مقالة منهجية

طريقة التثقيب الكهربائي لتحويل الريكتسيا spp. باستخدام ناقل مكوك يعبر عن البروتين الفلوري في خطوط خلايا القراد

DOI:

10.3791/64562

⸱

أكتوبر 11, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Entomology, University of Minnesota

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التثقيب الكهربائي هو طريقة سريعة ومعتمدة على نطاق واسع لإدخال الحمض النووي الخارجي في جنس Rickettsia. يوفر هذا البروتوكول طريقة تثقيب كهربائي مفيدة لتحويل البكتيريا داخل الخلايا الملزمة في جنس Rickettsia.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدث الريكتسيات بسبب مجموعة واسعة من البكتيريا داخل الخلايا الملزمة التي تنتمي إلى جنس الريكتسيا والتي يمكن أن تنتقل إلى مضيفات الفقاريات من خلال لدغة ناقلات المفصليات المصابة. حتى الآن ، لا تزال الريكتسيات الوبائية الناشئة أو التي تعاود الظهور تشكل خطرا على الصحة العامة بسبب صعوبة التشخيص ، حيث أن طرق التشخيص محدودة وغير موحدة أو متاحة عالميا. قد يؤدي التشخيص الخاطئ الناتج عن عدم التعرف على العلامات والأعراض إلى تأخر العلاج بالمضادات الحيوية ونتائج صحية سيئة. إن الفهم الشامل لخصائص الريكتسيا من شأنه أن يحسن في النهاية التشخيص السريري والتقييم والعلاج مع تحسين السيطرة على المرض والوقاية منه.

الدراسات الوظيفية لجينات الريكتسية ضرورية لفهم دورها في التسبب في المرض. تصف هذه الورقة إجراء للتثقيب الكهربائي لسلالة ريكتسيا باركيري Tate's Hell باستخدام ناقل المكوك pRAM18dSFA واختيار R. parkeri المتحول في زراعة خلايا القراد بالمضادات الحيوية (spectinomycin و streptomycin). تم وصف طريقة أيضا لتوطين R. parkeri المحول في خلايا القراد باستخدام الفحص المجهري المناعي البؤري ، وهي تقنية مفيدة للتحقق من التحول في خطوط الخلايا المتجهة. مناهج مماثلة هي أيضا مناسبة لتحويل rickettsiae الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدث الريكتسيات بسبب مجموعة واسعة من البكتيريا داخل الخلايا الملزمة التي تنتمي إلى جنس الريكتسيا (عائلة Rickettsiaceae ، رتبة Rickettsiales). يصنف جنس الريكتسيا إلى أربع مجموعات رئيسية بناء على الخصائص التطورية 1,2: مجموعة الحمى المبقعة (SFG) ، والتي تحتوي على تلك الريكتسيا التي تسبب الريكتسيات الأكثر شدة وفتكا التي تنقلها القراد (على سبيل المثال ، Rickettsia rickettsii ، العامل المسبب لحمى الجبال الصخرية المبقعة) ، مجموعة التيفوس (TG ، على سبيل المثال ، Rickettsia prowazekii ، عامل التيفوس الوبائي) ، المجموعة الانتقالية (TRG ، على سبيل المثال ، Rickettsia felis ، العامل المسبب للحمى المبقعة التي تنقلها البراغيث) ، ومجموعة الأجداد (AG ، على سبيل المثال ، Rickettsia bellii).

من بين أقدم الأمراض المعروفة المنقولة بالنواقل ، يتم الحصول على الريكتسيات بشكل أساسي بعد انتقال مسببات الأمراض من خلال لدغات ناقلات المفصليات المصابة ، بما في ذلك القراد والبراغيث والقمل والعث 3,4. على الرغم من أن اكتشاف المضادات الحيوية الفعالة قد حسن نتائج العلاج ، إلا أن الريكتسيات الوبائية الناشئة والمعاودة الظهور لا تزال تشكل تحديا لاستراتيجيات الوقاية والمكافحة التقليدية. وبالتالي ، فإن الفهم الشامل لتفاعلات الريكتسيا / المضيف / الناقل من شأنه أن يضع في النهاية أساسا قويا لتطوير مناهج جديدة للوقاية من هذه الأمراض القديمة وعلاجها.

في الطبيعة ، يحدث نقل الجينات الأفقي (HGT) في البكتيريا من خلال الاقتران والنقل والتحول5. يستخدم التحول البكتيري في المختبر مفاهيم HGT هذه ، على الرغم من أن الطبيعة داخل الخلايا للريكتسيا تمثل بعض التحديات. حالت ظروف النمو المقيدة وأنظمة الاقتران والتحويل غير المفهومة بشكل جيد في أنواع مختلفة من الريكتسيا دون تطبيق طرق الاقتران والتحويل في الريكتسيا6،7،8. بالمقارنة مع الأجناس البكتيرية الأخرى داخل الخلايا (على سبيل المثال ، الكلاميديا ، Coxiella ، Anaplasma ، و Ehrlichia) ، يختلف جنس Rickettsia فيما يتعلق باستراتيجيات النمو والتكرار داخل سيتوبلازم الخلية ، مما يفرض تحديات محددة على التعديل الوراثي للريكتسيا بسبب ميزات نمط الحياة الفريدة9.

العقبة الأولية التي يجب التغلب عليها عند محاولة التعديل الوراثي للريكتسيا هي تحقيق تحول ناجح. وبالتالي ، فإن تصميم نهج عملي بكفاءة تحويل عالية سيكون ذا قيمة كبيرة لتطوير أدوات وراثية للريكتسيا. هنا ، نركز على التثقيب الكهربائي ، وهي طريقة تحويل معترف بها على نطاق واسع تم استخدامها لإدخال الحمض النووي الخارجي بنجاح في العديد من أنواع الريكتسيا ، بما في ذلك ريكتسيا برووازيكي ، ريكتسيا تيفي ، ريكتسيا كونوري ، ريكتسيا باركيري ، ريكتسيا مونتانينسيس ، ريكتسيا بيلي ، ريكتسيا بيكوكي ، وريكتسيا بوخنيري10، 11،12 ، 13،14،15،16.

تصف هذه الورقة إجراء للتثقيب الكهربائي لسلالة R. parkeri Tate's Hell (الانضمام: GCA_000965145.1) باستخدام ناقل المكوك pRAM18dSFA المشتق من سلالة Rickettsia amblyommatis AaR / SC plasmid pRAM18 المصممة لتشفير mKATE ، وهو بروتين فلوري أحمر بعيد ، و aadA ، يمنح مقاومة سبكتينومايسين والستربتومايسين13،15،20. R. parkeri المحولة قابلة للحياة ويتم الحفاظ عليها بثبات تحت اختيار المضادات الحيوية في خطوط خلايا القراد. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أنه يمكن استخدام توطين R. parkeri المحول في خلايا القراد الحية عبر الفحص المجهري متحد البؤر لتقييم جودة معدلات التحول في خطوط الخلايا المتجهة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. انتشار وتنقية R. parkeri من ثقافة خلايا القراد

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع إجراءات زراعة الخلايا في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية.

  1. اعداد R. parkeri- خلايا القراد المصابة
    1. تنمو خلايا ISE6 في قوارير زراعة الخلايا 25 سم2 عند 34 درجة مئوية في 5 مل من L15C300 المتوسطة17 ، تستكمل مع 5 ٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، 5 ٪ مرق فوسفات التربتوز (TPB) ، و 0.1 ٪ تركيز البروتين الدهني (LPC).
      ملاحظة: ISE6 (خط الخلايا المشتقة من الجنين Ixodes scapularis) هو خط خلية القراد المستخدم على نطاق واسع في العديد من المختبرات ، وبالتالي فهو نموذج أساسي لدراسة تفاعلات القراد والممرض17،18،19. معدل نمو خلايا ISE6 أبطأ من خلايا الثدييات ، حيث تضاعف عدد السكان ≥72 ساعة. على سبيل المثال ، ستستغرق خلايا ISE6 المزروعة من ثقافة متقاربة بنسبة 100٪ بنسبة 1: 5 من 3 إلى 4 أسابيع لاستعادة التقاء 100٪. سيتم تقريب خلايا ISE6 السليمة بشكل عام مع العديد من الخيوط الملتصقة17.
    2. عد خلايا ISE6 باستخدام مقياس الدم تحت المجهر الضوئي. استخدم بتركيز ~ 106 خلايا / مل (100٪ متقارب).
      1. شطف بلطف الخلايا من القارورة مع وسط وتفريق الخلايا عن طريق ماصة لتوليد تعليق خلية متجانسة. أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخلية بين مقياس الدم وغطاء الزجاج لحساب الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    3. أضف مضيفا من النوع البري الخالي من الخلايا R. parkeri 20 (متوسط العدد: 5 × 10 7-10 × 107) إلى مزارع خلايا ISE6 في قوارير زراعة خلايا 25 سم2. احتضان مزارع خلايا R. parkeri المصابة عند 34 درجة مئوية في 5 مل من وسط كامل يتكون من وسط L15C300 ، 10٪ FBS ، 5٪ TPB ، 0.1٪ LPC ، 0.25٪ بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) ، و 25 mM HEPES حتى تصاب 90٪ -100٪ من الخلايا.
      ملاحظة: يتم تحديد معدل الإصابة ب R. parkeri في خلايا ISE6 عن طريق تلطيخ Giemsa ، ويتراوح وقت الحضانة للوصول إلى 90٪ -100٪ من العدوى من 5 أيام إلى 7 أيام في المتوسط.
    4. تحديد معدل الإصابة عن طريق تلطيخ Giemsa.
      1. في خزانة السلامة الحيوية ، أعد تعليق مزارع الخلايا المصابة وانقل 50 ميكرولتر من المعلق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
      2. قم بتخفيف التعليق بوسط كامل (تخفيف 1: 5) وأجهزة طرد مركزي 100 ميكرولتر على شرائح مجهر زجاجية باستخدام جهاز طرد مركزي عند 113 × جم لمدة 5 دقائق. للحفاظ على احتواء R. parkeri الحي ، استخدم جهاز طرد مركزي مع دوار مغلق مصمم لإزالته من جهاز الطرد المركزي. يتيح ذلك نقل الدوار المختوم داخل وخارج غطاء المحرك.
        ملاحظة: نظرا لأن R. parkeri لا تزال على قيد الحياة قبل الطرد المركزي ، يجب احتواء العينة حتى يتم قتل الريكتسيا. وبالتالي ، يجب أن يكون لجهاز الطرد المركزي المستخدم لتدوير ثقافة R. parkeri على الشريحة دوار مغلق مصمم ليتم رفعه من جهاز الطرد المركزي. مع وجود الدوار في غطاء التدفق الصفحي ، قم بتحميل العينات في مجموعة شرائح مجهر القمع ، وأعد إغلاق الدوار ، ثم ضع الدوار المختوم مرة أخرى في جهاز الطرد المركزي. ثم قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي ، ويتم إيداع العينات على شرائح المجهر. بعد الانتهاء من التشغيل ، قم بإزالة الدوار المختوم من جهاز الطرد المركزي وضعه في غطاء التدفق الصفحي. هناك ، افتح غطاء الدوار ، وقم بتفريغ مجموعة شرائح مجهر القمع داخل الغطاء. بمجرد أن يجف ، اغمر شرائح المجهر الزجاجي في الميثانول المطلق ، الذي يقتل جميع مسببات الأمراض. يتم غمر القمع والناقلات المعدنية في DMQ المخفف ، مما يقتل R. parkeri.
      3. جفف الشرائح في الهواء وثبتها في الميثانول المطلق لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
      4. قم بتلطيخ الشرائح بصبغة Giemsa (4٪ في محلول سورنسون ، درجة الحموضة 6.6) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية واشطفها بالماء لمدة 5 ثوان.
      5. تحديد نسبة الإصابة (عدد الخلايا المصابة بالريكتسيا / 100 خلية) عن طريق الفحص المجهري الضوئي.
        ملاحظة: يوضح الشكل 1 نتائج بقع Giemsa النموذجية.
  2. تحضير R. parkeri الخالي من الخلايا
    ملاحظة: عند إصابة 90٪ -100٪ من الخلايا في المزرعة ، يجب عزل الريكتسيا عن خلايا ISE6 ويجب إجراء التثقيب الكهربائي.
    1. أضف حبيبات كربيد السيليكون المعقمة 60-90 إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة سعة 2 مل إلى حجم 0.2 مل تقريبا.
    2. قم بإزالة 2 مل من الوسط من 100٪ من الثقافات المصابة ب R. parkeri (الخطوة 1.1.3) وأعد تعليق الخلايا في 3 مل المتبقية من الوسط.
    3. انقل أجزاء متساوية من هذا التعليق إلى الأنابيب المعدة في الخطوة 1.2.1.
    4. دوامة كل أنبوب بسرعة عالية لمدة 30 ثانية ثم وضع الأنابيب على الجليد. دع الحصى يستقر في غضون ثوان عن طريق الجاذبية.
    5. في خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية ، احصل على حقنة معقمة سعة 5 مل جاهزة مع تمديد المكبس ونهاية المكبس مثبتة في قاعدة من البوليسترين لأنابيب مخروطية سعة 15 مل.
    6. باستخدام طرف ماصة حاجز معقم سعة 1 مل مثبت على ماصة مناسبة ، قم بإزالة طافي محللة الخلية الدوامة من الأنبوب ، مع الحرص على عدم استنشاق أي حصى. أدخل طرف الماصة في فتحة محور المحقنة وأخرج المحتويات في المحقنة بضغط لطيف. بدلا من ذلك ، استخدم ماصة باستور معقمة 2 مل تعمل بمصباح مطاطي.
    7. قم بتوصيل مرشح معقم بحجم المسام 2 ميكرومتر على محور المحقنة وقم بتصفية مزرعة R. parkeri من الخطوة 1.2.6 إلى أنابيب معقمة سعة 1.5 مل.
    8. اجمع R. parkeri عن طريق الطرد المركزي عند 13600 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
    9. أعد تعليق الحبيبات في 1.2 مل من السكروز المثلج 300 مللي مول وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 13600 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. كرر إعادة التعليق والطرد المركزي لما مجموعه غسلتين من السكروز.
    10. ادمج كريات R. parkeri في أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد ومعقم سعة 1.5 مل في 50 ميكرولتر من السكروز المثلج البارد 300 مللي مول لكل تحويل. نظرا لأن دورق واحد 25 سم2 من R. parkeri يوفر ما يكفي من الريكتسيا لتحويلين إلى ثلاثة تحويلات ، أضف 100-150 ميكرولتر من 300 ملي مل من السكروز البارد.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، يمكن حساب عدد الريكتسيا باستخدام غرفة عد Petroff-Hausser. عند استخدام التلقيح الأولي ل 5 × 107 -10 × 10 7 R. parkeri الخالية من الخلايا ، سيستغرق الأمر من 5 إلى 7 أيام في المتوسط للوصول إلى 90٪ -100٪ من العدوى ، مما ينتج عنه ما يقرب من 5 × 107-10 × 1010 R. parkeri الخالية من الخلايا.
    11. أعد تعليق الحبيبات برفق عن طريق السحب حتى يتم تشتيتها تماما. قسم العينة إلى أجزاء 50 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي دقيقة مبردة ومعقمة سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، يمكن تقييم صلاحية الريكتسية عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد التلوين بصبغة فلورية 21.

2. تحويل R. parkeri مع البلازميد pRAM18dSFA

  1. على الثلج ، أضف 3 ميكروغرام من pRAM18dSFA البلازميد DNA13،15،20 الخالي من السموم الداخلية إلى كل أنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من معلق R. parkeri وحرك الخليط بطرف الماصة برفق ولكن بدقة.
    ملاحظة: عند تحضير الحمض النووي للبلازميد، استخدم مجموعة تنقية تتضمن خطوة إزالة السموم الداخلية للحصول على الحمض النووي البلازميدالخالي من السموم الداخلية 23. وجدنا أن مجموعة من تركيزات البلازميد تتراوح بين 1 ميكروغرام و 3 ميكروغرام لكل 50 ميكرولتر من معلق R. parkeri أدت إلى تحولات ناجحة ، في حين أن زيادة كمية البلازميد إلى 10 ميكروغرام تمنع التحول.
  2. انقل الخليط أعلاه من DNA و R. parkeri إلى كوفيت كوفر مبرد ومعقم بفجوة 0.1 سم (اضغط برفق على الكوفيت حتى يتم توزيع الخليط بالتساوي) واتركه على الثلج لمدة 10-30 دقيقة.
  3. قم بإزالة الوسط من ثقافة متقاربة بنسبة 100٪ لخلايا ISE6 وأعد تعليق طبقات الخلية في 1.5 مل من الوسط الطازج باستخدام NaHCO 3 و HEPES buffer (الموصوف أعلاه في الخطوة 1.1.3). استخدم دورقا واحدا من الخلايا المتقاربة لكل تحويل.
  4. نقل الخلايا المعاد تعليقها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 2 مل (أنبوب واحد لكل دورق 25 سم2 من خلايا ISE6).
  5. قم بالكهرباء خليط R. parkeri / pRAM18dSFA عند 1.8 كيلو فولت ، 200 أوم ، 25 ميكرو فهرنهايت باستخدام جهاز كهربائي.
  6. باستخدام ماصة نقل معقمة وممتدة ذات طرف رفيع ، انقل كمية صغيرة من معلق الخلية ISE6 (الخطوة 2.4) إلى الكوفيت واسحب السائل برفق لأعلى ولأسفل لغسل الكوفيت. انقل الخليط إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل الذي يحتوي على ما تبقى من معلق الخلية ISE6 واخلط خليط التحويل برفق مع الخلايا.
  7. قم بالطرد المركزي للعينات المحولة عند 700 × جم لمدة 2 دقيقة عند RT ، ثم قم بزيادة سرعة الطرد المركزي إلى 13600 × جم لمدة 1 دقيقة أخرى في RT.
    ملاحظة: تعزز سرعتا الطرد المركزي الارتباط الريكتسي مع الخلايا والدخول إليها: يتم استخدام 700 × جم لسحب خلايا ISE6 لأسفل ، بينما يتم استخدام 13600 × جم لسحب الريكتسيا.
  8. اترك العينات تجلس عند RT أو 34 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى 1 ساعة.
  9. أعد تعليق المحولات (اثنان أو ثلاثة) في خلايا ISE6 بطرف ماصة حاجز معقم سعة 2 مل مثبت على ماصة وانقله إلى قوارير زراعة خلية 25 سم2 تحتوي على 3.5 مل من الوسط الطازج مع NaHCO3 و HEPES buffer. بدلا من ذلك ، استخدم ماصة باستور معقمة 2 مل تعمل بمصباح مطاطي.
  10. صخر القوارير لتوزيع الخليط بالتساوي ثم احتضانها عند 34 درجة مئوية.
  11. بعد 16-24 ساعة، أضف 10 ميكرولتر من سبكتينومايسين (50 ملغ/مل) و10 ميكرولتر من الستربتومايسين (50 ملغ/مل) إلى كل دورق في الخطوة 2.10.

3. مراقبة R. parkeri المحول

ملاحظة: استخدم مجهر فوق التألق مع مرشحات الرودامين / TRITC لمراقبة القوارير المحضرة في الخطوة 2.11 بعد 3-7 أيام. بمجرد ظهور اللويحات في الثقافات (5-14 يوما) ، يمكن رؤية R. parkeri المحولة التي تعبر عن البروتين الفلوري الأحمر mKATE ، المشفر على بلازميد pRAM18dSFA.

  1. الفحص المجهري متحد البؤر
    1. أعد تعليق مزارع الخلايا من قوارير الخطوة 2.11 واخلط 100 ميكرولتر من مزارع الخلايا هذه مع 5 ميكرولتر من محلول Hoechst 33342 لمدة 10-30 دقيقة في RT في الظلام.
      ملاحظة: Hoechst 33342 عبارة عن صبغة نووية قابلة للنفاذ الخلوي ترتبط بالحمض النووي لخلية القراد الحية وتنبعث منها مضان أزرق.
    2. جهاز طرد مركزي 50 ميكرولتر من الخليط على مجهر زجاجي ينزلق باستخدام جهاز طرد مركزي عند 5 × جم لمدة 3 دقائق.
    3. أضف 3 ميكرولتر من 1x PBS إلى بقعة الخلايا المودعة على الشريحة ، وتراكب مع زلة غطاء ، وعرض باستخدام مجهر متحد البؤر (هدف 60x). استخدم معلمات الإثارة والانبعاث التالية للتصوير الفلوري: ل 4′،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، الإثارة عند 350 نانومتر ، الانبعاث عند 470 نانومتر ؛ لرباعي ميثيل رودامين (TRITC) ، الإثارة عند 557 نانومتر ، الانبعاث عند 576 نانومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 مورفولوجيا R. parkeri في خلايا ISE6 تحت المجهر الضوئي بعد تلطيخ Giemsa. في الشكل 2 ، يتم عرض R. parkeri المحول الذي يعبر عن بروتين مضان أحمر في خلايا ISE6 باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. هناك زيادة كبيرة في معدل الإصابة ب R. parkeri المحولة (الحمراء) في خلايا ISE6 (الزرقاء ، تتوافق مع النوى) من (A) اليوم 7 إلى (B) اليوم 10 من الحضانة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نوضح طريقة لإدخال الحمض النووي الخارجي المشفر على المكوك البلازميد pRAM18dSFA في الريكتسيا باستخدام التثقيب الكهربائي. في هذا الإجراء ، تم تنقية الريكتسيا الخالية من الخلايا من الخلايا المضيفة ، وتحويلها باستخدام ناقل مكوك ريكتسي ، وإطلاقها على خلايا القراد للعدوى. يوصف أيضا إجراء مضان مناعي متحد البؤر للكشف عن بروتين مضان أحمر يعبر عن R. parkeri في خلايا القراد. طرق مماثلة قابلة للتطبيق على أنواع الريكتسيا الأخرى ومع مزيد من التعديلات قد تكون قابلة للتكيف مع البكتيريا الأخرى داخل الخلايا الملزمة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر تيموثي ج. كورتي وبنيامين كول على مناقشاتهما واقتراحاتهما الثاقبة. تم دعم هذه الدراسة ماليا بمنحة إلى U.G.M. من المعاهد الوطنية للصحة (2R01AI049424) ومنحة إلى U.G.M. من محطة مينيسوتا للتجارب الزراعية (MIN-17-078).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1 سم فجوة الجينات النابضة الكهربائية كوفيتBio-Rad1652083
2 & mu ؛ مرشح حجم المسام  GE Healthcare Life Sciences Whatman6783-2520
5 مل حقنة Luer-locke BD309646
60-90 حبيبات كربيد السيليكون  LORTONE, inc  591-056
الميثانول المطلق فيشر ScientificA457-4
باكتو مرق فوسفات التربتوز  BD260300
جهاز طرد مركزي Cytospin Cytospin4Thermo Fisher ScientificA78300003الدوار قابل للفصل بحيث يمكن وضع الدوار بالكامل في غطاء المحرك لتحميل عينات معدية
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)QIAGEN12362يستخدم للحصول على ماصة نقل طرف دقيقة ممتدة pRAM18dSFA
خالية من السموم الداخلية   ؛Perfector ScientificTP03-5301
مصل الأبقار الجنينية Gemini Bio900-108يجب اختبار دفعة FBS للتأكد من أن خلايا ISE6 ستنمو جيدا فيها.
جهاز التحكم الكهربائي Gene Pulser II مع وحدة التحكم في النبض PLUSBio-Rad165-2105 & 165-2110
مقياس الدمThermo Fisher Scientific267110
HEPESMillipore-SigmaH4034
ImageJمعهد فيجي الوطني للصحةتحرير الصور الخام
KaryoMAX Giemsa stain Gibco  2021-10-30
L-15 المتوسطمن ليبوفيتز
MP Biomedicals191476
نيكون Diaphotنيكونمجهر epifluorescence
نيكون NucBlue Live ReadyProbes Reagent Thermo Fisher ScientificR37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) مجهر متحد البؤر   ؛أوليمبوس
بيتروف-هوسر العد غرفةهوسر العلمية  الغرفة 3900
بيكربونات الصوديومMillipore-SigmaS5761
VortexFisher Vortex Genie 212-812
مركز البروتين الدهني 41300039

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266(2007).
  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
  5. Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173(2016).
  6. Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
  7. Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
  8. Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
  9. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
  10. Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
  11. Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
  12. Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
  13. Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511(2011).
  14. Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310(2012).
  15. Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
  16. Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34(2016).
  17. Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
  18. Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
  19. Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152(2020).
  20. Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
  21. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  22. Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
  23. Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
  24. Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965(2015).
  25. Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
  26. Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
  27. Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
  28. Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة