Method Article

بروتوكول تطهير فعال لدراسة تطور البذور في الطماطم (Solanum lycopersicum L.)

DOI:

10.3791/64445

⸱

September 7th, 2022

 ,  , 
1Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, 2College of Life Science, University of Chinese Academy of Sciences, 3Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر بذور الطماطم نموذجا مهما لدراسة علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي أثناء تكاثر النبات. هذا البروتوكول مفيد لإزالة بذور الطماطم في مراحل النمو المختلفة لمراقبة البنية الجنينية الدقيقة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطماطم (Solanum lycopersicum L.) هي واحدة من المحاصيل النقدية الرئيسية في جميع أنحاء العالم. تعتبر بذور الطماطم نموذجا مهما لدراسة علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي أثناء تكاثر النبات. غالبا ما يتم إعاقة تصور البنية الجنينية الدقيقة داخل بذور الطماطم عن طريق صمغ معطف البذور ، والتكامل متعدد الطبقات ، والسويداء السميك الجدران ، والذي يحتاج إلى حل عن طريق التضمين الشاق. البديل الأبسط هو استخدام تقنيات إزالة الأنسجة التي تحول البذور شبه شفافة باستخدام عوامل كيميائية. على الرغم من أن إجراءات المقاصة التقليدية تسمح برؤية عميقة للبذور الأصغر ذات طبقة البذور الرقيقة ، إلا أن إزالة بذور الطماطم لا تزال تمثل تحديا تقنيا ، خاصة في مراحل النمو المتأخرة.

يظهر هنا بروتوكول تطهير سريع وموفر للعمالة لمراقبة نمو بذور الطماطم من 3 إلى 23 يوما بعد الإزهار عندما يكون التشكل الجنيني على وشك الاكتمال. تجمع هذه الطريقة بين محلول المقاصة القائم على هيدرات الكلورال المستخدم على نطاق واسع في أرابيدوبسيس مع تعديلات أخرى ، بما في ذلك إغفال تثبيت الفورمالين - الأسيتو - الكحول (FAA) ، وإضافة معالجة هيبوكلوريت الصوديوم للبذور ، وإزالة صمغ معطف البذور المخفف ، والغسيل والمعالجة بالتفريغ. يمكن تطبيق هذه الطريقة للإزالة الفعالة لبذور الطماطم في مراحل النمو المختلفة وهي مفيدة في المراقبة الكاملة لعملية تطوير البذور الطافرة بدقة مكانية جيدة. يمكن أيضا تطبيق بروتوكول المقاصة هذا على التصوير العميق للأنواع الأخرى المهمة تجاريا في Solanaceae.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطماطم (S. lycopersicum L.) هي واحدة من أهم محاصيل الخضروات في جميع أنحاء العالم ، حيث يبلغ إنتاجها 186.8 مليون طن من الفواكه السمين من 5.1 مليون هكتار في عام 20201. ينتمي إلى عائلة Solanaceae الكبيرة مع حوالي 2716 نوعا2 ، بما في ذلك العديد من المحاصيل المهمة تجاريا مثل الباذنجان والفلفل والبطاطس والتبغ. الطماطم المزروعة هي نوع ثنائي الصيغة الصبغية (2n = 2x = 24) بحجم جينوم يبلغ حوالي 900 ميجا بايت3. لفترة طويلة ، تم بذل جهد كبير نحو تدجين الطماطم وتكاثرها عن طريق اختيار السمات المرغوبة من Solanum spp. هناك أكثر من 5000 مدخل طماطم مدرج في مركز موارد علم الوراثة للطماطم ويتم تخزي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الحلول

  1. قم بإعداد مثبت FAA بإضافة 2.5 مل من 37٪ فورمالديهايد ، و 2.5 مل من حمض الخليك الجليدي ، و 45 مل من 70٪ إيثانول في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. دوامة وتخزينها في 4 درجة مئوية. تحضير مثبت FAA طازجا قبل الاستخدام مباشرة.
    تنبيه: 37٪ فورمالديهايد مادة أكالة ويحتمل أن تكون مسرطنة إذا تعرضت أو استنشقت. يجب إجراء المثبت في غطاء دخان أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  2. تحضير محلول المقاصة بإضافة 5 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ ، و 40 جم من هيدرات الكلورال ، و 10 مل من الماء المقطر في زجاجة زجاجية سعة 100 مل ملفوفة بورق القصدير. يذوب باستخدام محرك مغناطيسي طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين المحلول المحضر عند ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عندما تم إزالة بذور الطماطم باستخدام طريقة تقليدية كما هو الحال في Arabidopsis ، منعت خلايا السويداء الكثيفة تصور أجنة الطماطم المبكرة عند 3 DAF و 6 DAF (الشكل 3 أ ، ب). مع زيادة الحجم الكلي للجنين ، كان الجنين الكروي بالكاد يمكن تمييزه عند 9 DAF (الشكل 3C). ومع ذلك ، مع استمرار زيادة حجم البذور ، انخفضت نفاذيتها ، مما أدى إلى جنين قلب غامض عند 12 DAF (الشكل 3D). من 13 DAF فصاعدا ، أصبح صمغ البذور ومعطف الب.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالمقارنة مع التقسيم الميكانيكي ، تعد تقنية المقاصة أكثر فائدة للتصوير ثلاثي الأبعاد لأنها تحتفظ بسلامة الأنسجة أو الأعضاء النباتية16. غالبا ما تقتصر بروتوكولات المقاصة التقليدية على عينات صغيرة بسبب سهولة اختراق المحاليل الكيميائية. تعتبر بذور الطماطم عينة إشكالية لإزالة الأنسجة لأنها أكبر بحوالي 70 مرة من حجم بذور أرابيدوبسيس ولديها حواجز نفاذية أكبر. يتكون معطف بذور أرابيدوبسيس من أربع إلى خمس طبقات من الخلايا الحية مشتقة من التكامل الخارجي والتكامل الداخلي24.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرب المؤلفون عن امتنانهم للدكتور جي لو والدكتور Xiufen Song لاقتراحاتهما المفيدة حول مجهر تباين التداخل التفاضلي وطريقة المقاصة التقليدية ، على التوالي. تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31870299) وجمعية تشجيع الابتكار للشباب التابعة للأكاديمية الصينية للعلوم. تم إنشاء الشكل 2 باستخدام BioRender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,000 & ميكرو; L ماصةجيلسونFA10006M
1,000 & ميكرو; L نصائح ماصةCorningT-1000-B
2 مل أنبوب الطردالمركزي AxygenMCT-200-C
37٪ الفورمالديهايدDAMAO685-2013
5,000 & micro ؛ L ماصةEppendorf3120000275
5,000 & micro; L ماصة نصائحbiosharpBS-5000-TL
50 مل أنبوب الطرد المركزيCorning430829
الإيثانول المطلقBOYUAN678-2002
زجاجةزجاجية فيشرFB800-100
كلورال هيدراتميريرM13315-100G
CoverslipLeica384200
مجهر DICZeissAxio Imager A110x و 20x و 40x
مطهرالتكبير QIKELONGAN17-9185
إبرةBioroyee17-9140
تربة المغذياتملقط FANGJIE
HAIOU4-94
حمض الخليك الجليديBOYUAN676-2007
الجلسرينSolarbioG8190
النمام المغناطيسيIKARET مركز
مايكرو تومLA3911
شاكر مداريQILINBEIERQB-206
ركيزة البذرPINDSTRUPLV713 / 018-LV252الفحص: 0-10 مم
شريحة مقعرة واحدةHUABODEYIHBDY1895
شريحةLeica3800381
مجهر مجسمLeicaS8 APO1x إلى 4x تكبير
رقائق القصديرZAOWUFANG613
Tween 20SigmaP1379
مضخة فراغSHEDINGSHB-III
دوامة مترSilogexMX-S
تشريح زهرة موارد علم الوراثة بالطماطم الأساسي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
  2. Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
  3. Consortium, T. G.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tomato Seed ClearingSeed DevelopmentTissue ClearingSodium Hypochlorite TreatmentSeed Coat MucilageEmbryo VisualizationDifferential Interference ContrastVacuum TreatmentEndosperm CellsSolanum Lycopersicum

Related Articles