تقييم آثار السموم الحيوية على وظائف الخلايا المناعية في أسماك الزرد

Lora Petrie-Hanson; Ann E. Beth Peterman

doi:10.3791/64494

مقالة منهجية

تقييم آثار السموم الحيوية على وظائف الخلايا المناعية في أسماك الزرد

DOI:

10.3791/64494

⸱

يناير 12, 2024

Lora Petrie-Hanson¹ , Ann E. Beth Peterman¹

¹Department of Comparative Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول فحوصات قياس التدفق الخلوي التي يمكنها تقييم آثار التعرض للسموم على وظائف الخلايا الداخلية لمجموعات سكانية فرعية مختلفة من كريات البيض في الزرد. يسمح استخدام مثبطات وظيفية محددة في الفحص بالتمايز بين آليات الخلية المتغيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن توجد مجموعة متنوعة من السموم البيولوجية بمستويات ضارة في البيئة المائية. البكتيريا الزرقاء هي مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة بدائية النواة التي تنتج السموم الزرقاء في البيئة المائية. يمكن أن تكون هذه السموم الحيوية سموما كبدية أو سموم جلدية أو سموم عصبية ويمكن أن تؤثر على الأسماك والثدييات. على مستويات عالية ، هذه المركبات قاتلة. على المستويات غير المميتة ، فإنها تتصرف بشكل خبيث وتؤثر على وظائف الخلايا المناعية. تشمل السموم الحيوية التي تنتجها الطحالب الميكروسيستين والسموم A. يمكن للحيوانات المائية أيضا تناول المواد الملوثة بالسموم العصبية البوتولينوم E (BoNT / E) التي تنتجها المطثية البوتولينوم ، مما يؤدي أيضا إلى الموت أو انخفاض وظائف المناعة. يمكن استخدام أسماك الزرد لدراسة كيفية تأثير السموم على وظائف الخلايا المناعية. في هذه الدراسات ، يمكن إجراء التعرض للسموم في الجسم الحي أو في المختبر. في الجسم الحي ، تعرض الدراسات الزرد للسم ، ثم يتم عزل الخلايا. توضح هذه الطريقة كيف يمكن لبيئة الأنسجة أن تؤثر على وظيفة الكريات البيض تقوم الدراسات المختبرية بعزل الخلايا أولا ، ثم تعريضها للسم في آبار الاستزراع. يتم الحصول على الكريات البيض عن طريق استخراج نخاع الكلى ، متبوعا بالطرد المركزي المتدرج الكثافة. يتم تحديد كيفية استيعاب الكريات البيض لمسببات الأمراض من خلال آليات الخلايا الداخلية. توضح فحوصات البلعمة لقياس التدفق الخلوي ما إذا كانت آليات الخلية الداخلية قد تغيرت بسبب التعرض للسموم. لا توجد دراسات تستخدم الكريات البيض المعزولة لتحديد كيفية تسبب السموم لخلل المناعة. ستمكن الإجراءات الموضحة في هذه المقالة المختبرات من استخدام أسماك الزرد لدراسة الآليات التي تتأثر عندما يقلل السم البيئي من وظائف الخلايا الداخلية للخلايا المناعية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك أنواع عديدة من السموم الحيوية البيئية والعوامل المثبطة للمناعة. تحدث تكاثر الطحالب التي تحتوي على سموم بكتيرية في المياه الداخلية ويمكن أن تحدث أيضا على شكل أغشية^{حيوية 1}. توجد البكتيريا الزرقاء (الطحالب الخضراء المزرقة) بشكل طبيعي في جميع النظم البيئية للمياه العذبة. زادت أزهار البكتيريا الزرقاء بشكل كبير في أنظمة المياه العذبة². في أوقات معينة ، يمكن أن تنتج البكتيريا الزرقاء سموما ضارة بالحيوانات المائية والبرية. يمكن أن تؤثر هذه السموم على الكبد والجلد والأغشية المخاطية و / أو الجهاز العصبي. مركبان تنتجهما البكتيريا الزرقاء هما الميكروسيستين والأناتوكسين A. Microcystin هو سباعي التبتيد^{الدوري 3}. Anatoxin A هو قلويد⁴. السموم العصبية البوتولينوم E (BoNT / E) هو سم آخر يحدث في الأنظمة المائية. يتم إنتاجه بواسطة المطثية البوتولينوم ويمكن أن تتناوله المائية⁵.

يؤثر التعرض للسموم البيئية على الأسماك ويمكن أن يؤثر أيضا على صحة ويزيد من حدوث الأمراض⁶. يعد فهم كيفية تأثير هذه السموم على الخلايا المناعية أمرا أساسيا لتحديد المخاطر المرتبطة بالتعرض لهذه المواد. يعتبر سمك الزرد نموذجا ممتازا لدراسة آثار السموم البيئية على الخلايا المناعية⁷. يعد تطوير طريقة تستخدم قياس التدفق الخلوي وكريات البيض في الزرد مفيدا للغاية. لأسماك الزرد أهمية فسيولوجية للإنسان ، ويمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة واسعة من مجالات البحث ، من علم السموم الأساسي وعلم المناعة إلى اكتشاف الأدوية والبيولوجيا التنموية. نظرا لأنها كائنات مائية ، فإن أسماك الزرد مناسبة بشكل خاص لدراسة آثار السموم البيئية المنقولة بالماء⁷. استخدام أسماك الزرد أقل تكلفة من نماذج الفقاريات الأخرى ، ويثير استخدامها مخاوف أخلاقية أقل.

خلايا الدم البيضاء ، أو الكريات البيض ، هي خط الدفاع الخلوي ضد الكائنات الحية المسببة للأمراض. الالتقام الخلوي هو عملية امتصاص الخلية أو استيعاب سائلا أو جسيما خارجيا للخلية. يتم تحقيق ذلك من خلال الخلية التي تحيط بالمركب في حويصلة⁸. تستخدم الكريات البيض هذه العملية كخطوة أولى في قتل مسببات الأمراض وإعداد دفاع ضد الأمراض. البلعمة هي نوع من الالتقام الخلوي وكانت واحدة من أولى الطرق المستخدمة للتحقيق في آثار الملوثات البيئية على صحة^{الأسماك 9}. طور مختبر بيتري هانسون طرقا باستخدام كريات البيض من سمك الزرد لفحص السموم الحيوية بحثا عن قدرتها المحتملة على التدخل في وظائف الكريات البيض الداخلية والبلعمية والتأثير على الدفاعات المناعية. أنواع الالتقام الخلوي المدرجة في هذه الطرق هي كثرة الخلايا ، البلعمة ، البلعمة المعتمدة على المستقبلات ، البلعمة بوساطة مستقبلات المانوز ، البلعمة بوساطة مستقبلات المانوز. تم وصف استخدام طرق قياس التدفق الخلوي مع أسماك الزرد لأول مرة في مختبر Petrie-Hanson⁹ وتستخدم بشكل روتيني للتحقيق في السموم المائية ومسببات الأمراض. لا تحتوي أسماك الزرد الطافرة Rag1 - / ^- على خلايا T و B¹⁰ ويمكن استخدامها للتحقيق في آليات الخلايا المناعية الفطرية على وجه التحديد.

يعتمد قياس التدفق الخلوي على الليزر ويمكن استخدامه لتحديد الخصائص الفيزيائية للخلايا. يتم رسم قيمة التشتت الأمامي أو FSC على المحور X وتمثل حجم الخلية. يتم رسم التشتت الجانبي ، أو SSC ، على المحور Y ويمثل الحبيبات السيتوبلازمية للخلية. توضح المؤامرة الناتجة مجموعات من الخلايا ذات الخصائص الفيزيائية المتشابهة مجمعة معا ، مع ظهور أنواع الخلايا المختلفة في مواقع مختلفة على مخطط مبعثر. يمكن لهذه المجموعات تغيير الموقع على مخطط المبعثر حيث تتغير الخصائص الفيزيائية للخلايا⁹. يتيح استخدام هذه التقنية مع كريات البيض لسمك الزرد للباحثين تقييم التغيرات في مجموعات الخلايا استجابة للمنبهات المختلفة ، بما في ذلك السموم البيئية.

مقياس التدفق الخلوي متعدد الأبعاد ، ويمكن استخدام أنواع متعددة من الفلوروفورات في التقييم لتوصيف الخلايا ونشاطها بشكل أكبر. في المقايسات الموضحة في هذا البروتوكول ، يتميز الالتقام الخلوي بقياس كمية مادة الفلورسنت التي استوعبتها الخلية. يمكن تحديد ما إذا كان التعرض للسموم يؤثر على آليات الخلايا الداخلية وكيف يمكن تحديده من خلال مقارنة قدرة الخلايا المعرضة للسموم على امتصاص المادة مقارنة بقدرة الخلايا غير المعرضة للسموم باستخدام قياس التدفق الخلوي. تشمل العمليات الداخلية التي يمكن تقييمها بهذه الطريقة كثرة الخلايا ، والالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات ، والبلعمة.

كثرة الخلايا هي امتصاص المكونات القابلة للذوبان ، ولا تستخدم مستقبلات الخلايا. يتضمن الامتصاص إعادة ترتيب السيتوبلازم بواسطة الخيوط الدقيقة والأنابيب الدقيقة لتشكيل فجوات صغيرة. لوسيفيراز الأصفر (LY) هي صبغة فلورية تستخدم لقياس امتصاص السوائل عن طريق كثرة الخلايا غير الانتقائية¹¹. يتضمن الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات الامتصاص الانتقائي للجزيئات الكبيرة. يمكن استخدام الفلورسين (FITC) المسمى ديكستران (DX) 40 لتقييم هذه العملية. البلعمة هي شكل من أشكال الالتقام الخلوي الذي يبتلع جزيئات أكبر من 0.5 ميكرومتر. يتم التحقيق في هذه العملية من خلال الإجراءات باستخدام FITC-DX70 و FITC-Eschericia coli. يبلغ عدد الأوزان الجزيئية ل DX40 و DX70 40,000 و 70,000 على التوالي. FITC-E. القولونية هي سلالة المختبر القياسية للإشريكية القولونية المرتبطة بالفلور الذي يمكن قياسه بواسطة مقياس التدفق الخلوي. تتطلب العديد من أشكال الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات الكالسيوم كجزيء إشارة ولإعادة ترتيب الهيكل الخلوي⁹. نوع آخر من الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات هو الالتقام الخلوي بوساطة مستقبلات المانوز (MR). مستقبلات المانوز هي بروتينات عبر الغشاء تتعرف على أشكال المانان على أسطح الخلايا^{الميكروبية 9}. لتحسين هذه الإجراءات ، يجب إنشاء منحنى استجابة للجرعة مع كل مادة سامة لتحديد الجرعات التي سيتم استخدامها. يجب إجراء منحنى التشبع ل LY و FITC-DX40 و FITC-DX70 و FITC-E. القولونية لتقييم التركيز الصحيح المراد استخدامه.

قد تختلف الآليات التي تستخدمها الكريات البيض لاستيعاب الجسيمات المختلفة. لاقتراح أي مكون من مكونات العملية قد يتأثر بالتعرض للسموم ، يمكن إضافة مثبطات لمنع آليات البلعمة. سوف يمنع السيتوكالاسين D (CCD) حركة الأنابيب الدقيقة وبالتالي كثرة الكريات الكرياتية. لا يؤثر CCD على الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات¹¹. يمنع EDTA الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات المعتمدة على الكالسيوم (^{Ca 2+}). مانان هو رابط طبيعي ل MR. يستخدم مانان كمثبط لمستقبلات المانوز لتقييم ما إذا كان البلعمة أو كثرة الخلايا هو مستقبل المانوز بوساطة⁹.

الغرض من هذا البروتوكول هو توضيح إجراءات تحديد ما إذا كان التعرض للسموم قد أثر على قدرة الكريات البيض البلعمية على امتصاص مسببات الأمراض. قد تميز هذه البروتوكولات أيضا ما إذا كانت آلية داخلية معينة تتأثر. يسمح إجراء هذه الفحوصات على مقياس التدفق الخلوي بمزيد من التمييز عن طريق اختيار مجموعات الكريات البيض بناء على الحجم والحبيبات السيتوبلازمية لتحديد ما إذا كانت مجموعات الكريات البيض قد تأثرت بشكل تفاضلي. تعتمد هذه الطريقة على البوابات الإلكترونية لمجموعات الخلايا.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسي بجامعة ولاية ميسيسيبي (MSU-IACUC). تم تربية جميع أسماك الزرد المستخدمة في هذه الدراسة من مستعمرة متماثلة اللواقح من أسماك الزرد الطافرة التي تم إنشاؤها سابقا في مفرخ محدد خال من مسببات الأمراض في كلية الطب البيطري بجامعة ولاية ميسيسيبي (MSU) ¹⁰. كما تم نشر أسماك الزرد من النوع البري في هذا المفرخ. في هذه الدراسات ، يمكن إجراء التعرض للسموم في الجسم الحي أو في المختبر. في الجسم الحي ، تعرض الدراسات السم الزرد للسم ، وبعد ذلك يتم عزل الكريات البيض ، مما يشير إلى كيفية تفاعل السم والبيئة الدقيقة للأنسجة والتأثير على وظيفة الكريات البيض. تقوم الدراسات المختبرية بعزل الكريات البيض ثم تعرض الخلايا للسم في آبار الاستزراع.

1. إعداد الكاشف والمحلول

المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS): (محلول الملح المتوازن هانكس بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم (HBSS) + 0.05٪ ألبومين مصل البقر (BSA)) (انظر جدول المواد). تحضير هذا طازجا قبل عزل الخلايا.
وسائط زراعة الأنسجة (TCM): استخدم RPMI-1640 المكمل بغلوتاماكس ومصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (انظر جدول المواد).
السيتوكالاسين D (CCD): قم بإعداد محلول المخزون عن طريق إعادة تعليق المنتج المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) في 1 مل من 200 دليل على الإيثانول المطلق. قم بإعداد محلول العمل عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من CCD إلى 980 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، للحصول على التركيز النهائي 2.5 ميكروغرام / مل.
EDTA: محلول المخزون هو 1 مجم / مل. قم بإعداد محلول العمل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول المخزون إلى 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، للحصول على التركيز النهائي 1 مليمتر.
منانان: قم بإعداد محلول مخزون 1 مجم / مل (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، قم بإعداد محلول العمل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول المخزون إلى 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، للحصول على التركيز النهائي 500 ميكروغرام / مل.
قم بإعداد Lucifer Yellow (10 ميكروغرام / مل) (LY ، صبغة فلورية) ، Dextran-40 (DX-40 ، 500 ميكروغرام / مل) و Dextran-70 (DX-70 ، 500 ميكروغرام / مل) بشكل منفصل عن طريق صنع محلول 1 مجم / مل لكل منها عن طريق تعليق الكواشف المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) في ماء معقم.
بكتيريا الفلورسين (FITC): تنمو الإشريكية القولونية DH5α (انظر جدول المواد) مع الاهتزاز في وسائط 100 مل لوريا بيرتاني (LB) مكملة ب 50 ميكروغرام / مل FITC بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في بيئة محمية بالضوء احصل على كثافة بصرية (OD) تبلغ 0.8 عند 540 نانومتر.
1. اغسل البكتيريا (3x) بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم متبوعا بالتسخين عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. اغسل 1 مرة أخرى ، ثم اضبط تركيزات البكتيريا على OD₅₄₀ 0.8. سيكون هذا هو حل المخزون.
2. قم بإعداد حل العمل عن طريق عمل تخفيف 1: 100 لمحلول المخزون (مخزون 1 مل: 99 مل مخزن مؤقت FACS). اضبط التركيز النهائي على 1.8 × 10⁸ خلايا / مل.

2. رعاية الزرد

الحفاظ على أسماك الزرد في تدفق أحادي المرور عبر نظام على المياه البلدية منزوعة الكلور وإطعام وجبة السمك عالية البروتين والأرتيميا الحية إلى الشبع.
في عمر 6 أشهر ، قم بإزالة أسماك الزرد المختلطة من أحواض الخزان الخاصة بها ونقلها إلى مختبر الأبحاث لاستخدامها في التجربة. هذا هو أفضل سن لاستخدامه لعزل العدد الأمثل من الكريات البيض من نخاع الكلى⁹.

3. عزل الخلايا

القتل الرحيم ل 10 أسماك زرد في التريكيين (~ 100 مل 4 مجم / مل فوسفات مخزن سلفونات الميثان ثلاثي الكنائين / لتر من ماء السمك) (انظر جدول المواد) باتباع الطرق المعمول^{بها 9}.
ضع مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.
قم بإزالة أنسجة نخاع الكلى⁹ وضعها في أنبوب C مع 3 مل من وسط زراعة الأنسجة وقم بتجانس الأنسجة باستخدام مفكك الأنسجة. هذا هو الإجراء المفضل.
بدلا من ذلك ، قم بتعطيل الأنسجة بالطرف المطاطي لمحقنة سعة 3 مل في مصفاة الخلية. بعد تجانس الأنسجة (أو تعطيلها) ، اسكب المعلق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
جهاز الطرد المركزي التعليق المفلتر عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 16 درجة مئوية. اسكب المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 3 مل من الطب الصيني الصيني. كرر هذه الخطوة مرتين.
ضع طبقة من الخلايا بعناية على 3 مل ، وسط تدرج الكثافة (1.077 جم / مل) في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 20 دقيقة عند 16 درجة مئوية. تأكد من أن الفرامل في أدنى إعداد ، حتى لا يتم تعليق الخلايا عند توقف جهاز الطرد المركزي.
قم بإزالة الطبقة غير الشفافة من الواجهة إلى أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل.
اغسل الخلايا بإضافة 5 مل من الطب الصيني التقليدي وخلطها بماصة باستور. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 16 درجة مئوية.
كرر الخطوة ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في الطب الصيني التقليدي لإنتاج ما يقرب من 1 × 10⁶ خلايا / مل.

4. فحص جدوى الخلية

لمراقبة صلاحية الخلية ، قم بتقييم موت الخلايا باستخدام تلطيخ يوديد البروبيديوم (PI).
1. أضف PI (200 ميكروغرام / مل) بتركيز 5 ميكرولتر / مل من الخلايا المراد تحليلها. اقرأ على قناة PE / Texas Red.
  ملاحظة: ينتشر يوديد البروبيديوم من خلال الثقوب الموجودة في أغشية الخلايا الميتة ، وبالتالي تلطيخها. كانت الجدوى المقيمة 85٪ للدراسة الحالية.

5. حضانة السموم

Aliquot 200 ميكرولتر من الخلايا من تعليق الخلية المعزولة في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار (3 آبار للتحكم و 3 آبار للتعرض للسموم). يسمح هذا بتشغيل النسخ المتماثلة في ثلاث نسخ.
أضف 2 مل من الطب الصيني التقليدي لكل بئر.
أضف السم (~ 2.5 ميكروغرام / مل) إلى الآبار الثلاثة.
ملاحظة: يجب تحسين تركيز السم قبل بدء التجربة وسيعتمد على السم المستخدم في الفحص.
احتضان لوحة زراعة الأنسجة لوقت التعرض المطلوب. يجب تحسين وقت التعرض المطلوب قبل بدء التجربة وسيعتمد على السم المستخدم في الفحص. في هذه الدراسة ، كان وقت التعرض ~ 1 ساعة.
بعد وقت التعرض ، ضع لوحة زراعة الأنسجة على الجليد لمدة 10 دقائق.
خلايا الماصة في كل بئر لأعلى ولأسفل مع عناية لإزالة أي خلايا ملتصقة من اللوحة.
قم بإزالة الخلايا من اللوحة إلى أنبوب طرد مركزي دائري القاع سعة 14 مل.
الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 16 درجة مئوية. قم بتعليق الخلايا في 3 مل من المخزن المؤقت FACS. كرر الخطوة مرتين.
أعد تعليق الخلايا في 1.5 مل من المخزن المؤقت FACS.
ملاحظة: بالنسبة للدراسات في الجسم الحي ، قم بتعريض السم (بتركيز مماثل كما هو مذكور أعلاه) ، ثم اعزل الخلايا.

6. فحص الالتقام الخلوي

Aliquot 100 ميكرولتر من الخلايا إلى 5 مل أنابيب قياس التدفق الخلوي. قم بتسمية الأنابيب على النحو التالي بأربعة أنابيب مكررة من كل بئر: (1) LY ، (2) DX40 ، (3) DX70 ، (4) FITC-E. قولوني.
إضافة صبغة مضان كما هو مذكور في الخطوة 1.6 والخطوة 1.7 إلى الأنابيب المناسبة: 50 ميكرولتر من LY إلى الأنبوب (1) ، 50 ميكرولتر DX40 إلى الأنبوب (2) ؛ 50 ميكرولتر DX70 إلى الأنبوب (3) ؛ 50 ميكرولتر FITC-E. قولونية إلى أنبوب (4).
احتضان لمدة 1 ساعة. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب.
الطرد المركزي للخلايا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 16 درجة مئوية. اسكب المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي.

7. قياس التدفق الخلوي

قم بإجراء قياس التدفق الخلوي لتصور مجموعات الخلايا وجمع البيانات. راجع Hohn et ^al.9 للحصول على التفاصيل.
حدد مجموعات الخلايا المستهدفة في الخطوة الأولى. استخدم المبعثر الجانبي (SSC) (عادة المحور الرأسي) لإزالة الحطام والخلايا الصغيرة البائسة على أقصى الجانب الأيسر والمبعثر الأمامي (عادة المحور الأفقي) لإزالة نفس الحطام في الجزء السفلي من المؤامرة.
تخلص من القراءات المزدوجة (الخلايا التي يتم عدها مرتين). يتم تنفيذ ذلك باستخدام بوابة هندسة النبض (FSC-H x FSC-A).
تحديد إشارة الخلفية. قم بتشغيل الخلايا فقط التحكم في التألق والتحكم في التألق من النمط المتماثل لكل فلوروكروم مستخدم ، لتحديد مستويات الفلورسنت في الخلفية.
ملاحظة: كل فلوروكروم له مستواه الفريد من تألق الخلفية ، يتأثر بالتألق الذاتي للخلية والارتباط غير المحدد. هذا يميز بين الإشارات الإيجابية الحقيقية ومضان الخلفية. عند تحديد مجموعات الخلايا وتجسيدها بناء على التألق ، يتم طرح قيم التحكم هذه من عدد الأحداث الإيجابية ، والرقم الناتج هو الرقم المستخدم للتحليل.
قم بتشغيل العينات وتحديد مجموعات الخلايا المراد تجميعها. استخدم FSC و SSC لتوصيف وتحديد مجموعات الخلايا المختلفة شكليا داخل خليط من الخلايا.
ملاحظة: يرتبط FSC بشكل أساسي بحجم الخلية. سوف تشتت الخلايا الأكبر حجما مزيدا من الضوء في الاتجاه الأمامي ، مما يؤدي إلى قيم FSC أعلى ، بينما ستشتت الخلايا الأصغر ضوءا أقل ولها قيم FSC أقل. سيتم تجميع أحجام مختلفة من الخلايا في مجموعات. على سبيل المثال ، قد تظهر الخلايا الليمفاوية ، كونها أصغر حجما ، كمجموعة منفصلة ذات قيم FSC أقل مقارنة بالخلايا المحببة. يرتبط SSC بالحبيبات والتعقيد والبنية الداخلية للخلية. سيكون للخلايا ذات الحبيبات السيتوبلازمية المزيد قيم SSC أعلى. سوف تتجمع الخلايا المتشابهة معا. على سبيل المثال ، تحتوي العدلات على حبيبات سيتوبلازمية وستتجمع بقيمة SSC أعلى من الخلايا الليمفاوية.
قم بتشغيل جميع العينات ، واستنادا إلى FSC / SSC ، قم بتطبيق البوابات على مجموعات الخلايا ليتم تحليلها بشكل أكبر. يتم تطبيق المناطق المسورة بناء على كثافة الخلايا والسكان ذوي الأهمية.
ارسم المناطق المسورة على الرسوم البيانية لتحليل متوسط شدة التألق (MFI) ل FITC في كل بوابة للتألق عند 495 نانومتر / 519 نانومتر باستخدام الليزر الأزرق.
تصدير عدد الخلايا على النحو الذي يحدده البرنامج للتفوق في برنامج التحليل.
تحليل البيانات في حزمة برامج إحصائية (انظر جدول المواد).
قارن MFI لكل مجموعة من خلايا التحكم ب MFI لمجموعات الخلايا المعرضة للسم.

8. تأثير السم على آليات الخلايا الداخلية وتأثيرات مثبطات CCD و EDTA و Manan على آليات الخلايا الداخلية

ملاحظة: لامتصاص السوائل أو الجسيمات ، يتحرك سيتوبلازم الخلية بنشاط. تتطلب هذه الحركة عناصر هيكلية متعددة ومسارات إشارات. يمكن أن تؤثر السموم الحيوية على أي من هذه العناصر أو المسارات. يمكن استخدام مقارنة تأثيرات مثبطات محددة مميزة للمساعدة في تمييز كيفية عمل السم الحيوي¹¹.

قم بإجراء عزل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 3.
Aliquot 100 ميكرولتر من الخلايا إلى 5 مل من أنابيب قياس التدفق الخلوي (مع أربعة أنابيب مكررة من كل بئر).
ملاحظة: أنابيب الملصقات على النحو التالي: (5) CCD + LY (CCD يمنع كثرة الخلايا عن طريق تثبيط الخيوط الدقيقة وإعادة ترتيب الأنابيب الدقيقة ؛ يستخدم LY لتقييم امتصاص السوائل عن طريق كثرة الخلايا الدقيقة)⁹. (6) EDTA + DX40 (يمنع EDTA البلعمة والبكثرة الدقيقة التي تتوسط مستقبلات Ca²⁺ المعتمدة على Ca 2+ ؛ قياس ما إذا كان الامتصاص ينطوي على آلية تعتمد على الكالسيوم). (7) EDTA + DX70. (8) EDTA + FITC-E. قولونية. (9) منان + DX40 (يمنع المانان امتصاص محدد لمستقبلات المانوز ، وقياس الالتقام الخلوي المعتمد على MR⁹). (10) منان + DX70. (11) منان + FITC-E. قولونية.
إضافة مثبطات: 1 ميكرولتر من CCD إلى الأنبوب (5) ؛ 10 ميكرولتر EDTA إلى أنابيب (6-8) ؛ 100 ميكرولتر من المانان إلى الأنابيب (9-11). اتبع التركيزات كما هو مذكور في الخطوة 1. احتضن لمدة 5 دقائق.
إضافة الفلورسنت الثانوي إلى الأنابيب المناسبة: 50 ميكرولتر من LY إلى الأنبوب (1) و (5) ؛ 50 ميكرولتر من DX40 إلى الأنبوب (2) و (6) و (9) ؛ 50 ميكرولتر من DX70 إلى الأنبوب (3) و (7) و (10) ؛ 50 ميكرولتر من FITC-E. القولونية إلى الأنبوب (4) و (8) و (11). احتضان لمدة 30 دقيقة.
أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم عند 16 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
اسكب المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. كرر الخطوات 8.5-8.6 مرتين.
قم بتشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي باتباع الخطوة 7.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم فحوصات الالتقام الخلوي الكريات البيض المختلطة المعزولة من التدرجات وبوابات للخلايا البلعمية والخلايا الليمفاوية لتحديد ما إذا كانت الآليات الخلوية المحددة قد تغيرت بسبب التعرض للسموم. أولا ، الخلايا مسورة بناء على الحجم والحبيبات¹⁰. يتم تصور الخلايا الميتة أو المجزأة أو المحتضرة في الزاوية اليسرى السفلية من مخطط المبعثر ويتم التخلص منها ، ولا يتم تحليلها بحثا عن البلعمة. تشتمل بوابة البلعمة على البلاعم والقاتل الطبيعي (الخلايا الطبيعية الطبيعية) والخلايا الحبيبية ، بينما تشتمل بوابة الخلايا الليمفاوية على الخلايا الليمفاوية والخلايا البلعمية البلعمية والخلايا السامة للخلايا غير المحددة (NCCs) (الشكل 1).

يتم تحديد البلعمة من خلال امتصاص الجسيمات المسماة ب FITC ، كما هو موضح من خلال قراءة التألق عند 495 نانومتر / 519 نانومتر بالليزر الأزرق. يتم التخلص من التألق الذاتي في الخلفية والتألق الملزم غير المحدد من خلال حساب متوسط شدة التألق (MFI) المنبعثة من خلايا التحكم والتحكم في النمط المتماثل. يجب إجراء منحنى الجرعة والاستجابة مع كل مثبط لتحديد التركيزات المراد استخدامها. إذا كانت نتائج قياس التدفق الخلوي للخلايا المعرضة للسم الذي يتم اختباره هي نفسها نتائج الخلايا المعرضة لمثبط ، فإن السم يسبب تأثيرا مشابها وقد يثبط تلك الآلية الداخلية. إذا كانت استجابات السم والمثبط مضافة ، فهذا يشير إلى أن السم قد يثبط الالتقام الخلوي بآلية مختلفة عن المثبط.

يتم إجراء مقارنات بين الخلايا غير المعالجة والخلايا المعالجة بالسم الذي يتم اختباره (الشكل 2) ، والخلايا المعالجة بالسم أو المثبط (الشكل 3 أ) ، والخلايا المعالجة بالمثبط وحده (الشكل 3 ب). تظهر النتائج التمثيلية أن الخلايا المعالجة بالميكروسيستين قد تم تثبيطها ، على غرار الخلايا المعالجة ب CCD. توضح هذه النتائج أن الميكروسيستين يثبط امتصاص السوائل عن طريق كثرة الخلايا الدقيقة. يتم تحليل الخلايا المسورة عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه ، ويجب الإبلاغ عن النتائج على أنها متوسط عدد الخلايا الإيجابية ل FITC.

figure-results-1
الشكل 1: مخطط تشتت قياس التدفق الخلوي التمثيلي للكريات البيض المعزولة من أنسجة الكلى من النوع البري لسمك الزرد بناء على خصائص التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC). تشتمل بوابة الخلايا البلعمية على البلاعم / الخلايا الوحيدة والخلايا الحبيبية (23٪ من الخلايا المسورة. تشتمل بوابة الخلايا الليمفاوية على الخلايا الليمفاوية والخلايا البلعمية البلعمية والخلايا السامة للخلايا غير المحددة (NCCs) (26٪ من الخلايا المسورة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: متوسط شدة التألق (MFI) للخلايا البلعمية المسورة في الشكل 1 بعد التعرض للسم. يظهر الأنبوب (1) خلايا غير ملطخة بينما تنبعث الخلايا الموجودة في الأنبوب (2) من التألق من خلال امتصاص LY. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: متوسط شدة التألق (MFI) للخلايا البلعمية المسورة في الشكل 1. امتصاص لوسيفر الأصفر (LY) دون وجود Cytochalasin D (CCD) مثبط (A); امتصاص LY مع وجود CCD. يظهر الأنبوب (1) خلايا غير ملطخة بينما تنبعث الخلايا الموجودة في الأنبوب (2) من خلال امتصاص LY. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: نظرة عامة على الخطوات المتضمنة في البروتوكول. * ستختلف مدة ومدى تعرض الأسماك للسموم الحيوية اعتمادا على السم الحيوي المحدد المستخدم ولوائح وبروتوكولات رعاية والسلامة البيولوجية الخاصة بالمؤسسات المختلفة. ** يجب تحسين التركيز المطلوب المستخدم ووقت التعرض المستخدم قبل التجربة وسيعتمد على السم المستخدم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر استخدام قياس التدفق الخلوي مع كريات البيض من سمك الزرد نهجا قويا ومتعدد الاستخدامات لدراسة جهاز المناعة بالتفصيل ، وتقييم تأثير السموم البيئية ، وتسهيل البحوث السمية. يوفر طريقة لتقييم تأثير السموم بسرعة وفعالية على الخلايا المناعية والاستجابة المناعية. تكشف النتائج عن العوامل الخلطية المعنية وتقترح كيف تتفاعل فسيولوجيا الأسماك والتمثيل الغذائي مع السموم الحيوية البيئية. يتم تصوير نظرة عامة على البروتوكول في الشكل 4.

ومع ذلك ، هناك قيود على هذه الأساليب. يمكن أن يكون تحضير كريات البيض من سمك الزرد لقياس التدفق الخلوي أكثر تعقيدا مقارنة بالنماذج الأخرى. يمكن أن يحد الحجم الصغير لأسماك الزرد من كمية الدم وعدد الكريات البيض المتاحة للتحليل⁹^،¹⁰. تتطلب هذه الإجراءات تفكيك الأنسجة للحصول على معلقات أحادية الخلية ، ويمكن أن تؤثر صلاحية الخلية على دقة النتائج. بالمقارنة مع نماذج مثل الفئران ، فإن مجموعة الأدوات المناعية المتاحة ، مثل الأجسام المضادة الخاصة بعلامات خلايا الزرد ، محدودة أكثر بالنسبة لأسماك الزرد. يمكن أن يحد هذا القيد من عمق التحليل الذي يمكن إجراؤه على كريات البيض من أسماك الزرد. علاوة على ذلك ، يتطلب تفسير بيانات قياس التدفق الخلوي خبرة ، خاصة عند التعامل مع الاستجابات المناعية المعقدة. يمكن أن يؤدي سوء تفسير البيانات إلى استنتاجات غير صحيحة ، لا سيما في سياق تأثيرات السموم البيئية.

يمكن مقارنة نتائج عينات الخلايا التي لم تتم إضافة مثبطات بعينات الخلايا مع المثبطات. يجب مقارنة نتائج عينات الخلايا مع السم المضاف بعينات الخلايا مع المثبطات. إذا تأثرت إعادة ترتيب الهيكل الخلوي ، فسيكون هناك امتصاص محدود ل LY. إذا كان السم يثبط امتصاص DX-40 أو DX-70 ، فلن يتم البلعمة بأحجام الجسيمات المختلفة. إذا كانت الخلايا لا تمتص FITC-E. القولونية ، فإن السم يثبط البلعمة.

باختصار ، تعمل أسماك الزرد كنموذج ممتاز لدراسة آثار السموم البيئية على الخلايا المناعية. يحدد هذا البروتوكول طريقة تستخدم قياس التدفق الخلوي وكريات البيض لسمك الزرد لفحص السموم الحيوية ، مع التركيز بشكل خاص على عمليات الالتقام الخلوي والبلعمة¹¹. الهدف من هذه الدراسة هو التأكد مما إذا كان التعرض للسموم يؤثر على قدرة الكريات البيض البلعمية على امتصاص مسببات الأمراض وتمييز التأثيرات المحتملة على آليات الخلايا الداخلية المحددة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون إيزاك هانسون على الصيانة اليومية لأسماك الزرد المستخدمة ، وتريفا بيليارد وستيرلنج بيلي للمساعدة في تدقيق هذه المخطوطة وتنسيقها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10٪ مصل الجنين البقري	جيبكو	A3160501
14 مل أنابيب الطرد المركزي القاع المستديرة BD	Biosciences	352059
40 & micro ؛ إجهاد الخلايا m	Corning	07-201-430
5 مل أنابيب قياس التدفق الخلوي	BD Biosciences	352235
50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطي	Corning	14-959-49A
الإيثانول المطلق	فيشر	BP2818-500
عداد الخلايا الآلي	تقنيات الحياة الكونتيسة الثانية FL		لدراسة بقاء الخلية
البقر ألبومين مصل (BSA)	سيجما	A3059
السيتوكالاسين د (CCD)	سيجما	C8273-5MG
ديكستران 40	سيجما	FD40-100MG
ديكستران 70	سيجما	46945-100 ملغ-F
الإشريكية القولونية< / م > DH5 & ألفا ؛ (أو سلالة بكتيرية أخرى في المختبر)	نيو إنجلاند بيولابس	C29871
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)	برنامج تحليل التدفق Sigma	ED4SS
			Novoacea
مقياس التدفق الخلوي	Novocyte 3000
Fluorescein	Fluka BioChemica	46950
hanks محلول ملح متوازن بدون كالسيوم أو مغنيسيوم	سيجما	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
Lucifer Yellow	Sigma	L0259-25MG
Mannan	Sigma	M7504-250MG
فوسفات محلول ملحي	مخزن Sigma	P3813
RPMI-1640 مع GlutaMax	Gibco	61870036
البرنامج الإحصائي	SPSS
توكسين
تريكاين	ويسترن كيميكال NC0342409

برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vincent, W. F. Cyanobacteria. Encyclopedia of Inland Waters. Likens, G. E. , Academic Press. 226-232 (2009).
Paerl, H. W., Huisman, J. Climate change: A catalyst for global expansion of harmful cyanobacterial blooms. Environmental Microbiology Reports. 1 (1), 27-37 (2009).
Yáñez-Sedeño, P., Agüí, L., Villalonga, R., Pingarrón, J. M. Biosensors in forensic analysis. A review. Analytica Chimica Acta. 823, 1-19 (2014).
Solter, P. F., Beasley, V. R. Chapter 38 - Phycotoxins. Haschek and Rousseaux's handbook of toxicologic pathology (Third Edition). Haschek, W. M., Rousseaux, C. G., Wallig, M. A. , Academic Press. 1155-1186 (2022).
Espelund, M., Klaveness, D. Botulism outbreaks in natural environments - an update. Frontiers Microbiology. 5, 287(2014).
Sánchez, C. A., et al. Landscape-level toxicant exposure mediates infection impacts on wildlife populations. Biology Letters. 16 (11), 20200559(2020).
Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
Weeks, S. A., Warinner, J. E. Functional evaluation of macrophages in fish from a polluted estuary. Veterinary Immunology and Immunopathology. 12, 313-320 (1986).
Hohn, C., Lee, S. R., Pinchuk, L. M., Petrie-Hanson, L. Zebrafish kidney phagocytes utilize macropinocytosis and Ca2+-dependent endocytic mechanisms. PLOS One. 4 (2), e4314(2009).
Petrie-Hanson, L., Hohn, C. M., Hanson, L. A. Characterization of rag1 mutant zebrafish leukocytes. BMC Immunology. 10 (8), (2009).
Watts, C., March, M. Endocytosis: what goes in and how. Journal of Cell Science. 103, 1-8 (1992).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

تقييم آثار السموم الحيوية على وظائف الخلايا المناعية في أسماك الزرد

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة