مقالة منهجية

تحديد مدة المرحلة S باستخدام 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Inincorporated في Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/64490

⸱

أكتوبر 21, 2022

 ,  , 
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا بروتوكولين متكاملين لتحديد مدة الطور S بدقة في S. cerevisiae باستخدام EdU ، وهو نظير ثيميدين ، والذي تم دمجه في الجسم الحي واكتشافه باستخدام كيمياء النقر عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي. يسمح بالتوصيف السهل لمدة تكرار الحمض النووي وعيوب النسخ المتماثل التي تم التغاضي عنها في الطفرات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تضاعف الحمض النووي حقيقي النواة هو عملية منظمة للغاية تضمن تكرار المخطط الجيني للخلية بشكل صحيح قبل فصل الكروموسومات. نظرا لأن عيوب تخليق الحمض النووي تكمن وراء إعادة ترتيب الكروموسومات ، فقد أصبحت مراقبة تكرار الحمض النووي ضرورية لفهم أساس عدم استقرار الجينوم. Saccharomyces cerevisiae هو نموذج كلاسيكي لدراسة تنظيم دورة الخلية ، ولكن لا يزال من الصعب تحديد معلمات تكرار الحمض النووي الرئيسية ، مثل جزء الخلايا في المرحلة S أو مدة المرحلة S. يستخدم هذا البروتوكول نبضات قصيرة وغير سامة من 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، وهو نظير ثيميدين ، في خلايا خميرة TK-hENT1 المهندسة ، متبوعا باكتشافه عن طريق تفاعل النقر للسماح بتصور وقياس تكرار الحمض النووي بدقة مكانية وزمانية عالية على مستوى الخلية الواحدة والسكان عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي. قد تحدد هذه الطريقة العيوب التي تم تجاهلها سابقا في المرحلة S وتطور دورة الخلية لمتحولات الخميرة ، مما يسمح بتوصيف لاعبين جدد ضروريين لضمان استقرار الجينوم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم ضمان استقرار الجينوم من خلال الانقسام الانقسامي من خلال نقل مجموعة كاملة ومتساوية من الكروموسومات إلى ذريتي الخلية المنتجتين. يعتمد هذا على الإكمال الدقيق لسلسلة من الأحداث التي تحدث في وقت معين في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. في G 1 ، يتم ترخيص أصول النسخ المتماثل عند توظيف العديد من عوامل الترخيص ، بما في ذلك Cdc61. في المرحلة S ، يبدأ تكرار الجينوم الكامل من أصول النسخ المتماثل النشطة المتعددة ويتم تنفيذه بواسطة أجهزة النسخ المتماثل التي تتجمع في بؤر مرئية مجهريا تسمى مصانع النسخ المتماثل2. في المرحلة M ، يتم ربط الكروماتيدات الشقيقة المتضاعفة وثنائية الاتجاه على المغزل الانقسامي للسماح بفصلها إلى القطبين المتقابلين للخلية الانقسامية3. يعد التنظيم والإكمال المناسب ومدة كل مرحلة أمرا أساسيا لضمان استقرار الجينوم. في الواقع ، يؤدي الخروج المبكر من أي من هذه المراحل إلى عدم استقرار الجينوم. على سبيل المثال ، فإن G 1 الأقصر الناجم عن حذف مثبط CDK الخميرة الناشئ Sic1 أو عن طريق الإفراط في التعبير عن سيكلين G1 سيغير المرحلة S اللاحقة4،5،6. وبالتالي ، فإن عمليات إلغاء التنظيم هذه ، المرتبطة أو غير المرتبطة بإجهاد النسخ المتماثل ، تؤدي إلى كسر الكروموسومات وإعادة ترتيبها والفصل الخاطئ4،5،6. لذلك ، قد تكون مراقبة مدة المرحلة S ، وعلى نطاق أوسع ، مدة المراحل الأخرى من دورة الخلية أمرا حاسما لتحديد العيوب التي تحدث في الطفرات المختلفة وفي الظروف المجهدة المختلفة.

تتضمن الطريقة التقليدية لقياس مدة مرحلة دورة الخلية القياس الخلوي البسيط لتدفق محتوى الحمض النووي (الشكل 1 أ) وتعتمد على خوارزمية مناسبة (متوفرة في معظم برامج قياس الخلايا) تستخدم لفصل السكان إلى كسور طور G1 و S و G2 + M من قمم 1C و 2C. ثم يتم ضرب الكسور في وقت مضاعفة المجتمع الإحصائي7. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تعطي قيما تقديرية فقط ، وتتطلب توزيعا متجانسا لحجم الخلية داخل جزء معين ، ولا تنطبق على الثقافات المتزامنة. لدراسة مدة المرحلة S في خلايا الثدييات ، تم تطوير العديد من نظائر الثيميدين واستخدامها على نطاق واسع ، بما في ذلك EdU. إن امتصاصها من الوسط خارج الخلية والفسفرة بواسطة ثايميدين كيناز (المشار إليه فيما يلي باسم TK) يجعلها متاحة لبوليميراز الحمض النووي لدمجها في مواقع تخليق الحمض النووي (النسخ المتماثل ، إعادة التركيب ، الإصلاح). لتجاوز غياب جين TK في خلايا Saccharomyces cerevisiae ، تم تصميم سلالات الخميرة للسماح بالتعبير المستقر والتأسيسي لفيروس الهربس البسيط TK8 وناقل النوكليوزيد البشري المتوازن (hENT1)9. بمجرد دمجه في الحمض النووي ، يتم اكتشاف EdU عبر تفاعل النقر الانتقائي ، والذي يقترن كيميائيا بمزيج الألكين الخاص به إلى الفلوروكرومات المعدلة بالأزيد10.

تقدم هذه الورقة بروتوكولين شاملين محسنين لتسمية الخلايا المهندسة TK-hENT1 غير المتزامنة والمتزامنة مع EdU من أجل تصور وقياس مدة وديناميكيات تكرار الحمض النووي بدقة ، بالإضافة إلى مدة المراحل الأخرى من دورة الخلية ، مع دقة مكانية وزمانية عالية على مستوى الخلية الواحدة والسكان عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. S. ثقافة الخلايا cerevisiae

ملاحظة: يتم سرد سلالات الخميرة المستخدمة في الجدول 1

ملاحظة: يمكن مراقبة مدة المرحلة S بطرق مختلفة. اعتمادا على السؤال الذي يجب معالجته ، يمكن زراعة الخلايا بشكل غير متزامن أو متزامن بعد اعتقال G1 .

  1. من خلايا S. cerevisiae المتنامية بشكل غير متزامن
    ملاحظة: تسمح هذه الطريقة بتحديد النسبة المئوية للخلايا في المرحلة S في عدد الخلايا المتزايد بشكل غير متزامن. من خلال تحديد وقت المضاعفة ، يمكن استقراء مدة المرحلة S (والمراحل الأخرى).
    1. تلقيح خلايا S. cerevisiae في 10 مل من وسط اصطناعي كامل (SC) بتركيز منخفض للخلايا (5 × 104 خلايا / مل) لمزرعة ليلية عند 30 درجة مئوية مع تحريض مداري عند 130 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: يتم قياس التركيز باستخدام عداد خلية. لحساب أوقات المضاعفة بكفاءة ، يوصى بتلقيح الثقافة من ثقافة ليلية لا تزال في المرحلة الأسية (أي أقل من 2 × 107 خلايا / مل). لا ينصح بزراعة الخلايا في وسط غني (YPD) ، لأن اكتشاف EdU ليس فعالا.
    2. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الخلايا في 20 مل من وسط SC الطازج عند التركيز النهائي ل 5 × 105 خلايا / مل.
    3. استزرع الخلايا عند 30 درجة مئوية في حمام مائي يهتز مع اهتزاز أفقي عند 120 دورة في الدقيقة.
    4. قم بقياس تركيز الخلية كل ساعة حتى تصل إلى 1 × 107 خلايا / مل.
      ملاحظة: تسمح هذه الخطوة بعمل تمثيل رسومي لزيادة تركيز الخلية بمرور الوقت. يتم شرح الصيغة المستخدمة لحساب أوقات المضاعفة في وسيلة إيضاح الجدول 2.
    5. تابع بالتوازي مع الخطوة 2 لوضع العلامات EdU عندما يكون تركيز الخلية حوالي 2 × 10 6-5 × 106 خلايا / مل.
  2. من خلايا S. cerevisiae المتزامنة G1
    ملاحظة: تسمح هذه الطريقة بتحديد متى تبدأ المرحلة S وتنتهي عن طريق قياس التدفق الخلوي و / أو تحليلات الفحص المجهري.
    1. تلقيح خلايا S. cerevisiae في 10 مل من وسط SC بتركيز منخفض للخلايا (5 × 104 خلايا / مل) لمزرعة ليلية عند 30 درجة مئوية مع تحريض مداري عند 130 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: راجع الملاحظات بعد الخطوة 1.1.1.
    2. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الخلايا في 20 مل من وسط SC الطازج بتركيز نهائي قدره 2 × 10 6-3 × 106 خلايا / مل.
    3. أضف 40 ميكرولتر من 1 ملغ / مل α عامل مخفف في الماء.
    4. استزرع الخلايا عند 30 درجة مئوية مع التحريض المداري عند 130 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
    5. أضف مرة أخرى 40 ميكرولتر من 1 ملغ / مل α عامل مخفف في الماء.
    6. استزرع الخلايا عند 30 درجة مئوية مع التحريض المداري عند 130 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
    7. تصور الخلايا تحت المجهر الضوئي لمراقبة اعتقال G1 . تابع إذا كان أكثر من 90٪ من الخلايا تعرض shmoo والخلايا الأخرى عبارة عن خلايا مستديرة غير مهدمة.
      ملاحظة: اعتمادا على الخلفية المستخدمة ، فمن المستحسن أن صوتنة الخلايا قبل التصور shmoo. بالنسبة لخلفية W303 ، صوتي 2x ، لمدة 2 ثانية في كل مرة ، بسعة 40-50.
    8. جهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق بسرعة 1500 × جم. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    9. أعد تعليق الخلايا في 20 مل من وسط SC.
    10. كرر الخطوات 1.2.8-1.2.9 مرة واحدة.
      ملاحظة: يتم غسل العامل α بعيدا مع هذه الخطوات ، ويتم تحرير الخلايا في دورة الخلية. بدلا من ذلك ، يمكن غسل العامل α عن طريق تصفية خلايا الخميرة بمرشح نيتروسليلوز 1.2 ميكرومتر باستخدام قمع مثبت على قارورة ذراع جانبية متصلة بمضخة تفريغ.
    11. اجمع 1 مل من الخلايا 2x كل 5 دقائق وانتقل إلى الخطوة 2 لوضع العلامات على EdU.
      ملاحظة: قم بتسمية الخلايا من أنبوب واحد فقط من الأنبوبين باستخدام EdU. تستخدم الخلايا غير الموسومة بالنبض لتمييز الخلايا الإيجابية EdU عن الخلايا السلبية EdU على الرسم البياني ثنائي المتغير بروبيديوم يوديد (PI) - EdU.
    12. أضف 400 ميكرولتر من 1 مجم / مل α عامل مخفف في الماء بعد 30 دقيقة من الإطلاق.
      ملاحظة: هذه الجرعة العالية من عامل α مطلوبة لإيقاف الخلايا في المرحلة G1 من دورة الخلية التالية ولمنع الخلايا من العودة إلى المرحلة S اللاحقة.

2. وضع العلامات EdU

  1. انقل 1 مل من مزرعة الخلايا إلى أنبوب ميكروفوج سعة 2.0 مل يحتوي على 1 ميكرولتر من 10 مللي مول EdU. تخلط جيدا عن طريق الانقلاب.
    ملاحظة: لتمييز الخلايا الإيجابية EdU عن الخلايا السالبة EdU على FACS ثنائية المتغير PI-EdU ، قم بنقل 1 مل آخر من مزرعة الخلايا إلى أنبوب microfuge سعة 2.0 مل يحتوي على 1 ميكرولتر من DMSO.
  2. احتضن لمدة 3-5 دقائق عند 30 درجة مئوية تحت التحريك في حمام مائي يهتز.
    ملاحظة: ثلاث دقائق كافية للكشف عن EdU باستخدام المجهر ؛ مطلوب 5 دقائق للكشف الأمثل عن EdU على مقياس التدفق الخلوي.
  3. أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.
    1. أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من 20٪ بارافورمالدهيد إذا كان قياس حجم الخلية مطلوبا.
      ملاحظة: إذا كان سيتم الحفاظ على البنية النووية للخلايا الانقسامية سليمة لمزيد من التحليلات بعد تفاعل النقر ، فإننا نوصي بتثبيت الخلايا التي تحتوي على 2٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة (RT) بدلا من وضع الخلايا على الجليد ، لأن الأخير يسبب إزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة.
    2. اترك الخلايا لمدة 20 دقيقة عند RT تحت تحريض خفيف على هزاز متغير السرعة عند 20 إمالة / دقيقة لإصلاح الخلايا قبل إضافة 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.

3. تثبيت الخلية ونفاذية

  1. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في microfuge. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مفرغة.
  2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. تخلط جيدا عن طريق دوامة.
  3. اتركه لمدة ≥1 ساعة عند RT بسرعة 20 إمالة / دقيقة على هزاز متغير السرعة لاختراق الخلايا.
    ملاحظة: الخلايا التي تنمو في وسط SC لا تحبيبات جيدا لأنها تميل إلى الالتصاق بجدران microfuge. إضافة الإيثانول يحسن التكوير ويقلل من فقدان الخلايا. يمكن تخزين الخلايا عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو لفترات أطول عند -20 درجة مئوية.
  4. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
  5. اغسل الخلايا 2x ب 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 10٪ في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: الغسالات ضرورية لإزالة EdU غير المدمج من الخلايا.

4. رد فعل النقر عليه

  1. لتحليل قياس الخلايا
    1. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في microfuge. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    2. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS تحتوي على 0.1 مجم / مل RNase A و 0.2 مجم / مل بروتيناز K.
    3. احتضن لمدة 1-2 ساعة عند 50 درجة مئوية مع الاهتزاز من حين لآخر (أو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية).
    4. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    5. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    6. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في microfuge. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من PBS + 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA). احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
      ملاحظة: الأوقات الأطول ليست ضرورية بل إنها تضر بكفاءة تفاعلات النقر.
    8. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    9. أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من PBS + 1٪ BSA.
    10. قم بتوزيع الخلايا بين أنبوبين: 200 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لتفاعل النقر و 100 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق آخر سعة 1.5 مل لتلطيخ Sytox Green.
    11. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    12. لتلطيخ سيتوكس الأخضر
      ملاحظة: نوصي بشدة بأخذ حصة لتلوين Sytox Green (بدون نقرة) من أجل الحصول على ملفات تعريف مرجعية عالية الجودة لمحتوى الحمض النووي. في الواقع ، فإن تفاعل النقر يروي بقوة مضان intercalant ، بما في ذلك Sytox Green و PI fluorescence. وبالتالي ، يمكن أن يؤدي تفاعل النقر إلى تشويه قراءة محتوى الحمض النووي.
      1. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
      2. انقل 10-30 ميكرولتر (حسب تركيز الخلية) إلى أنبوب مقياس التدفق الخلوي الذي يحتوي على 300 ميكرولتر من 50 mM Tris-HCl و pH 7.5 و 0.5 μM Sytox Green.
      3. Sonicate 2x ، لمدة 2 ثانية في كل مرة ، بسعة 40-50.
      4. اتركيه في الظلام حتى تتم معالجة العينات على مقياس التدفق الخلوي.
        ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالخلايا في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام.
    13. لتفاعل النقر
      1. قم بإعداد مخزن Azide Dye المؤقت الطازج عن طريق خلط الكواشف بالترتيب التالي (الكمية لأنبوب واحد): 36 ميكرولتر من PBS ، 2 ميكرولتر من 0.2 M CuSO4 ، 0.2 ميكرولتر من 2 mM Cy5 Azide ، و 2 ميكرولتر من 1 M حمض الأسكوربيك.
        ملاحظة: من الممكن تحضير مزيج رئيسي من المخزن المؤقت Azide Dye. يجب خلط الكواشف بنفس الترتيب المذكور أعلاه.
      2. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 40 ميكرولتر من مزيج Azide Dye الطازج. احتضان في RT في الظلام لمدة 60 دقيقة.
      3. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
      4. اغسل الخلايا 3x مع 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 10٪ في برنامج تلفزيوني.
        ملاحظة: الغسالات ضرورية للتخلص من جميع أزيد EdU-Cy5 القابل للذوبان.
      5. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل PI في برنامج تلفزيوني. اتركيه لمدة 10 دقائق في الظلام.
      6. نقل 10-30 ميكرولتر من تعليق الخلية (اعتمادا على تركيز الخلية) إلى أنبوب مقياس التدفق الخلوي الذي يحتوي على 300 ميكرولتر من 50 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5.
      7. Sonicate 2x ، لمدة 2 ثانية في كل مرة ، بسعة 40-50.
      8. اتركيه في الظلام حتى تتم معالجة العينات على مقياس الخلايا.
        ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالخلايا في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام.
    14. اقرأ عينات Sytox Green باستخدام ليزر أزرق مثير عند 488 نانومتر ومرشح 530/30 BP. انظر الشكل 1 أ للحصول على نتائج نموذجية. اقرأ عينات PI-EdU ثنائية المتغير على مخطط نقطي باستخدام ليزر أزرق مثير عند 488 نانومتر ومرشح 615/20 BP ل PI (المحور السيني) وليزر أحمر مثير عند 640 نانومتر ومرشح 660/20 BP (المحور ص). انظر الشكل 1 ب للحصول على نتائج نموذجية.
      ملاحظة: يمثل الشكل 1C نتيجة PI-EdU ثنائية المتغير FACS النموذجية للخلايا السالبة EdU. يسمح بتمييز الخلايا السلبية EdU عن الخلايا الإيجابية EdU.
  2. للتحليل المجهري
    1. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    2. إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من PBS + 1 ٪ BSA. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10000 × غرام في microfuge. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    4. قم بإعداد مخزن Azide Dye الطازج عن طريق خلط الكواشف بالترتيب التالي (الكمية لأنبوب واحد): 36 ميكرولتر من PBS ، 2 ميكرولتر من 0.2 M CuSO4 ، 0.2 ميكرولتر من 2 mM Dy-530 azide ، 2 ميكرولتر من 1 M حمض الأسكوربيك.
      ملاحظة: يمكن تحضير مزيج رئيسي من المخزن المؤقت Azide Dye طازجا عن طريق خلط الكواشف بالترتيب المذكور أعلاه.
    5. أعد تعليق الحبيبات باستخدام 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت Azide Dye الطازج. احتضان في RT في الظلام لمدة 60 دقيقة.
    6. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10000 × غرام في microfuge. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    7. اغسل الخلايا 2x مع 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 10٪ في برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: الغسالات ضرورية للتخلص من جميع أزيد Dy-530 القابل للذوبان.
    8. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في جهاز طرد مركزي دقيق. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    9. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / مل 4'،6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) في برنامج تلفزيوني. اتركيه لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
    10. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    11. اغسل ب 300 ميكرولتر من PBS لإزالة DAPI الزائد.
    12. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10000 × غرام في microfuge. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    13. أعد تعليق الحبيبات ب 10-50 ميكرولتر من PBS اعتمادا على تركيز الخلية.
    14. Sonicate 2x ، لمدة 2 ثانية في كل مرة ، بسعة 40-50.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالخلايا في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام.
    15. ماصة 1.7 ميكرولتر من الخلايا على شريحة مجهر زجاجي وغطاء بغطاء نظيف.
    16. راقب على الفور تحت مجهر مضان مع مرشحات DAPI و TexasRed أو Cy3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحديد مدة المرحلة S ، وعلى نطاق أوسع ، مدة G 1 و G2 + M (خطوة البروتوكول 1.1) ، نمت خلايا S. cerevisiae W303 من النوع البري (WT ، الجدول 1) بشكل غير متزامن في وسط SC لمدة 7 ساعات. كل ساعة ، تم رصد تركيز الخلية لتحديد وقت المضاعفة (الشكل 2 ب). في ظروف النمو هذه ، كان وقت المضاعفة المحسوب 120 دقيقة ± 13 دقيقة عند 25 درجة مئوية (الجدول 2). عندما كانت الخلايا في المرحلة الأسية (2 × 10 6-5 × 106 خلايا / مل) ، تم تسمية حص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخميرة هي كائن نموذجي رئيسي لدراسات دورة الخلية ، ومع ذلك فإن توصيف طورها S قد أعاق منذ فترة طويلة بسبب عدم قدرتها على دمج النيوكليوسيدات الخارجية ، مثل BrdU ، والتي تستخدم كمتتبعات لتكرار الحمض النووي. إن تجهيز الخميرة بتعبير عال عن الهربس البسيط ثيميدين كيناز (TK) وإضافة ناقل نيوكليوزيد بشري (hENT) قد حل هذه المشكلة إلى حد كبير15,16. EdU أكثر تنوعا من BrdU حيث أن اكتشافه باستخدام أزيد الفلورسنت الصغير وكيمياء النقر قابل للاختراق لخلايا الخميرة وتحليل FACS ، عل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في الاعتراف بالوكالة الوطنية للبحوث (ANR) وجمعية البحوث حول السرطان (ARC) للحصول على زمالات الدكتوراه إلى JD D.D.B.T. والوكالة الوطنية للبحوث (ANR) للحصول على الدعم المالي (منحة ANR-18-CE12-0018-01). تم إجراء القياس الخلوي والفحص المجهري في مرفق التصوير بالرنين المغناطيسي في مونبلييه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
α-factor GenescriptRP01002
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Euromedex04-100--812-E
كبريتات النحاسSigmaC1297
DAPISigmaD9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)InterchimFP-JV6320بديل ل Alexa647-Azide
Dy-530 أزيدDyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)CarbosynthNE08701
الإيثانول المطلقكواشف Carlo ErbaP013A10D16أو ما يعادلها
L- حمض الأسكوربيكSigmaA4544
بروبيديوم يوديدSigmaP4864
Proteinase KEuromedexEU0090
RnaseSIGMAR5000
Sytox GreenInvitrogenS-7020
Equipment< / قوي >
عداد خليةOLSCASY
التدفق الخلويAgilentNovoSampler Pro
حاضنة اهتزازInfors444-4230أو ما يعادلها
من ماء اهتزاز حمامJulaboSW22أو ما يعادلها
SonicatorSonicsVibra cell
مجهر واسع المجالLeicaThunder Imagerأو ما يعادله
مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120(2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EdU DNA Sytox Green

مقالات ذات صلة