تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتشريح الدقيق للعين في القوارض. تتضمن العملية استئصال مقلة العين جنبا إلى جنب مع الغشاء النيكتيتي (أي الجفن الثالث). ثم يتبع ذلك فصل كؤوس العين الخلفية والأمامية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتضمن تشريح العين الدقيقة لعين القوارض تجزئة مقلة العين المنزوعة النواة مع الغشاء المتصل ، أو الجفن الثالث ، للحصول على أكواب العين الأمامية والخلفية. باستخدام هذه التقنية ، يمكن الحصول على الأجزاء الفرعية للعين ، بما في ذلك أنسجة القرنية والأنسجة العصبية والأنسجة الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE) والعدسة ، من أجل التركيب الكامل ، والتقسيم بالتبريد ، و / أو معلقات الخلية المفردة لنسيج عيني معين. يقدم وجود الجفن الثالث مزايا فريدة ومهمة ، لأنه يفيد في الحفاظ على اتجاه العين ، وهو أمر مهم لفهم فسيولوجيا العين بعد أي تدخل موضعي أو في الدراسات التي تنطوي على تحليل العين المتعلق بالتضاريس المكانية للعين.
في هذه الطريقة ، قمنا باستئصال مقلة العين في التجويف جنبا إلى جنب مع الجفن الثالث عن طريق قطع عضلات العين بعناية وببطء وقطع العصب البصري. تم ثقب مقلة العين من خلال حافة القرنية باستخدام microblade. تم استخدام الشق كنقطة دخول ، مما يسمح بالقطع على طول تقاطع القرنية الصلبة عن طريق إدخال مقص دقيق من خلال نقطة الشق. تم إجراء جروح صغيرة ومستمرة على طول المحيط حتى انفصلت الكؤوس. يمكن تشريحها بشكل أكبر عن طريق تقشير الطبقة الشفافة من الشبكية العصبية برفق باستخدام ملقط خياطة كوليبري للحصول على الشبكية العصبية وطبقات RPE. علاوة على ذلك ، تم إجراء ثلاثة / أربعة قطع متساوية البعد من المحيط بشكل عمودي على المركز البصري حتى تم الوصول إلى العصب البصري. فتح هذا الكؤوس نصف الكروية في شكل زهرة بحيث سقطت مسطحة ويمكن تركيبها بسهولة. تم استخدام هذه التقنية في مختبرنا لتركيب القرنية بالكامل وأقسام الشبكية. يحدد وجود الجفن الثالث الاتجاه الأنفي الصدغي ، والذي يسمح بدراسة تدخلات العلاج بالخلايا المختلفة بعد الزرع ، وبالتالي ، التحقق الفسيولوجي المستهدف الحيوي للتصور والتمثيل الدقيق في مثل هذه الدراسات.
المقدمة
تشريح العين هو تقنية مهمة في أبحاث العيون وقد سمح للباحثين بالوصول إلى أجزاء العين للدراسات المستهدفة. في السابق ، اعتمد باحثو العين على أنسجة العين من الأفراد المرضى في دراساتهم. ومع ذلك ، فإن العدد المتزايد تدريجيا من سلالات نماذج القوارض العينية1 على مر السنين قد قلل من الحاجة إلى أنسجة العين البشرية. سمحت سلالات الفئران هذه بفهم أعمق لأمراض العين والتدخلات. ومع ذلك ، فقد ولدوا أيضا الحاجة إلى تقنيات مبتكرة للتشريح الدقيق للعين. الحجم الصغير ومساحة التشغيل المحدودة يعيقان بشدة الوصول الفعال إلى الأجزاء الفرعية للعين. علاوة على ذلك ، نظرا للتجميع الخلوي المتجانس لأكواب العين الخلفية والأمامية ، من الصعب إجراء تدخلات مستهدفة بعد التسلخ. تقنيات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية التابعة للمعهد الوطني لعلم المناعة ، نيودلهي. الرقم المرجعي التسلسلي للموافقة هو IAEC # 480/18. تم إجراء التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية التنظيمية للجنة الرقابة والإشراف على التجارب على الحيوانات ، وزارة مصايد الأسماك وتربية الحيوانات ومنتجات الألبان ، حكومة الهند ، تحت إشراف طبيب بيطري محترف في SAF ، NII.
1. التحضير
- تمدد عيون القوارض باستخدام قطرة من 0.8 ٪ تروبيكاميد و 5 ٪ من محاليل العيون فينيليفرين في كل عين. ضع الحيوان في منطقة مظلمة لمدة 30 دقيقة قبل الإجراء.
ملاحظة: لا يلزم وجود مسكن حيث يتم القتل الرحيم للحيوان فور الانتهاء من 30 دقيقة. يس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إعداد مجموعة كاملة من أنسجة عين الفأر / القرنية rd1 لدراسة تكوين الأوعية اللمفاوية المحتملة في الأنسجة الأمامية / القرنية في حالة مرضية. كان نسيج الملتحمة المرفق من الجفن الثالث بمثابة عنصر تحكم إيجابي ، لأن القرنية تفتقر إلى الأوعية اللمفاوية. بالنسبة للدراسة ، تم تشريح أنسجة القرنية بالملتحمة وتم تثبيتها بنسبة 4٪ PFA ، تليها النفاذية والانسداد. ثم تم تلطيخ الأنسجة بجسم مضاد أولي ضد علامة البطانة اللمفاوية (LYVE1)9. تبع ذلك حضانة بجسم مضاد ثانوي يحمل علامة Alexa Fluor 488 (أخضر). تم التقاط الص.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم العثور على تشريح العين المجهري لتكون مهمة صعبة بسبب صغر حجم وشكل كروية لعين القوارض ، وتتطلب عين القوارض تقنيات مبتكرة للتعامل الفعال8.
في الطريقة الموضحة الحالية ، يتم الحصول على مقلة عين الفأر المنزوعة النواة مع الجفن الثالث المتصل للتعامل الفعال والسهل. باستخدام الجفن الثالث ، يمكن تجميد مقلة العين تماما ، مما يسمح للتشريح بالمضي قدما بسهولة وبأقل قدر من الأخطاء. علاوة على ذلك ، فإن وجود الجفن الثالث يحدد اتجاه الأجزاء الفرعية للعين. وبالتالي ، يتم تشريح مقلة الع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
قام الدكتور ألاكناندا ميشرا ، قسم بيولوجيا الخلية والتشريح البشري ، جامعة كاليفورنيا ديفيس ، الولايات المتحدة الأمريكية ، بتدريبنا على هذه الطريقة في المعهد الوطني لعلم المناعة ، نيودلهي. وقد دعم هذا العمل بالمنحة الأساسية التي تلقاها من إدارة التكنولوجيا الأحيائية بحكومة الهند إلى المعهد الوطني لعلم المناعة في نيودلهي. تم منح PS زمالة بحثية من قبل قسم التكنولوجيا الحيوية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أسيتامينوفين (بيوسيتامول) | EG Pharmaceuticals | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| مجموعة الفوسفاتيز القلوية (DEA) النظام | السريري المرجاني ، الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| محلل آلي | توليب ، ألتو سانتراكروز ، الهند | محلل | الكيمياء الحيوية للاختبار الوظيفي للكبد |
| البيتادين ( محلول بوفيدون اليود) | وين-ميديكير; الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| خزانة السلامة البيولوجية (الفئة الأولى) | كارتوس الدولية؛ الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) مجهر | |
| المجال الساطع | أوليمبوس ، اليابان | LX51 | |
| CBA / J الفئران الفطرية | مختبر جاكسون | رقم الأسهم 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; حقن الصوديوم سيفوتاكسيم الهند | ، لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| مصفاة الخلية | سيجما ؛ الولايات المتحدة | CLS431752 | |
| كولاجيناز النوع الأول | Gibco من Life Technologies | 17100-017 | |
| براعم القطن | Pure Swabs Pvt Ltd ؛ الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) DPX | |
| Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| ورقة الستارة | JSD الجراحية ، دلهي ، الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| محلول Eosin Y ، | سيجما الكحولي ؛ الولايات | المتحدة HT110132 | |
| الملقط | الجراحي الكبرى; الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| نظام التخدير بالغاز | Ugo Basile ؛ إيطاليا | 211000 | |
| جلوكوز | هيميديا ، الهند | GRM077 | |
| كريم إزالة الشعر (Veet) ريكيت | بينكيزر ، الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) محلول | |
| الهيماتوكسيلين ، مايرز | سيجما ؛ الولايات المتحدة | MHS16 | |
| ملح الصوديوم الهيبارين | هيميديا; الهند | RM554 | |
| hyaluronidase من الخصيتين الأغنام | سيجما ; الولايات المتحدة | H6254 | |
| IV قنية (Plusflon) | Mediplus ، الهند | المرجع 1732411420 | |
| محااقن الأنسولين | BD ؛ الولايات المتحدة | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | استنشاق الكيتامين |
| المخدر (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | الكيتامين هيدروكلوريد IP, لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) حاملات | |
| الإبر الصغيرة مستقيمة ومنحنية | مرسيان ؛ إنجلترا | BS-13-8 | |
| حاملات الإبرة الصغيرة على التوالي & منحني | Mercian ; إنجلترا | BS-13-8 | |
| مختبرات Microtome Histo-Line ، إيطاليا | MRS3500 | ||
| خيط النايلون | العظيم ؛ الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| بارافورمالدهايد | هيميديا ؛ الهند | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears / Eyemist Gel | Allergan India Private Limited / Sun Pharma ، الهند | P3060 | لا يوجد رقم كتالوج محدد |
| RPMI | Himedia ؛ الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| مشرط | الجراحات الكبرى; الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| مقص | العمليات الجراحية الرئيسية. الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| SGOT (ASAT) KIT | CLINICAL SYSTEM ، الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| SGPT (ALAT) KIT | CORALAL CLINICAL SYSTEM ، الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ؛ الولايات المتحدة | لا يوجد رقم كتالوج محدد | |
| السكروز | سيجما ; الولايات المتحدة | S0389 | |
| الشفرة الجراحية رقم 22 | La Medcare ، الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| اللوحة الجراحية | محليا | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| الشريط الأبيض الجراحي | 3M الهند ؛ الهند | 1530-1 | الشريط الجراحي Micropore |
| Ethicon و Johnson & amp جونسون ، الهند | NW 5047 | ||
| محاقن (1 مل ، 26 جم) | ديسبو فان ؛ الهند | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| ماكينة التشذيب (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| ماكينة الوزن | Braun | لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) | |
| William's E Media | Himedia; الهند | AT125 | |
| زيلازين (زيلاكسين) الهندي | المناعي المحدود | مهدئ ، قبل التخدير ، مسكن ومرخي للعضلات |
المراجع
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
