك ، لا يمكن لهذا النموذج دائما تفسير النتائج التجريبية ، والتي تكون أكثر اتساقا مع صورة تصف الهيكل الخلوي بأنه مادة نشطة مرنة مسامية - شبكة مرنة مدمجة مع العصارة الخلوية. تدفع تدرجات الانقباض الناتجة عن محركات الميوسين تدفق السيتوسول عبر مسام الجل ، مما يشير إلى أن ميكانيكا الهيكل الخلوي والسيتوسول مرتبطة بإحكام. تتمثل إحدى السمات الرئيسية لمرونة المسام في الاسترخاء المنتشر للضغوط في الشبكة ، والتي تتميز بثابت انتشار فعال يعتمد على معامل مرونة الهلام ، والمسامية ، ولزوجة السيتوسول (المذيبات). نظرا لأن الخلايا لديها العديد من الطرق لتنظيم بنيتها وخواص المواد ، فإن فهمنا الحالي لكيفية اقتران ميكانيكا الهيكل الخلوي وديناميكيات تدفق السيتوسول لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. هنا ، يتم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لتوصيف الخصائص المادية لجل actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي. الانكماش الهلامي مدفوع بانقباض محرك الميوسين ، مما يؤدي إلى ظهور تدفق المذيب المخترق. تصف الورقة كيفية تحضير هذه المواد الهلامية وإجراء التجارب. نناقش أيضا كيفية قياس وتحليل تدفق المذيبات وتقلص الهلام على المستويين المحلي والعالمي. يتم إعطاء علاقات القياس المختلفة المستخدمة لقياس كمية البيانات. أخيرا ، تتم مناقشة التحديات التجريبية والمزالق الشائعة ، بما في ذلك صلتها بميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.
المقدمة
الخلايا الحية لها خصائص ميكانيكية فريدة. إلى جانب القدرة على الاستجابة السلبية للقوى المطبقة ، فهي أيضا قادرة على توليد القوى بنشاط استجابة للمنبهات الخارجية1. تعزى هذه الخصائص ، الضرورية لمجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، لا سيما أثناء حركة الخلية ، في المقام الأول إلى الخصائص الميكانيكية والديناميكية للهيكل الخلوي للخلية ، وخاصة الهيكل الخلوي actomyosin ، وهو هلام نشط من خيوط الأكتين القطبية ، والمحركات الجزيئية للميوسين ، والبروتينات الملحقة. تظهر شبكات الأكتوميوسين هذه خصائص ذاتية التنظيم والانكماش الجوهرية مدفوعة ببروتينات الميوسين الحركية ، والتي تربط خيوط الأكتين وتولد بنشاط ضغوطا ميكانيكية في الشبكة التي يغذيها التحلل المائي ATP2.
أجريت العديد من الدراسات التجريبية والنظرية لدراسة الخصائص المادية للهيكل الخلوي3. الرأي المقبول عموما هو أن الهيكل الخلوي يتصرف كمادة لزجةمرنة 4. هذا يعني أنه على نطاقات زمنية قصيرة ، يتصرف الهيكل الخلوي كمادة مرنة ، وعلى فترات زمنية طويلة ، يتصرف كسائل لزج بسبب البروتينات المتشابكة وانفصال محرك الميوسين (وإعادة الارتباط) ، مما يسمح للشبكة بالدوران ديناميكيا. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، لا يمكن للنموذج اللزج المرن وصف النتائج التجريبية ، والتي تكون أكثر اتساقا مع الصورة التي تصف الهيكل الخلوي ، وبشكل عام ، سيتوبلازم الخلية الذي يوصف بأنه مادة فعالة مساميةمرنة 5,6. ميزتان رئيسيتان تميزان هذه الأنواع من المواد. (ط) السمة الرئيسية الأولى هي توليد تدفق السيتوسول المخترق ("المذيب") عبر مسام الهلام عن طريق تدرجات انقباضية مدفوعة بمحركات الميوسين ، والتي تكمن وراء عمليات مثل تفجير الخلية7 ، والحركة8 ، وتذبذبات شكل الخلية9. يمكن أن يكون ظهور مثل هذه التدفقات الخلوية محليا ، أو للنفخ ، أو عالميا ، كما هو الحال في حركة الخلية. في الحالة الأخيرة ، تدفع الضغوط المطبقة بالانقباض في مؤخرة الخلية تدفق السائل الخلوي نحو مقدمة الخلية ، والتي تغذي تجمع البروتين اللازم لتجميع الصفيحة8. (ii) الميزة الرئيسية الثانية هي أن استرخاء الإجهادات منتشر ويتميز بثابت انتشار فعال ، والذي يعتمد على معامل مرونة الهلام ، ومسامية الهلام ، ولزوجة المذيب5. يحدد ثابت الانتشار المسامي المرن مدى سرعة استجابة النظام للإجهاد المطبق. تتوافق ثوابت الانتشار الأعلى مع إعادة توزيع الإجهاد بشكل أسرع. وهذا بدوره يحدد المدة التي يستغرقها السائل الخلوي داخل الخلايا لإعادة توزيعه داخل الخلية بعد الضغط الميكانيكي المطبق، سواء كان خارجيا أو داخليا، مثل الضغوط الانقباضية النشطة الناتجة عن محركات الميوسين. وبالتالي ، توضح هذه الأمثلة أن ميكانيكا الهيكل الخلوي والسيتوسول مقترنة بإحكام ولا يمكن معالجتها بشكل منفصل3.
نظرا لأن الخلايا يمكنها تنظيم خواصها الميكانيكية بعدة طرق ، فإن التفاعل بين ميكانيكا الشبكة وديناميكيات تدفق السوائل لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. يتمثل النهج البديل القوي في استخدام الأنظمة المعاد تشكيلها في المختبر والتي تسمح بالتحكم الكامل في المكونات المجهرية المختلفة ومعلمات النظام ، مما يجعل هذه الأنظمة النموذجية مثالية للتحليل المادي10,11. تم استخدام هذا النهج بنجاح لدراسة تأثير تركيب البروتين وهندسة النظام على الحركة القائمة على الأكتين 12،13،14،15،16،17،18 ، والنمط ثنائي الأبعاد لشبكات الأكتوميوسين 19،20،21،22، والتفاعل بين انقباض الشبكة وديناميات تدفق السوائل لجل الأكتوميوسين المرن ، وهو محور هذه الورقة23.
في هذه المخطوطة ، تمت مناقشة إعداد شبكات الأكتوميوسين المرنة المقلصة ذات الأبعاد التي يمكن التحكم فيها وخصائص المواد بناء على عمل Ideses et al.23. يتم تحليل ديناميكيات الجل المتعاقد والمذيب المصفى وقياسها ، والتي من خلالها يتم إثبات أن هذه المواد الهلامية actomyosin يمكن وصفها بأنها مادة فعالة poroelastic. تؤكد دراسة تأثير لزوجة المذيبات على انتشار الإجهاد الطبيعة المسامية لهذه الشبكات. يتم توفير علاقات القياس المختلفة المستخدمة لقياس كمية البيانات. أخيرا ، تتم مناقشة التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهمية النتائج التجريبية للهيكل الخلوي الخلوي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. معالجة سطح الزجاج والتخميل:
ملاحظة: يتضمن هذا القسم ثلاث خطوات رئيسية (انظر الشكل 1): (i) التنظيف والتجفيف المائي ، (ii) silanization ، و (iii) التخميل السطحي.
- التنظيف والتجفيد المائي
- استخدم محلول سمكة البيرانا لتنظيف الأسطح الزجاجية.
ملاحظة: محلول سمكة البيرانا عبارة عن خليط من 30٪ H 2 O 2 و 70٪ H2SO4 (جدول المواد). هدفها الرئيسي هو إزالة الملوثات العضوية من أسطح الغطاء وفضح مجموعات OH على السطح الزجاجي. بهذه الطريقة ، يصبح السطح الزجاجي محبا للماء. - ضع 10-12 # 1.5 (22 مم × 22 مم) أغطية زجاجية (جدول المواد) في حامل بولي تترافلورو إيثيلين محلي الصنع (مساحة القاعدة: 5.5 سم × 5.5 سم). انقل حامل البولي تترافلورو إيثيلين إلى دورق سعة 400 مل (جدول المواد) ، واحتضانه ب 300 مل من محلول سمكة البيرانا لمدة 2 ساعة. قم بهذه الخطوة على الجليد وفي غطاء كيميائي.
ملاحظة: يبلغ طول عمود البولي تترافلورو إيثيلين الملولب بقاعدة الحامل 12 سم ، وهو أطول من الدورق (11 سم) ، مما يسمح بالنقل / السحب الآمن للحامل من / إلى محلول سمكة البيرانا. نظرا لأن محلول سمكة البيرانا لا يزال شديد التفاعل وساخنا جدا ، فمن الضروري إيقاف التفاعل. أسهل طريقة لإيقاف التفاعل هي صب محلول سمكة البيرانا في ماء (صنبور) لتحقيق تخفيف 50x (على الأقل). يمكن بعد ذلك التخلص من المحلول بأمان. لا تحتفظ أبدا بمحلول سمكة البيرانا المستخدم في زجاجة زجاجية مغلقة - فقد ينتهي ذلك بانفجار زجاجة. - انقل حامل البولي تترافلورو إيثيلين إلى دورق نظيف مملوء بالماء المقطر المزدوج الطازج (DDW) لغسل سمكة البيرانا الزائدة من أغطية الغطاء.
- انقل الدورق إلى حمام صوتنة (جدول المواد) ، وقم بصوتنة عند 80 هرتز بكامل طاقتها لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين مع DDW جديد. استخدم DDW جديدا في كل مرة.
- استخدم محلول سمكة البيرانا لتنظيف الأسطح الزجاجية.
- التثليق
- انقل الحامل إلى دورق نظيف (400 مل) مملوء ب 300 مل من الميثانول النقي (جدول المواد) ثم إلى حمام صوتنة (جدول المواد). Sonicate عند 80 هرتز بكامل طاقتها لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
- بعد الصوتنة ، انقل الحامل إلى محلول silane محضر باستخدام 15 مل من DDW ، و 3.1 مل من حمض الأسيتيك (جدول المواد) ، و 340 مل من الميثانول ، و 7.6 مل من السيلان ((3-Mercaptopropyl) تريميثوكسيسيلان) (جدول المواد). أغلق الدورق بالبارافيلم ، واحتفظ به في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
ملاحظة: يجب أن يتم تحضير محلول السيلان والتعامل معه في غطاء كيميائي. بعد خطوة silanization ، ضع محلول silane المستخدم (النفايات) في زجاجة زجاجية مخصصة داخل الغطاء الكيميائي. - في اليوم التالي، انقل الحامل إلى كأس زجاجية نظيفة مملوءة ب 300 mL من الميثانول النقي لمدة 15 ثانية. بعد ذلك ، انقل الحامل إلى دورق نظيف ، وليس قبل تجفيف الجزء السفلي من حامل polytetrafluoroethylene لإزالة الميثانول الزائد. انقلي الدورق إلى الفرن (جدول المواد) لتجفيف أغطية الزجاج لمدة 5 دقائق على حرارة 120 درجة مئوية.
- التخميل السطحي باستخدام بوليمر خامل
- تحقيق التخميل السطحي عن طريق احتضان أغطية الزجاج ببوليمر خامل (جدول المواد). لكل تجربة ، خذ اثنين من أغطية الغطاء وضعهما في طبق بتري مغطى بطبقة بارافيلم تم تنظيفها في البداية بالإيثانول (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) (جدول المواد).
- احتضان كل غطاء مع 1 مل من 4 ملغ · مل − 1 5 كيلو دالتون الوزن الجزيئي ميثوكسي بولي إيثيلين جلايكول ماليميد (mPEG-mal ، Mw = 5 كيلو دالتون) (جدول المواد) في 1x محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) (جدول المواد) لمدة 1 ساعة عند 22 درجة مئوية.
ملاحظة: يؤدي وضع أغطية الغطاء على طبقة بارافيلم كارهة للماء إلى حصر محلول بوليمر PEG المحب للماء على سطح الغطاء الزجاجي. وقت الحضانة أمر بالغ الأهمية لتحقيق التخميل الأمثل. استخدم أوقات الحضانة التي تتراوح بين 45 دقيقة و 2 ساعة. فوق وقت الحضانة هذا ، يمكن أن يتدهور سطح الغطاء الزجاجي ، مما يؤدي إلى التصاق البروتين وفقدان الشفافية. - في نهاية عملية الحضانة ، شطف كل غطاء مع 5 مل من DDW ، وجفف مع تدفق N2 (الغاز). لا تجفف أغطية الأغطية تحت الفراغ. نظرا لأنه يجب أن تبقى أغطية الغطاء مبللة بعد التخميل ، ضع على الفور 1 مل من 10 mM Tris على الأسطح pegylated. استخدم أغطية الغطاء في غضون 2 ساعة.
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات المختلفة في غرفة التدفق الصفحي لمنع تلوث سطح الزجاج.
2. تنقية البروتين
- تنقية G-actin من مسحوق الأسيتون العضلي الهيكلي للأرنب باستخدام طريقة ترشيح الجل24.
- تنقية الأكتين يستغرق 1 أسبوع. احتفظ ب G-actin المنقى في G-buffer (5 mM Tris pH 7.8 ، 0.01٪ NaN3 ، 0.1 mM CaCl 2 ،0.2 mM ATP ، و 1 mM DTT) ، وقم بتخزينه على الجليد. استخدام الحل في غضون 2 أسابيع.
ملاحظة: استبدل الثلج كل يومين. - قم بتسمية الأكتين بصبغة فلورية معدلة بالماليميد16 (جدول المواد). تنقية GST-fascin على أساس طريقة Ono et al.25. قم بتجميد كلا البروتينين في السائل N2 ، وخزنه في -80 درجة مئوية.
- تنقية الأكتين يستغرق 1 أسبوع. احتفظ ب G-actin المنقى في G-buffer (5 mM Tris pH 7.8 ، 0.01٪ NaN3 ، 0.1 mM CaCl 2 ،0.2 mM ATP ، و 1 mM DTT) ، وقم بتخزينه على الجليد. استخدام الحل في غضون 2 أسابيع.
- استخدم بروتوكولا قياسيا لتنقية الميوسين II من العضلات الهيكلية للأرنب26. يشتمل مخزن الميوسين II المنقى (dimers) على 10 mM Tris pH 7.4 و 0.5 M KCl و 35٪ w / v السكروز. قم بتجميد الميوسين في السائل N2 ، واحفظه في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يحافظ التركيز العالي ل KCl على محركات الميوسين في شكل ثنائي ، بينما تضمن النسبة العالية من السكروز عدم إعاقة نشاط المحركات عند التجميد. استخدم ماصة مخصصة لمعالجة السوائل اللزجة عند العمل مع محاليل مخزون الميوسين II (جدول المواد).- قم بتسمية dimers myosin II بصبغة فلورية (جدول المواد) في أزواج من بقايا السيستين المهندسة19,27. استخدم قوانص الدجاج RLC الطافرة A لهذا الغرض26. قم بتجميد الميوسين II المسمى في السائل N2 ، وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يضمن إجراء وضع العلامات هذا أن الميوسين المسمى نشط كبروتين الميوسين II الأصلي.
- قم بتسمية dimers myosin II بصبغة فلورية (جدول المواد) في أزواج من بقايا السيستين المهندسة19,27. استخدم قوانص الدجاج RLC الطافرة A لهذا الغرض26. قم بتجميد الميوسين II المسمى في السائل N2 ، وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
- استخدم مقياس الطيف الضوئي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية (جدول المواد) لقياس امتصاص محاليل بروتين المخزون ، واستنتاج تركيزات البروتين باستخدام قانون بير لامبرت باستخدام معاملات الانقراض التالية: G-actin (ε290 = 26,460 M−1 · cm−1) ، GST-fascin (ε 280 = 99,330 M−1 · cm−1) ، الميوسين II dimer (ε280 = 268,800 M−1 · cm−1) ، و RLC الطافر A (ε280 = 3,960 M−1 · سم − 1) 19.
3. إعداد عينة
ملاحظة: بلمرة مونومرات الأكتين في وجود مجاميع كبيرة من محركات الميوسين II و fascin المتشابك السلبي القوي لإنتاج شبكات أكتوميوسين مرنة مقلصة مجهريا19,23. تسمح إضافة حبات الفلورسنت إلى المحلول بتتبع تدفق المذيبات أثناء تقلص الهلام.
- محلول البروتين ("أكتوميوسين")
- باستثناء G-actin ، احتفظ بالبروتينات عند -80 درجة مئوية في قسومات صغيرة ، وقم بإذابتها عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. الحجم الكلي لمحلول الأكتوميوسين هو 40 ميكرولتر.
- تحضير المحلول عن طريق خلط 10 mM Tris pH 7.4 ، 2 mM MgCl2 ، 25 mM KCl ، 1 mM ATP ، نظام تجديد ATP (0.5 mg · mL −1 الكرياتين كيناز و 5 mM فوسفات الكرياتين) ، 200 μM EGTA (مخلبات Ca2+ أيونات) ، محلول مضاد للتبييض (0.1 مجم · مل −1 أوكسيديز الجلوكوز ، 0.018 مجم · مل −1 كاتلاز ، و 5 مجم · مل −1 جلوكوز) ، 5 ميكرومتر G-actin ، 280 نانومتر GST-fascin ، و 1.67 نانومتر ميوسين II. النسبة المئوية لل G-actin المسمى هي 5٪ (النسبة المولية).
ملاحظة: استخدم نسبة منخفضة من G-actin المسمى لتجنب تشبع إشارة الفلورسنت في المراحل المتقدمة من تقلص الهلام.
- تحضير الركام الحركي للميوسين II
- أضف محركات الميوسين إلى محلول البروتين في صورة مجاميع. لتكوين مجاميع الميوسين الكبيرة (150 ميوسين دايمرات / ركم) ، قم بتخفيف محلول مخزون الميوسين ب 10 mM Tris pH 7.4 للوصول إلى تركيز نهائي قدره 25 mM KCl.
- احتفظ بمحلول الميوسين المخفف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم انقله إلى الثلج حتى الاستخدام. المحركات نشطة بالكامل لمدة تصل إلى 2 ساعة.
- قياس تدفق المذيبات
- لتتبع تدفق المذيب عبر مسام الجل ، أضف حبات الفلورسنت إلى محلول الأكتوميوسين. تقليل التفاعل بين الخرز وشبكة الأكتوميوسين عن طريق تخميل الخرزات. عمليا ، احتضان 1 ميكرولتر من الخرز (جدول المواد) مع 5 ميكرومتر G-actin لمدة 20 دقيقة في RT ، ثم قم بإزالة G-actin الزائد عن طريق الطرد المركزي (جدول المواد) (الشروط: 6000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية).
- كرر هذه الخطوة مع 10 ملغ · مل − 1 ألبومين مصل البقر (BSA) (جدول المواد) لمنع (ربما) السطح غير المطلي المتبقي. استخدم الخرزات بتخفيف نهائي قدره 1: 10,000 مجلد / مجلد في التجارب.
ملاحظة: من المهم تكييف قطر الخرز مع حجم مسام الجل بحيث تكون نسبة حجم الخرزة / المسام <1 في جميع المراحل.
- تأثير لزوجة المحلول
- تحكم في لزوجة المحلول بإضافة الجلسرين (جدول المواد) إلى محلول الأكتوميوسين. تؤدي إضافة الجلسرين بنسبة وزن تتراوح من 0٪ إلى 34٪ إلى زيادة مقابلة في لزوجة المحلول من η ω إلى 2.76 η ω ، حيث η ω هي لزوجة الماء عند 20 درجة مئوية28.
ملاحظة: من الضروري استخدام ماصة مخصصة لمعالجة السوائل اللزجة عند العمل مع الجلسرين (جدول المواد).
- تحكم في لزوجة المحلول بإضافة الجلسرين (جدول المواد) إلى محلول الأكتوميوسين. تؤدي إضافة الجلسرين بنسبة وزن تتراوح من 0٪ إلى 34٪ إلى زيادة مقابلة في لزوجة المحلول من η ω إلى 2.76 η ω ، حيث η ω هي لزوجة الماء عند 20 درجة مئوية28.
4. تشغيل تجربة
- التعامل مع حامل عينة محلية الصنع
- خذ إحدى قسائم الغطاء المخملة ب PEG ، وضع فاصل بارافيلم مدهون فوقها ، وضعها في حامل العينة.
ملاحظة: يمكن للمرء استبدال فاصل parafilm مع أي فاصل.
- خذ إحدى قسائم الغطاء المخملة ب PEG ، وضع فاصل بارافيلم مدهون فوقها ، وضعها في حامل العينة.
- تحضير محلول أكتوميوسين
- تحضير محلول الأكتوميوسين على الجليد في أنبوب طرد مركزي دقيق عن طريق دمج المكونات المجهرية المختلفة ، وإضافة مجاميع محرك الميوسين II ، وإضافة EGTA أخيرا. خلط الحل جيدا. تؤدي إضافة EGTA إلى بدء بلمرة شبكة الأكتوميوسين ، والتي تحدد وقت بدء التجربة.
- ضع 1.1 ميكرولتر من هذا المحلول على شريحة الغطاء المثبتة على الحامل ، وضع غطاء الغطاء الثاني في الأعلى. المسمار حامل لختم العينة. تضغط هذه العملية قليلا على القطرة ، والتي تعتمد شكلا يشبه القرص. تتراوح أقطار السقوط بين 2800-3000 ميكرومتر.
- ضع حامل العينة على المجهر ، وابدأ عملية الاستحواذ. تحضير المجهر مقدما لتقليل وقت الاستحواذ الأولي. عادة ما يستغرق 1-2 دقيقة بعد الخلط لبدء تصوير العينة.
5. تقنيات الفحص المجهري
- قم بتصوير العينات باستخدام مجهر فلوري مقلوب (جدول المواد) يتم التحكم فيه بواسطة برنامج مخصص (جدول المواد).
- استخدم تكبيرات منخفضة تبلغ 2.5x / 0.075 Plan-NEOFLUAR (جدول المواد) لتصور منطقة الهلام بأكملها ومتابعة تقلصها العياني مع مرور الوقت.
- استخدم هدف 10x / 0.3 Ph1 UPlanFL (جدول المواد) لتوصيف مسامية الشبكة وهيكلها ومتابعة التنظيم الذاتي للشبكة وانكماشها مع مرور الوقت.
ملاحظة: هذا الهدف مفيد أيضا لتوطين الركام الحركي للميوسين II داخل الشبكة ومتابعة حركة حبات الفلورسنت عبر مسام الهلام. يمكن استخدام التكبيرات الأعلى على حساب مجال رؤية منخفض ، وهو أكثر أهمية في وضع التصوير ثنائي اللون (جدول المواد).
- قم بإثارة العينات عند 488 نانومتر (حبات الأكتين / الفلورسنت) و 561 نانومتر (مجاميع محرك الميوسين / حبات الفلورسنت). احصل على الصور بسرعة 100 مللي ثانية لكل إطار باستخدام برنامج مخصص (جدول المواد) في وضع البث باستخدام كاميرا جهاز مضاعفة الشحنة الإلكترونية (EMCCD) (جدول المواد).
ملاحظة: يجب الحفاظ على شدة مصباح الفلورسنت (جدول المواد) عند أدنى قيمة ممكنة لتجنب تشبع الإشارة أثناء تقلص الشبكة. - تصوير متزامن بلونين
- استخدم هذا الوضع لغرضين: (i) الكشف عن توطين مجاميع محرك الميوسين داخل شبكة الأكتين ، و (i) توصيف تدفق المذيب الخارجي داخل وخارج أثناء تقلص الشبكة.
- قم بإثارة محركات الأكتين والميوسين II عند 488 نانومتر و 561 نانومتر ، على التوالي ، وسجل الصور في وقت واحد على كاميرا EMCCD (جدول المواد) باستخدام جهاز ثنائي الانبعاثات (جدول المواد). استخدم نفس نظام التصوير لتصوير جل الأكتين (488 نانومتر) وحبات الفلورسنت (561 نانومتر) في وقت واحد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم استخدام اثنين من أغطية الزجاج لكل تجربة. يتم تنظيف أغطية الزجاج وتخميلها باستخدام بوليمرات PEG. التخميل ضروري لمنع البروتينات القابلة للذوبان من الالتصاق بالأسطح الزجاجية في المراحل التجريبية المبكرة ولتقليل تفاعل شبكة التعاقد مع الجدران الزجاجية. يمكن أن يؤدي الفشل في تحقيق التخميل الجيد إلى انكماش غير فعال ، وفي الحالات القصوى ، يمكن أن يمنع تكوين شبكة الأكتين.
يصف الشكل 1 الخطوات الرئيسية الثلاث لإجراء المعالجة السطحية. وتشمل هذه الخطوات ما يلي: (ط) تنظيف ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا ، يتم استخدام نهج في المختبر لتوصيف ميكانيكا المواد الهلامية actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي ، وبشكل أعم ، من السيتوبلازم الخلوي ، الذي ثبت أنه يتصرف كمادة مساميةمرنة 3,5. تتميز ريولوجيا الهيكل الخلوي الخلوي (السيتوبلازم) بثابت انتشار مسامي مرن ، والذي يحدد المدة التي يستغرقها السائل الخلوي داخل الخلايا لإعادة التوزيع داخل الخلية بعد الإجهاد الميكانيكي المطبق. تم اقتراح الخلايا لاستخدام هذه الآلية لتنظيم شكلها
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر دينا أرانوفيتش على تنقية البروتين ووضع العلامات. G.L. ممتن لوزارة العلوم والتكنولوجيا والفضاء الإسرائيلية لمنحة جابوتنسكي للدكتوراه. تعرب A.B.G. عن امتنانها لمؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة 2101/20) ولوزارة العلوم والتكنولوجيا - دولة إسرائيل (منحة 3-17491) للدعم المالي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| (3-Mercaptopropyl) شركة Trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617 | مخزنة تحت الغلاف الجوي للأرجون عند 4 درجات ؛ ج |
| حمض الخليك | Bio-Lab المحدودة | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | مخفف مع DMSO ، مخزن تحت جو الأرجون عند -20 درجة ؛ ج |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | مخفف ب DMSO ، مخزن تحت الغلاف الجوي للأرجون عند -20 درجة ؛ ج |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | مخزنة في 4 درجات ؛ ج |
| شركة Catalase | Sigma -Aldrich | C9322 | يتم الاحتفاظ بزجاجة المخزون تحت جو جاف (هلام السيليكا) عند -20 درجة ؛ C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | يحفظ في ماء مللي كيو بعد معالجة سمكة الضاري المفترسة ويستخدم في غضون 3 أسابيع |
| الكرياتين كيناز | Roche Life Science Products | 10736988001 | محضرة طازجة في عازلة الجلايسين ، وتحفظ على الثلج ، وتستخدم في غضون 3 أيام. يتم الاحتفاظ بزجاجة المرق تحت جو جاف (هلام السيليكا) عند 4 درجات ؛ C |
| الكرياتين فوسفات | Roche Life Science Products | 10621714001 | عندما يذوب يجب أن تبقى عند -20 درجة ؛ C وتستخدم في غضون 3 أشهر. يتم الاحتفاظ بزجاجة المرق تحت جو الأرجون وتخزينها عند 4 درجات ؛ C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | عند الذوبان يجب أن تبقى عند -20 درجة ؛ C وتستخدم في غضون 3 أشهر |
| نظام التصوير المتزامن للعرض المزدوج | القياسات الضوئية | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP BIOMEDICALS | 195174 | |
| EM-CCD كاميرا | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD كاميرا | القياسات الضوئية | تطور دلتا | |
| الإيثانول | Bio-Lab المحدودة | 525050300 | |
| مصباح فلوراسينسين | راب الفلورسبرايت الكهروضوئية | ||
| YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | قطر 200 نانومتر |
| Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | عند الذوبان يجب أن تبقى عند -20 درجة ؛ C وتستخدم في غضون 3 أشهر. |
| الجلوكوز أوكسيديز | شركة سيجما ألدريتش | G7141 | محفوظة في -20 درجة ؛ C وتستخدم في غضون 3 أشهر. يتم الاحتفاظ بمسحوق المرق تحت جو الأرجون ويحتفظ به عند -20 درجة ؛ C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| بيروكسيد الهيدروجين | سيجما ألدريتش | 216763 | تخزينها في 4 درجات ؛ ج |
| شركة KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2< / sub> | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| المجهر | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | ميغاواط = 5000 د. مقسومة على دفعات صغيرة حسب الوزن. مخزنة تحت الغلاف الجوي للأرجون عند -20 درجة ؛ C |
| النيل الأحمر المجهري | Spherotech | FP-2056-2 | قطر 2300 نانومتر |
| الهدف (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL الفتحة العددية = 0.3 |
| الهدف (2.5x) | Leica Germany | 506304 | الفتحة العددية Plan-NEOFLUAR = 0.075 |
| فرن | WTC الموثق | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| حمض الكبريتيك | كارلو إربا | 410301 | |
| DV2 نظام التصوير المتزامن ثنائي القناة | القياسات الضوئية | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| UV-VIS مقياس الطيف | الضوئي Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1 & ndash ؛ 10 uL |
| MATLAB R2017b | MathWorks | قياس البيانات | |
| MetaMorph | الجزيئية | برنامج التحكم في نظام التصوير البصري ؛ القياس الكمي للبيانات (تحليل تتبع الجسيمات ، حجم شبكة الشبكة) |
المراجع
- Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
- Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
- Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
- Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
- Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
- Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
- Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
- Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
- Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
- Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005(2013).
- Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201(2009).
- Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413(2019).
- Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
- Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
- Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264(2006).
- Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
- Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615(2016).
- Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461(2018).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
- Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).
- Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
- Cheng, N. -S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
- Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907(2003).
- MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104(2008).
- Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092(2019).
- Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
