في هذا العمل ، تم وصف مقايسة مضان الكالسيوم عالية الإنتاجية داخل الخلايا لألواح 384 بئرا لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة على مستقبلات البروتين G المقترنة المؤتلفة (GPCRs). يتم التعبير عن الهدف ، مستقبل كينين من قراد حمى الماشية ، Rhipicephalus microplus ، في خلايا CHO-K1. يحدد هذا الفحص الناهضات والخصوم باستخدام نفس الخلايا في مقايسة "الإضافة المزدوجة" الواحدة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مقايسة مضان الكالسيوم "مزدوجة الإضافة" للفحص عالي الإنتاجية لمستقبلات البروتين G المؤتلف
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تمثل مستقبلات البروتين G المقترنة (GPCRs) أكبر عائلة فائقة من المستقبلات وهي أهداف للعديد من الأدوية البشرية. تستخدم صناعة الأدوية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) لمكتبات الجزيئات الصغيرة العشوائية مقابل GPCRs لاكتشاف الأدوية الخاصة بالهدف. في هذه الدراسة ، تم استخدام HTS لتحديد روابط جديدة صغيرة الجزيئات من GPCRs العصبية الخاصة باللافقاريات كتحقيقات للدراسات الفسيولوجية لنواقل مسببات الأمراض البشرية والبيطرية القاتلة.
تم اختيار مستقبل كينين الخاص باللافقاريات كهدف لأنه ينظم العديد من العمليات الفسيولوجية المهمة في اللافقاريات ، بما في ذلك إدرار البول والتغذية والهضم. علاوة على ذلك ، فإن علم الأدوية للعديد من GPCRs اللافقارية ضعيف الوصف أو لا يتميز على الإطلاق. لذلك ، فإن علم الصيدلة التفاضلي لهذه المجموعات من المستقبلات فيما يتعلق ب GPCRs ذات الصلة في metazoans الأخرى ، وخاصة البشر ، يضيف المعرفة إلى العلاقات بين الهيكل والنشاط ل GPCRs كعائلة فائقة. تم تطوير اختبار HTS للخلايا في 384 لوحة بئر لاكتشاف روابط مستقبلات كينين من قراد حمى الماشية ، أو قراد الماشية الجنوبي ، Rhipicephalus microplus. تم التعبير عن مستقبل كينين القراد بثبات في خلايا CHO-K1.
مستقبلات كينين ، عند تنشيطها بواسطة ببتيدات كينين العصبية الداخلية أو غيرها من ناهضات الجزيئات الصغيرة ، تؤدي إلى إطلاق Ca2+ من مخازن الكالسيوم إلى السيتوبلازم. يمكن لمقايسة مضان الكالسيوم هذه جنبا إلى جنب مع نهج "الإضافة المزدوجة" اكتشاف ناهض وظيفي وجزيئات "ضرب" مضادة في نفس لوحة الفحص. تم إجراء كل اختبار باستخدام لوحات المخدرات التي تحمل مجموعة من 320 جزيئا صغيرا عشوائيا. تم الحصول على عامل Z موثوق به يبلغ 0.7 ، وتم تحديد ثلاثة جزيئات ناهضة وجزيئين مصادين عندما كان HTS عند تركيز نهائي 2 ميكرومتر. يمكن تكييف مقايسة مضان الكالسيوم المبلغ عنها هنا لفحص GPCRs الأخرى التي تنشط سلسلة إشارات Ca2+ .
المقدمة
تمثل مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCRs) ، الموجودة من الخميرة إلى البشر ، أكبر عائلة فائقة من المستقبلات في العديد من الكائنات الحية1. يلعبون أدوارا حاسمة في تنظيم جميع العمليات البيولوجية تقريبا في الحيوانات. هناك 50-200 GPCRs في جينوم المفصليات ، مما يعني أنها تمثل أكبر عائلة فائقة لمستقبلات الغشاء2. يتم تصنيفها إلى ست فئات رئيسية ، A-F ، بناء على تشابه تسلسلها ووظائفها3. تقوم GPCRs بتحويل إشارات مختلفة خارج الخلية ، مثل تلك الخاصة بالهرمونات ، والببتيدات العصبية ، والأمينات الحيوية ، والغلوتامات ، والبروتون ، والبروتينات الشحمية ، والفوتونات4. يقترن GPCRs ببروتينات G ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. صيانة الخلايا
ملاحظة: تم تطوير خط خلية CHO-K1 الذي يعبر بثبات عن مستقبل كينين من R. MICROPLUS ، المسمى BMLK3 ، بواسطة HOLMES ET AL.16. يتم عرض تفاصيل تطوير خط الخلية في مكان آخر14. يتم تنفيذ جميع الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.
- قم بتنمية خط الخلايا المؤتلف في وسائط انتقائية (وسط F-12K يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 800 ميكروغرام / مل كبريتات G418) لضمان التعبير عن المستقبل المستهدف. قم بتخزين الخلايا التي تعبر عن المستقبل بثبات في 1 مل من وسط التجميد (90٪ FBS و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم استخدام لوحة دواء داخلية (SAC2-34-6170) تتكون من 320 جزيئا صغيرا عشوائيا لإظهار مقايسة HTS هذه كمثال. كان لدى HTS جودة فحص ممتازة مع عامل Z 0.7 (الجدول 1). يعكس عامل Z هذا جودة الفحص المستقلة عن المركبات المختبرة34. يشير عامل Z البالغ 0.5 أو أكثر إلى نطاق ديناميكي جيد لإشارة الفحص بين وحدات RFU لعناصر التحكم الإيجابية والضوابط السلبية. المقايسات ذات عامل Z أقل من 0.5 لها نطاق ديناميكي إشارة دون المستوى الأمثل ، وعادة ما تكون غير مفيدة لاختيار الضربة ، وبال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الهدف من HTS هو تحديد جزيئات الضرب من خلال فحص أعداد هائلة من الجزيئات الصغيرة. لذلك ، فإن النتائج من هذا المثال لا تمثل سوى جزء صغير من تجربة HTS التقليدية. علاوة على ذلك ، يجب التحقق من صحة جزيئات الضرب المحددة في مقايسات المصب مثل الفحص المعتمد على الجرعة على نفس خط الخلية المؤتلف وعلى خط خلية CHO-K1 الذي يحمل فقط الناقل الفارغ ، والذي يمكن إجراؤه في وقت واحد لحفظ الجزيئات الصغيرة. ستساعد فحوصات السمية الخلوية في إثبات أن عدم الاستجابة في الإضافة الثانية لا يرجع إلى موت الخلايا. يجب إجراء فحوصات حيوية أخرى للتحقق من ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال جائزة USDA-NIFA-AFRI لصحة الحيوان ورفاهيته (رقم الجائزة 2022-67015-36336 ، PVP [مدير المشروع]) ومن الصناديق التنافسية من برنامج منحة أمراض ناقلات الحشرات لأبحاث Texas A&M AgriLife (FY'22-23) إلى P.V.P. تم الاعتراف بمجموعة أعضاء هيئة التدريس A.W.E.S.O.M.E. في كلية الزراعة وعلوم الحياة ، TAMU ، للمساعدة في تحرير المخطوطة. يحتوي الجدول التكميلي S2 على بيانات من مكتبة داخلية عشوائية صغيرة الجزيئات تم الحصول عليها من مختبر الدكتور جيمس ساكيتي في جامعة تكساس إيه آند إم وأبحاث تكساس إيه آند إم الزراعية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25٪ تريبسين-EDTA | جيبكو إنفيتروجين | 15050-065 | مع الفينول الأحمر |
| 0.4٪ تريبان الأزرق | MilliporeSigma | T8154 | السائل ، معقم |
| 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي | الدقيقة Thermo Fisher | AM12400 | RNase أنابيب Microfuge خالية من RNase |
| 5 مل ماصة مصلية | Corning | 29443-045 | Corning Costar Stripette ملفوفة بشكل فردي ؛ |
| 10 مل ماصة مصلية | Corning | 29443-047 | Corning Costar Stripette ملفوفة بشكل فردي |
| 15 مل أنابيب مخروطية Falcon | 352196 | معقمة | |
| 20 & نصائح مرشح L | الولايات المتحدة الأمريكية Scientifc Inc. | P1121 | معقمة ، حاجز |
| 25 مل ماصة مصلية | Corning | 29443-049 | Corning Costar Stripette ملفوفة بشكل فردي ؛ |
| 50 مل أنابيب مخروطية Corning | 430828 | متخرجة ، معقمة | |
| 150 مل احتياطية صديقة للسيارات | Integra Bioscience | 6317 | معقمة ، ملفوفة بشكل فردي لبذر الخلايا في اليوم 1 |
| 150 مل احتياطي صديق للسيارات | Integra Bioscience | 6318 | معقمة ، مكدسة ، لتحميل الصبغة في اليوم 2 |
| 384 / 12.5 & micro ؛ L نصائح منخفضة الاحتفاظ | Integra Bioscience | 6405 | طويلة ، فلتر معقم |
| 384 / 12.5 & مايكرو ؛ نصائح L | Integra Bioscience | 6404 | مرشح طويل ومعقم |
| 384 بئر لوحة | Greiner | 781091 | CELLSTAR ، بوليسترين شفاف ، وميكرو ؛ واضح ، أسود / |
| مسطح ألواح الألومنيوم الأختام | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | البوليستر |
| القائم على رقائق الألومنيوم التفاف | وول مارت | ||
| Biosafty خزانة II | NuAire | NU-540-300 | |
| عداد الخلايا | Nexcelom | AutoT4 | |
| عد الخلايا Nexcelom | SD-100 | 20 & L غرفة | |
| CO2< / sub> حاضنة رطبة | Thermo Fisher | Forma Series II | |
| مصباح مكتبي | SunvaleeyTEK | RS1000B | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | MilliporeSigma | 276855 | anhydous ، >99.9٪ |
| لوحة المخدرات | Corning | 3680 | |
| Dulbecco محلول ملحي مخزن بالفوسفات | Corning | 21-031- السيرة الذاتية | DPBS, 1x بدون الكالسيوم والمغنيسيوم |
| الإيثانول | Koptec | 2000 | |
| F-12K خليط المغذيات | Corning | 45000-354 | (Kaighn's Mod.) مع L-glutamine |
| مصل البقر الجنيني | Equitech-Bio | SFBU30 | |
| مجموعة فحص الكالسيوم الفلورية | ENZO Lifescience | ENZ-51017 | 10x96 اختبارات |
| G418 كبريتات | Gibco Invitrogen | 10131-027 | المضادات الحيوية الانتقائية Geneticin 50 مجم / مل |
| عازلة هانك | MilliporeSigma | 55037C | HBSS معدل, مع الكالسيوم, مع المغنيسيوم, دون الفينول قراءة |
| عازلة HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-080 | 1 لوحة |
| تخزين البيانات مولار HTS | CDD قبو | https://www.collaborativedrug.com/ | |
| نظام مناولة السوائل | Integra Bioscience | Viaflo | 384 / 12.5 & micro ؛ L |
| لوحة الطرد المركزي | الحرارية فيشر | سورفال ST8 | |
| قارئ لوحة | BMG التكنولوجيا | كلاريوستار | |
| بولي دي-ليسين | ميليبورسيجما | P6407 | |
| Rhimi-K-1 ناهض الببتيد | Genscript | طلب مخصص | QFSPWGamide |
| T-75 قارورة | فالكون | 353136 |
المراجع
- Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
- Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
