يصف هذا العمل بروتوكولا تجريبيا جديدا يستخدم حاملا مطبوعا ثلاثي الأبعاد لتمكين تصوير الخلايا الحية عالي الدقة للكرات الأرضية المنزوعة. من خلال هذا البروتوكول ، يمكن ملاحظة نشاط إشارات الكالسيوم الخلوية في ظهارة القرنية المصابة من الكرات الأرضية خارج الجسم الحي في الوقت الفعلي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير الخلايا الحية للكرات الأرضية خارج الجسم الحي السليمة باستخدام حامل مطبوع 3D جديد
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التئام الجروح الظهارية القرنية هو عملية هجرة تبدأ عن طريق تنشيط مستقبلات purinergic المعبر عنها على الخلايا الظهارية. ينتج عن هذا التنشيط أحداث تعبئة الكالسيوم التي تنتشر من خلية إلى أخرى ، وهي ضرورية لبدء الحركة الخلوية في سرير الجرح ، مما يعزز التئام الجروح بكفاءة. طور مختبر Trinkaus-Randall منهجية لتصوير استجابة التئام جروح القرنية في كرات الفئران خارج الجسم الحي في الوقت الفعلي. يتضمن هذا النهج استئصال كرة أرضية سليمة من فأر تم قتله رحيما وفقا للبروتوكولات المعمول بها واحتضان الكرة الأرضية على الفور بصبغة مؤشر الكالسيوم. يمكن تطبيق صبغة مضادة تلطخ الميزات الأخرى للخلية في هذه المرحلة للمساعدة في التصوير وإظهار المعالم الخلوية. عمل البروتوكول بشكل جيد مع العديد من أصباغ الخلايا الحية المختلفة المستخدمة في مكافحة التلطيخ ، بما في ذلك الأكتين SiR لتلطيخ الأكتين وصبغة غشاء البلازما الحمراء العميقة لتلطيخ غشاء الخلية. لفحص الاستجابة للجرح ، يتم إصابة ظهارة القرنية باستخدام إبرة 25 G ، ويتم وضع الكرات الأرضية في حامل مطبوع 3D. تتم معايرة أبعاد حامل الطباعة 3D لضمان تجميد الكرة الأرضية طوال مدة التجربة ويمكن تعديلها لاستيعاب العيون ذات الأحجام المختلفة. يتم إجراء التصوير بالخلايا الحية لاستجابة الجرح بشكل مستمر على أعماق مختلفة في جميع أنحاء الأنسجة بمرور الوقت باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يسمح لنا هذا البروتوكول بإنشاء صور عالية الدقة وجودة النشر باستخدام هدف هوائي 20x على مجهر متحد البؤر. يمكن أيضا استخدام أهداف أخرى لهذا البروتوكول. وهو يمثل تحسنا كبيرا في جودة تصوير الخلايا الحية في كرات الفئران خارج الجسم الحي ويسمح بتحديد الأعصاب والظهارة.
المقدمة
القرنيه
القرنية عبارة عن بنية شفافة غير وعائية تغطي السطح الأمامي للعين والتي تنكسر الضوء لتمكين الرؤية وتحمي الجزء الداخلي من العين من التلف. نظرا لأن القرنية تتعرض للبيئة ، فهي عرضة للتلف من الأسباب الميكانيكية (الخدش) ومن العدوى. عادة ما تلتئم إصابة القرنية في مريض سليم في غضون 1-3 أيام. ومع ذلك ، في المرضى الذين يعانون من حالات كامنة بما في ذلك نقص الخلايا الجذعية الحوفية ومرض السكري من النوع الثاني ، يمكن أن تطول عملية التئام جروح القرنيةبشكل كبير 1. نظرا لأن القرنية معصبة للغاية ، فإن قرح القرنية غير الشافية وتآكل القرنية المتكرر مؤلمة للغاية وتقلل بشكل كبير من نوعية حياة المرضى الذين يعانون منها1
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون لاستخدام الحيوانات في رعاية العيون وأبحاث الرؤية وبروتوكول IACUC بجامعة بوسطن (201800302).
1. تصميم أصحاب المطبوعة 3D وشريط الغطاء
- تصميم حوامل الطباعة ثلاثية الأبعاد وشريط الغطاء الذي يمثل متوسط قطر كرات الماوس وطباعة التصميم ثلاثي الأبعاد (الشكل 1 أ ، ب).
- حافظ على قطر الجدار الداخلي للحامل أكبر قليلا من متوسط قطر الكرة الأرضية لحساب الأحجام المختلفة للفئران الفردية. حافظ على ارتفاع الحامل عند حوالي نصف قطر الكرة الأرضية ، مما يضمن ملاءمة محكمة للكرة الأرضية عند تأم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم استخدام هذا البروتوكول لإنتاج بيانات وصور بجودة النشرباستمرار 10. تمثل الصور التي تم الحصول عليها تحسنا كبيرا عند مقارنتها بالنهج السابقة (الشكل 2). باستخدام حامل الطباعة ثلاثية الأبعاد ، يمكن التقاط الصور في جميع أنحاء طبقات القرنية ، ويمكن ملاحظة تعبئة الكالسيوم في مستويات z المختلفة (الشكل 3). تم استخدام هذا النهج لمقارنة إشارات الخلية الخلوية بين طبقات الخلايا القمية والقاعدية عند الجرح في الفئران الصغيرة والكبيرة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول تقنية تصوير الخلايا الحية التي تستخدم حامل مطبوع 3D لتثبيت وتثبيت عيون الحيوانات السليمة. إنه مصمم للتحايل على العديد من العيوب المهمة المعترف بها مع بروتوكولات تصوير الخلايا الحية السابقة لأنسجة القرنية خارج الجسم الحي . يوفر هذا البروتوكول العديد من المزايا لتصوير الخلايا الحية للكرات الأرضية السليمة. يقلل بشكل كبير من تلف الأنسجة غير الضروري الذي يمكن أن يتداخل مع استجابة التئام الجروح لجروح الخدش المستحثة تجريبيا. وهذا يشمل تلف الأعصاب والظهارة من التشريح والتعرض للأشعة فوق البنفسجية. علاو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
نود أن نعترف بالمعاهد الوطنية للصحة لدعم المنح التالية: RO1EY032079 (VTR) و R21EY029097-01 (VTR) و 1F30EY033647-01 (KS) و 5T32GM008541-24 (KS). نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لصندوق ماساتشوستس ليونز لأبحاث العيون وصندوق نيو إنجلاند لزراعة القرنية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.75 حمض بولي اللاكتيك الأزرق (PLA) البلاستيك | Creality (Shenzen ، الصين) | N / A | مادة لحامل |
| 35 مم طبق ، رقم 1.5 غطاء ، قطر زجاج 14 مم ، Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland ، MA) | P35GC-1.5-14-C | Well للتصوير. |
| برنامج Autodesk Fusion 360 | Autodesk (سان رافائيل ، كاليفورنيا). | برنامج غير | يستخدم لطباعة الحوامل. |
| د.ب 25 جم 7/8 إبر معقمة للاستخدام الفردي 100 إبرة / صندوق | ثيرمو فيشر العلمي (والثام ، ماساتشوستس) | 305124 | للجروح المستحثة تجريبيا على الكرات الأرضية |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad ، CA) | C10046 | غشاء الخلية. مؤشر الكالسيوم. تركيز 1: 10،000 مع تركيز نهائي 1٪ (v / v) DMSO و 0.1٪ (وزن / حجم) حمض البلورونيك |
| الكامل المنزل سوبر غراء | Walgreens (ديرفيلد ، إلينوي) | N / A | لربط الحامل بطابعة |
| Ender 3 Pro 3D بئر التصوير ؛ | Creality (Shenzen ، الصين) | N / A | لطباعة حامل |
| FIJI / ImageJ | ImageJ (Bethesda ، MD) | رقم الترخيص: GPL2 | Softwareused لتأكيد اتساق عمق الجرح وقطره بين الكرات الأرضية المستقلة باستخدام تحليل منطقة الاهتمام |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad ، CA) | مؤشر الكالسيوم F14201 | . تركيز 1: 100 بتركيز نهائي 1٪ (حجم / حجم) DMSO و 0.1٪ (وزن / حجم) حمض البلورونيك |
| متوسط خال من مصل الكيراتينيات | (والثام ، ماساتشوستس) | 17005042 | 25 مجم / مل مستخلص الغدة النخامية البقري ، 0.02 نانومتر EGF ، 0.3 ملي CaCl 2< / sub> ، والبنسلين الستربتومايسين (100 وحدة / مل ، 100 ميكرو ؛ جم / مل ، على التوالي) تمت إضافته إلى محلول |
| ملحي متوسط Phophate-Buffered (PBS) | Corning ، Medlabtech (Manassas ، VA) | 21-040-CV | يستخدم لغسل البقع الزائدة من القرنيات قبل التصوير |
| Zeiss Confocal 880 Microscope باستخدام AiryScan | Zeiss (Thornwood ، NY) | N / A | تم استخدام هدف التكبير 20x |
المراجع
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
