Method Article

طريقة قابلة للتطوير قائمة على الخلايا للتقييم الوظيفي لمتغيرات Ube3a

DOI:

10.3791/64454

⸱

October 10th, 2022

 , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير طريقة بسيطة وقابلة للتطوير لتقييم الأهمية الوظيفية للمتغيرات الخاطئة في Ube3a ، وهو جين يرتبط فقدانه واكتسابه لوظيفته بكل من متلازمة أنجلمان واضطراب طيف التوحد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى الاستخدام المتزايد للتسلسل في الطب إلى تحديد ملايين المتغيرات المشفرة في الجينوم البشري. تحدث العديد من هذه المتغيرات في الجينات المرتبطة باضطرابات النمو العصبي ، لكن الأهمية الوظيفية للغالبية العظمى من المتغيرات لا تزال غير معروفة. يصف البروتوكول الحالي دراسة المتغيرات ل Ube3a ، وهو جين يشفر E3 ubiquitin ligase المرتبط بكل من التوحد ومتلازمة Angelman. يرتبط تكرار أو ثلاثة أضعاف Ube3a ارتباطا وثيقا بالتوحد ، في حين أن حذفه يسبب متلازمة أنجلمان. وبالتالي ، فإن فهم تكافؤ التغيرات في نشاط بروتين UBE3A مهم للنتائج السريرية. هنا ، يتم وصف طريقة سريعة قائمة على الخلايا تقرن متغيرات Ube3a مع مراسل مسار Wnt. هذا الفحص البسيط قابل للتطوير ويمكن استخدامه لتحديد التكافؤ وحجم تغيرات النشاط في أي متغير Ube3a . علاوة على ذلك ، فإن تسهيل هذه الطريقة يسمح بتوليد ثروة من معلومات وظيفة الهيكل ، والتي يمكن استخدامها لاكتساب رؤى عميقة في الآليات الأنزيمية ل UBE3A.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جعلت التطورات التكنولوجية الحديثة تسلسل الإكسومات والجينوم روتينيا في البيئات السريرية 1,2. وقد أدى ذلك إلى اكتشاف عدد كبير من المتغيرات الجينية ، بما في ذلك الملايين من المتغيرات الخاطئة التي عادة ما تغير حمضا أمينيا واحدا في البروتين. لا يزال فهم الأهمية الوظيفية لهذه المتغيرات يمثل تحديا ، ولا يوجد سوى جزء صغير (~ 2٪) من المتغيرات الخاطئة المعروفة لها تفسير سريري 1,3.

ومن الأمثلة البارزة على هذه المشكلة Ube3a ، وهو جين يشفر E3 ubiquitin ligase الذي يستهدف بروتينات الركيزة للتحلل4. يوجد Ube3a داخل الكروموسوم 15q11-13 ويتم التعبير عنه حصريا من الأليلالموروث من الأم 5،6،7. تشير الملاحظات من علم الوراثة المرضية بقوة إلى أن النشاط غير الكافي أو المفرط لإنزيم UBE3A يسبب اضطرابات نمو عصبي متميزة. يؤدي حذف كروموسوم الأم 15q11-13 إلى متلازمة أنجلمان (AS) 8 ، وهو اضطراب يتميز بإعاقة ذهنية شديدة ، وإعاقات حركية ، ونوبات ، وسلوك سعيد مع ابتسامة متكررة ، وملامح وجه مشوهة8،9،10. في المقابل ، يؤدي الازدواجية أو المضاعفة الثلاثية لكروموسوم الأم 15q11-13 إلى متلازمة Dup15q ، وهي حالة غير متجانسة معترف بها كواحدة من أكثر أشكال التوحد انتشارا11،12،13. بالإضافة إلى ذلك ، هناك المئات من المتغيرات الخاطئة التي تم تحديدها في Ube3a ، والتي يعتبر معظمها متغيرات ذات أهمية غير مؤكدة (VUS) لأن أهميتها الوظيفية والسريرية غير معروفة. وبالتالي ، هناك اهتمام كبير بتطوير طرق يمكنها تقييم متغيرات Ube3a تجريبيا لتحديد ما إذا كانت تساهم في مرض النمو العصبي.

ينتمي إنزيم UBE3A إلى عائلة مجال HECT (المتماثلة مع E6-AP C-terminus) من أربطة E3 ubiquitin التي تمتلك جميعها مجال HECT المسمى ، والذي يحتوي على الآلات الكيميائية الحيوية اللازمة لقبول ubiquitin المنشط من إنزيمات E2 ونقله إلى بروتينات الركيزة14. تاريخيا ، اعتمد توصيف إنزيمات E3 على الأنظمة المعاد تشكيلها في المختبر والتي تتطلب مجموعة من البروتينات المنقاة4،15،16. هذه الأساليب بطيئة وكثيفة العمالة وغير قابلة لتقييم نشاط عدد كبير من المتغيرات. في العمل السابق ، تم تحديد UBE3A لتنشيط مسار Wnt في خلايا HEK293T عن طريق تعديل وظيفة البروتيازوم لإبطاء تدهور β-catenin17. تسمح هذه الرؤية باستخدام مراسلي مسار Wnt كطريقة فعالة وسريعة لتحديد كل من متغيرات الخسارة والكسب الوظيفي ل Ube3a18. يصف البروتوكول أدناه بالتفصيل طريقة لإنشاء متغيرات Ube3a بالإضافة إلى مراسل قائم على luciferase لتقييم التغييرات في نشاط متغيرات Ube3a.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. استنساخ الطفرات لتوليد متغيرات Ube3a

  1. استنساخ جميع متغيرات Ube3a في بلازميد pCIG2 (الشكل 1A) ، وهو ناقل bicistronic يحتوي على محفز β-actin الدجاج وموقع دخول الريبوسوم الداخلي (IRES) لتعبير EGFP19. تحتوي بنيات Ube3a كاملة الطول على تسلسل علامة Myc الطرفية N ويتم استنساخها في pCIG2 باستخدام موقع SacI 5 'وموقع XmaI 3 '. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا استخدام مواقع EcoRI و EcoRV و PstI التي تحدث بشكل طبيعي ضمن تسلسل ترميز Ube3a لاستنساخ الأجزاء.
    ملاحظة: يمكن الحصول على المتغيرات غير المحددة ل Ube3a من خلال الأدبيات وفي المستودعات المتاحة للجمهور مثل قاعدة بيانات ClinVar1. يمكن الحصول على متغيرات إضافية لم يتم الإبلاغ عنها من خلال التواصل الشخصي مع المراكز الطبية.
  2. استخدم طريقة الطفرات الضخمةالمعدلة المكونة من خطوتين 20 لإدخال طفرات في إطار قراءة Ube3a . في الخطوة الأولى ، صمم قليل النوكليوتيد المطفر الذي يحتوي على الطفرة المطلوبة (المثال الموضح في هذا البروتوكول هو إنشاء متغير UBE3A Q588E) محاطا بما لا يقل عن 30 زوجا أساسيا (bp) من التماثل 5 ′ و 3 ′ إلى الطفرة (الشكل 1B والجدول 1).
  3. استخدم قليل النوكليوتيد المطفر جنبا إلى جنب مع قليل النوكليوتيد التكميلي للجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد 200-400 نقطة أساس ميغابريمر يحتوي على الطفرة (الشكل 1C; الجدول 2 والجدول 3). استخدم كامل 50 ميكرولتر من حجم تفاعل PCR للرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز باستخدام هلام 1٪ وتنقية هلام لاحقة (جدول المواد). قم بإخراج منتج PCR في 30 ميكرولتر من H 2 O منزوع الأيونات (diH2O) للاستخدامفي الجولة الثانية من خطوة PCR أدناه.
  4. قم بإعداد الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح (الشكل 1C ؛ الجدول 2 والجدول 3). ستولد هذه الخطوة شظايا أكبر من الحمض النووي (عادة ~ 1-1.5 كيلو بايت في الطول) تحتوي على مواقع الطفرة والتقييد النهائي المناسبة للاستنساخ الفرعي (الشكل 1C).
  5. بعد الانتهاء من تفاعل PCR ، قم بتنقية المنتج الناتج باستخدام مجموعة تنقية PCR (جدول المواد). قم بالتخلص من 30 ميكرولتر واهضم كل المنتج المنقى وبناء pCIG2 Ube3a WT مع إنزيمات التقييد المناسبة (يوضح المثال الهضم باستخدام EcoRI و XmaI).
  6. بعد 2 ساعة من الهضم عند 37 درجة مئوية ، قم بحل منتجات الهضم من خلال الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز (1٪ هلام) ، وتنقية المنتجات المناسبة. قم بإعداد الأربطة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (جدول المواد) ، وقم بتحويل منتجات الربط إلى سلالة بكتيرية DH10B (جدول المواد) ، ثم قم بلوحة مع اختيار الأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل).
  7. في اليوم التالي ، اختر مستعمرتين إلى أربع مستعمرات لتلقيح 3 مزارع مل تحتوي على مرق لوريا (LB) و 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. دع الثقافات تنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة مدارية مع اهتزاز (225 دورة في الدقيقة).
  8. في اليوم التالي ، استخدم 1-1.5 مل من الثقافة البكتيرية لتحضير الحمض النووي البلازميد (جدول المواد). احفظ الثقافة المتبقية بوضعها في 4 درجات مئوية. فحص البلازميدات المصغرة عن طريق تسلسل سانجر باستخدام قليل النوكليوتيد الذي يربط ~ 200 bp من الطفرة المطلوبة.
  9. استخدم المزارع البكتيرية المحفوظة عند 4 درجات مئوية لإعادة تلقيح مزارع 50 مل ل midiprep البلازميد الصحيح (جدول المواد). تسلسل تسلسل ترميز Ube3a بالكامل للتحقق من صحة التسلسل الصحيح للحمض النووي.
  10. قم بإنشاء مخزون عامل من البلازميدات المتغيرة Ube3a ، بالإضافة إلى المراسل المنشط β-catenin (BAR) 21 ، TK-Renilla luciferase ، Ube3a الميت (طفرة UBE3A C820A) ، وناقل pCIG2 الفارغ بتركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام H2O المعقم لخطوات النقل اللاحقة.

2. تحضير ونقل خلايا الكلى الجنينية البشرية 293T (HEK293T)

  1. قم بإجراء المقايسات في خلايا HEK293T المزروعة في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل مسبقا بالجلوتامين ، ومصل البقر الجنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، وعامل مضاد حيوي مضاد للميكروبات كما هو موضح سابقا17. تنمو الخلايا في حاضنة معقمة ومرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. باستخدام خزانة السلامة الحيوية ، قم أولا بطلاء خلايا HEK293T المعلقة على ألواح مسطحة القاع المعالجة بزراعة الأنسجة 96 بئرا بكثافة 2.2 × 104 خلايا لكل بئر في 100 ميكرولتر من وسائط الاستزراع والسماح لها بالنمو بين عشية وضحاها.
  3. في اليوم الثاني ، قم بنقل الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام بلازميدات مراسل Firefly و Renilla luciferase (الجدول 4) وبلازميدات Ube3a في ثلاث نسخ. إجراء عمليات النقل في 10 ميكرولتر من الحجم الكلي لكل بئر باستخدام نسبة 10: 1: 8 من البلازميدات (50 نانوغرام من BAR ، و 5 نانوغرام من TK-Renela ، و 40 نانوغرام من بلازميد Ube3a لكل بئر ، على التوالي) ، كما هو موضح سابقا18 ، و 0.4 ميكرولتر من كاشف النقل (الجدول 4).
    ملاحظة: لكل تجربة ، يتم أيضا نقل متجه فارغ (GFP فقط) و Ube3a الميت بترميز البلازميد ليكون بمثابة عناصر تحكم سلبية.
  4. قم بإنشاء مزيج رئيسي لعمليات النقل لكل متغير في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل (الجدول 4) واحتضانه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتحريك خليط النقل برفق عن طريق النقر على الأنبوب ، ثم أضف 10 ميكرولتر من خليط النقل مباشرة إلى وسائط النمو الموجودة في الآبار.
  5. بعد ذلك ، أعد الخلايا إلى الحاضنة واترك البلازميدات تعبر لمدة 48 ساعة. استبدال وسائط النمو ليس ضروريا.
  6. مراقبة كفاءة النقل عن طريق مضان GFP باستخدام مجهر مضان. يتم نقل خلايا HEK293T بكفاءة بهذه الطريقة ، ويجب أن تعبر >80٪ من الخلايا عن GFP بعد 48 ساعة.

3. قياس نشاط لوسيفيراز

ملاحظة: يتم تقييم نشاط لوسيفيراز باستخدام نظام متاح تجاريا يقوم بفحص كل من Firefly و Renilla luciferase (جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

  1. استنشاق وسائط الاستزراع بعناية من خلايا HEK293T المنقولة ، ثم اغسل الخلايا بمحلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS). قم بشفط PBS وقم بتحليل الخلايا بإضافة 25 ميكرولتر من محلول التحلل غير المعطل واحتضانه لمدة 15 دقيقة مع هزاز لطيف على الجليد.
  2. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولتر من المحللة الناتجة (لا يلزم الطرد المركزي) إلى لوحة فحص جديدة مكونة من 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من كاشف ركيزة لوسيفيراز Firefly. امزج الطبق برفق عن طريق النقر.
  3. قم بتحميل اللوحة على قارئ لوحة وقم بقياس التلألؤ باستخدام كاشف علوي بارتفاع قراءة 1 مم ووقت تكامل يبلغ 1 ثانية.
    ملاحظة: قد يلزم ضبط كسب الكاشف بناء على قوة الإشارة.
  4. مباشرة بعد قراءة تلألؤ لوسيفيراز اليراع ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة رينيلا لوسيفيراز إلى الآبار. هذه الخطوة في نفس الوقت تروي نشاط لوسيفيراز اليراع أثناء تقييم نشاط رينيلا لوسيفيراز. امزج العينات عن طريق التقليب اللطيف للوحة وقياس التلألؤ مرة أخرى لتقييم نشاط رينيلا لوسيفيراز.
    ملاحظة: بينما يمكن استخدام لوحات أخرى لهذا الفحص ، فإن استخدام الألواح ذات الإطارات السوداء والآبار البيضاء سيوفر النتائج الأكثر حساسية لأن هذا يضخم إشارة لوسيفيراز مع تقليل الضوضاء.
  5. حدد استجابات المراسل كنسبة لوسيفيراز اليراع إلى رينيلا لوسيفيراز (Firefly / Renilla) ، ومتوسط قيم القياسات الثلاثية. بعد ذلك ، قم بتطبيع قيمة Firefly / Renilla لكل متغير مقابل قيم الخلايا المعبرة عن Ube3a من النوع البري (WT) لمقارنة النشاط النسبي للبروتينات المتغيرة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد الفحص الوظيفي واسع النطاق لمتغيرات Ube3a الخاطئة مشهدا واسعا من طفرات فقدان واكتساب الوظيفة
اقترح العمل السابق مع طفرات Ube3a أن استجابة Wnt يمكن أن تكون بمثابة مراسل لنشاط بروتين UBE3A الخلوي. تم توسيع هذه الملاحظات ، وتم إجراء تجارب تحقق إضافية للتحقق مما إذا كان اختبار BAR مناسبا للإبلاغ عن مجموعة من أنشطة UBE3A في الخلية. أولا ، تم نقل خلايا HEK293T بكميات متفاوتة من الحمض النووي البلازميد الذي يشفر WT Ube3a البشري. أظهرت هذه التجربة أن استجابة BAR تتغير خطيا مع كمي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة فعالة وقابلة للتطوير لتقييم النشاط الأنزيمي لمتغيرات Ube3a. هناك العديد من التفاصيل الفنية التي تتطلب دراسة متأنية عند استخدام هذا الفحص. أحد الاعتبارات هو اختيار بلازميدات مراسل Wnt المستخدمة في هذا الفحص. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا على وجه التحديد المراسل المنشط β-catenin (BAR)21 ، وهو مراسل يحتوي على سلسلة من 12 عنصر استجابة لعامل الخلايا التائية (TCF) مفصولة بتسلسلات رابط مصممة خصيصا لتقليل إعادة التركيب وفقدان مواقع ربط TCF. هناك بلازميدات مراسل W...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل جائزة مؤسسة سيمونز جسر إلى الاستقلال (جائزة SFARI #387972; J.J.Y.) ، وجائزة NARSAD للباحثين الشباب من مؤسسة أبحاث الدماغ والسلوك (JJY) ، وزمالة بحثية من مؤسسة Alfred P. Sloan (JJY) ، ومنح بحثية من مؤسسة Angelman Syndrome Foundation (JJY) ، ومؤسسة Whitehall (J.J.Y.) ، و NIMH (R01MH122786; ج. ج. ي.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.05٪ Trypsin-EDTA (1x) ، الفينول الأحمرGibco25300-054
1 كيلو بايت سلم الحمض النوويLambda BiotechM108-S
100 نقطة أساس سلم الحمض النوويLambda BiotechM107
10x عازلة ل T4 DNA Ligase مع 10 ملي مولار ATPنيو إنجلاند BioLabsB0202A
5x Phusion HF Reaction BufferNew England BioLabsB0518S
محلول مضاد للمضادات الحيوية ومضاد للفطرياتCorning30004CI
أسود / أبيض Isoplate-96 إطار أسود صفيحة بئر بيضاءPerkinElmer6005030
Carbenicillin ملح ثنائي الصوديومالغرب الأوسط العلميKCC46000-5
غرفة عد خلايا الكونتيسة   شرائحInvitrogen by Thermo Fisher ScientificC10283
Countess II عداد الخلية الآلي تقنياتآلة عد الخلايا
مخصص DNA oligosتقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) محلول
Deoxynucleotide (dNTP) مزيجNew England BioLabsN0447S
DMEM ، ارتفاع نسبة الجلوكوز ، مكمل GlutaMAX ، البيروفاتجيبكو10569044الوسط القاعدي لدعم نمو خط الخلية
HEK293T DPBS (1x)Gibco14190-136
نظام فحص مراسل لوسيفيرازمزدوج PromegaE1910
EcoRI-HF نيو إنجلاند BioLabsR3101Sإنزيم تقييد
مصل الأبقار الجنيني ، مؤهل ، معطل بالحرارةجيبكو16140071مصل بقري الجنين
فيشربراند أطباق زراعة الأنسجة المعالجة السطحيةفيشربراندFB012924
FuGENE 6 كاشف التعداءPromegaE2691
هلام تحميل صبغة أرجوانية (6x)نيو إنجلاند BioLabsB7024A
خلايا HEK293TATCCCRL-3216
عالية الكفاءة ig 10B الخلايا المختصة كيميائياسليمة الجينوم1011-12بكتريا قولونية خلايا DH10B
HiSpeed Plasmid Midi KitQiagen12643Midi prep
pCIG2 البلازميد
pGL3 BAR البلازميد
Phusion HF DNA PolymeraseNew England BioLabsM0530LDNA polymerase
ProFlex 3 × 32 well PCR نظامالحيوية التطبيقية بواسطة Life TechnologiesThermocycler
pTK Renilla بلازميد
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250)Qiagen28706تنقية
الجلطقم تنقية QIAquick PCR (250)Qiagen28106تنقية PCR
rCutSmart BufferNew England BioLabsB6004S
SacI-HFNew England BioLabsR3156Sإنزيم التقييد
Synergy HTX Multi-Mode ReaderBioTek  يقوم قارئ الألواح بتشغيل برنامج Gen5 v3.08 (BioTek)
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202LLigase
TAE Buffer و Tris-Acetate-EDTA و 50x Solution و ElectrophoreseFisher ScientificBP13324
Tissue Culture Plate 96 بئرا ، Flat BottomFisherbrandFB012931
UltraPure Ethidium Bromide SolutionInvitrogen بواسطة Thermo Fisher Scientific15585011
XmaINew England BioLabsR0180Sإنزيم التقييد
الحياة الأنظمة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
  2. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  3. Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
  4. Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
  5. Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
  6. Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
  7. Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
  8. Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
  9. Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
  10. Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
  11. Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
  12. Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
  13. de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
  14. Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
  15. Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
  16. Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
  17. Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
  18. Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809(2021).
  19. Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30(2011).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
  22. Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
  23. Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
  24. Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
  25. Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
  26. Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ube3a VariantsFunctional AssessmentUbiquitin LigaseAngelman SyndromeAutism SpectrumCell Based AssayHEK293T CellsLuciferase ReporterBAR AssayMutational Analysis

Related Articles