مقالة منهجية

في سيليكو تحديد وتوصيف الحمض النووي الريبي السيرك أثناء التفاعلات بين المضيف والممرض

DOI:

10.3791/64565

⸱

أكتوبر 21, 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre for Research in Biotechnology for Agriculture (CEBAR), Universiti Malaya

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشرح البروتوكول المقدم هنا خط أنابيب السيليكو الكامل اللازم للتنبؤ بالحمض النووي الريبي الدائري وتوصيفه وظيفيا من بيانات نسخ تسلسل الحمض النووي الريبي التي تدرس تفاعلات المضيف والممرض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحمض النووي الريبي الدائري (circRNAs) هي فئة من الحمض النووي الريبي غير المشفر الذي يتم تشكيله عن طريق الربط الخلفي. تتم دراسة هذه الحمضيات الراديكالية في الغالب لأدوارها كمنظم للعمليات البيولوجية المختلفة. والجدير بالذكر أن الأدلة الناشئة توضح أنه يمكن التعبير عن الحمض النووي الريبوزي الريسي المضيف بشكل تفاضلي (DE) عند الإصابة بمسببات الأمراض (مثل الأنفلونزا وفيروسات كورونا) ، مما يشير إلى دور ل circRNAs في تنظيم الاستجابات المناعية الفطرية للمضيف. ومع ذلك ، فإن التحقيقات حول دور circRNAs أثناء العدوى المسببة للأمراض محدودة بالمعرفة والمهارات المطلوبة لإجراء التحليل المعلوماتي الحيوي اللازم لتحديد DE circRNAs من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq). يعد التنبؤ بالمعلوماتية الحيوية وتحديد circRNAs أمرا بالغ الأهمية قبل أي تحقق ، والدراسات الوظيفية باستخدام تقنيات المختبر الرطب المكلفة والمستهلكة للوقت. لحل هذه المشكلة ، يتم توفير بروتوكول خطوة بخطوة للتنبؤ بالسيليكو وتوصيف circRNAs باستخدام بيانات RNA-seq في هذه المخطوطة. يمكن تقسيم البروتوكول إلى أربع خطوات: 1) التنبؤ والقياس الكمي ل DE circRNAs عبر خط أنابيب CIRIquant. 2) التعليق التوضيحي عبر circBase وتوصيف DE circRNAs ؛ 3) التنبؤ بتفاعل CircRNA-miRNA من خلال خط أنابيب Circr ؛ 4) تحليل الإثراء الوظيفي للجينات الأبوية circRNA باستخدام علم الوجود الجيني (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG). سيكون خط الأنابيب هذا مفيدا في قيادة الأبحاث المستقبلية في المختبر وفي الجسم الحي لزيادة كشف دور circRNAs في تفاعلات المضيف والممرض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل التفاعلات بين المضيف ومسبب المرض تفاعلا معقدا بين مسببات الأمراض والكائنات الحية المضيفة ، مما يؤدي إلى استجابات مناعية فطرية للمضيفين تؤدي في النهاية إلى إزالة مسببات الأمراض الغازية 1,2. أثناء العدوى المسببة للأمراض ، يتم تنظيم العديد من الجينات المناعية المضيفة لمنع تكاثر مسببات الأمراض وإطلاقها. على سبيل المثال ، تشمل الجينات الشائعة المحفزة بالإنترفيرون (ISGs) التي يتم تنظيمها عند العدوى المسببة للأمراض ADAR1 و IFIT1 و IFIT2 و IFIT3 و ISG20 و RIG-I و OASL 3,4. إلى جانب الجينات المشفرة للبروتين ، أفادت الدراسات أيضا أن الحمض النووي الريبي غير المشفر مثل الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNAs) والحمض النووي الريبي الصغير (miRNAs) والحمض النووي الريبي الدائري (circRNAs) تلعب أيضا دورا ويتم تنظيمها بشكل متزامن أثناء العدوى المسببة للأمراض5،6،7. على عكس الجينات المشفرة للبروتين التي تشفر البروتينات بشكل أساسي كجزيئات وظيفية ، من المعروف أن الحمض النووي الريبي غير المشفر (ncRNAs) يعمل كمنظم للجينات على مستويات النسخ وما بعد النسخ. ومع ذلك ، فإن الدراسات التي تنطوي على مشاركة الحمض النووي الريبي غير المشفر ، وخاصة circRNAs ، في تنظيم الجينات المناعية للمضيفين لم يتم الإبلاغ عنها بشكل جيد مقارنة بالجينات المشفرة للبروتين.

تتميز CircRNAs على نطاق واسع ببنية الحلقة المستمرة المغلقة تساهميا ، والتي يتم إنشاؤها من خلال عملية ربط غير قانونية تسمى الربط الخلفي8. تتضمن عملية الربط الخلفي ، على عكس عملية الربط للحمض النووي الريبي الخطي المشابه ، ربط موقع المتبرع في اتجاه مجرى النهر بموقع المستقبل في المنبع ، مما يشكل بنية دائرية الشكل. حاليا ، تم اقتراح ثلاث آليات مختلفة للربط الخلفي للتكوين الحيوي ل circRNAs. هذه هي التعميم بوساطة بروتين ربط الحمض النووي الريبي (RBP)9,10 ، والتعميم المدفوع بالاقترانالداخلي 11 ، والتعميم الذي يحركه lariat12,13,14. بالنظر إلى أن الحمضيات الحمضية RNAs متصلة من طرف إلى طرف في بنية دائرية ، فإنها تميل إلى أن تكون مقاومة بشكل طبيعي لهضم exonuclease الطبيعي ، وبالتالي ، تعتبر أكثر استقرارا من نظيراتها الخطية15. تشمل الخاصية الشائعة الأخرى التي يظهرها circRNAs التعبير الخاص بنوع الخلية أو الأنسجة في المضيفين16.

كما يتضح من هيكلها الفريد وتعبيرها الخاص بالخلية أو الأنسجة ، تم اكتشاف أن circRNAs تلعب وظائف بيولوجية مهمة في الخلايا. حتى الآن ، تتمثل إحدى الوظائف البارزة ل circRNAs في دورها كإسفنج microRNA (miRNA)17,18. يحدث هذا الدور التنظيمي ل circRNAs من خلال الارتباط التكميلي لنيوكليوتيدات circRNA مع منطقة البذور من miRNAs. مثل هذا التفاعل circRNA-miRNA يمنع الوظائف التنظيمية الطبيعية ل miRNAs على mRNAs المستهدفة ، وبالتالي تنظيم التعبير عن الجينات19,20. بالإضافة إلى ذلك ، من المعروف أيضا أن circRNAs تنظم التعبير الجيني من خلال التفاعل مع بروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RBPs) وتشكيل مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي21. على الرغم من تصنيف circRNAs على أنها RNAs غير مشفرة ، إلا أن هناك أيضا أدلة على أن circRNAs يمكن أن تعمل كقوالب لترجمة البروتين22،23،24.

في الآونة الأخيرة ، ثبت أن circRNAs تلعب أدوارا محورية في تنظيم التفاعلات بين المضيف والممرض ، خاصة بين المضيفين والفيروسات. بشكل عام ، يفترض أن تساعد الحمض النووي الريبوزي الدائري المضيف في تنظيم الاستجابات المناعية للمضيف للقضاء على مسببات الأمراض الغازية. مثال على circRNA الذي يعزز الاستجابات المناعية للمضيف هو circRNA_0082633 ، الذي أبلغ عنه Guo et al.25. يعزز هذا الحمض النووي الريبي الدائري إشارات الإنترفيرون من النوع الأول (IFN) داخل خلايا A549 ، مما يساعد على قمع تكاثر فيروسالأنفلونزا 25. علاوة على ذلك ، أبلغ Qu et al. أيضا عن وجود حمض نووي روسي بشري ، يسمى circRNA AIVR ، والذي يعزز المناعة من خلال تنظيم التعبير عن البروتين المرتبط ب CREB (CREBBP) ، وهو محول إشارة IFN-β26,27. ومع ذلك ، توجد أيضا circRNAs المعروفة بتعزيز التسبب في المرض عند الإصابة. على سبيل المثال، أبلغ يو وآخرون مؤخرا عن الدور الذي يلعبه الحمض النووي الريبوزي السيرك المقسم من مجال إصبع الزنك GATA الذي يحتوي على الجين 2A (circGATAD2A) في تعزيز تكاثر فيروس H1N1 من خلال تثبيط الالتهام الذاتي للخلية المضيفة28.

لدراسة circRNAs بشكل فعال ، عادة ما يتم تنفيذ خوارزمية التنبؤ ب circRNA على مستوى الجينوم ، متبوعة بتوصيف السيليكو لمرشحي circRNA المتوقعين قبل إجراء أي دراسات وظيفية. مثل هذا النهج المعلوماتية الحيوية للتنبؤ وتوصيف circRNAs أقل تكلفة وأكثر كفاءة من حيث الوقت. فهو يساعد على تحسين عدد المرشحين للدراسة وظيفيا ويمكن أن يؤدي إلى نتائج جديدة. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا قائما على المعلوماتية الحيوية لتحديد السيليكو والتوصيف والتعليق الوظيفي ل circRNAs أثناء تفاعلات المضيف والممرض. يتضمن البروتوكول تحديد وقياس circRNAs من مجموعات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي ، والتعليق التوضيحي عبر circBase ، وتوصيف المرشحين circRNA من حيث أنواع circRNA ، وعدد الجينات المتداخلة ، والتفاعلات المتوقعة بين circRNA-miRNA. توفر هذه الدراسة أيضا شرحا وظيفيا للجينات الأبوية circRNA من خلال علم الوجود الجيني (GO) وتحليل إثراء موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، تم تنزيل مجموعات بيانات مكتبة RNA-seq المستنفدة للريبوسوم (rRNA) المنضب من خلايا البلاعم البشرية المصابة بفيروس الأنفلونزا A واستخدامها من قاعدة بيانات Gene Expression Omnibus (GEO). يتم تلخيص خط أنابيب المعلوماتية الحيوية بالكامل من التنبؤ إلى التوصيف الوظيفي ل circRNAs في الشكل 1. يتم شرح كل جزء من خط الأنابيب بشكل أكبر في الأقسام أدناه.

1. التحضير والتنزيل والإعداد قبل تحليل البيانات

ملاحظة: جميع حزم البرامج المستخدمة في هذه الدراسة مجانية ومفتوحة المصدر.

  1. تنزيل الأدوات المطلوبة على منصة Linux
    1. قم بتنزيل وتثبيت البرامج والأدوات المطلوبة المدرجة في جدول المواد على جهاز كمبيوتر Linux عالي الأداء باستخدام الإرشادات المقدمة من المطور.
      ملاحظة: تحتوي معظم الأدوات والبرامج على صفحات GitHub الخاصة بها عبر الإنترنت أو وثائق تحتوي على إرشادات حول تثبيت أدواتها واستخدامها (راجع جدول المواد).
    2. قم بتنزيل مجموعات بيانات RNA-seq المطلوبة للكشف عن circRNA وتحليلها من مواقع أرشيف التسلسل (على سبيل المثال ، أرشيف النيوكليوتيدات الأوروبية والتعبير الجيني الشامل).
    3. قم بتنزيل الجينوم المرجعي (تنسيق FASTA) وملفات التعليقات التوضيحية (تنسيق GTF / GFF3) ، المتوافقة مع المضيف الذي تم إعداد مجموعة بيانات RNA-seq منه. عادة ما توجد ملفات الجينوم (الجينوم) المرجعي للمضيف وملفات التعليقات التوضيحية على متصفحات الجينوم عبر الإنترنت مثل المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) وجامعة كاليفورنيا سانتا كروز (UCSC) ومواقع Ensembl على الويب.
  2. فحص جودة RNA-seq
    1. أدخل ملفات FASTQ في برنامج FASTQC لتحديد جودة تسلسلات الحمض النووي الريبي. إذا كانت جودة ملفات FASTQ منخفضة (على سبيل المثال ، 29,30.

2. التنبؤ وتحليل التعبير التفاضلي ل circRNAs باستخدام CIRIquant

ملاحظة: يمكن العثور على دليل أكثر تفصيلا حول تثبيت وإجراء تحليل التعبير التفاضلي في قسم توفر الكود في ورقة CIRIquant31. تتضمن البيانات التكميلية أيضا بعض الأوامر الأساسية المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. توقعات سيرك الحمض النووي الريبي
    1. فهرس الجينوم المرجعي للمضيف أولا باستخدام مصففات BWA و HISAT2. بعد ذلك ، على محطة Linux ، قم بتنفيذ الأوامر bwa index 32 و hisat2-build33 في دليل الجينوم المرجعي للمضيف لفهرسته.
    2. بعد ذلك ، قم بإعداد ملف تكوين YML يحتوي على اسم الملف ومسار الأدوات (BWA و HISAT2 و stringtie34 و samtools35) والمسار إلى الملفات المرجعية التي تم تنزيلها (ملفات FASTA للجينوم المرجعي للمضيف وملفات التعليقات التوضيحية) والمسار إلى ملفات الفهرس من الخطوة 2.1.1.
    3. قم بتنفيذ أداة CIRIquant من المحطة الطرفية باستخدام المعلمات الافتراضية أو اليدوية. يمكن للمستخدم تحديد نوع المكتبة (إما تقطعت بهم السبل أو غير تقطعت بهم السبل) لبيانات RNA-seq عند تنفيذ أداة CIRIquant.
      ملاحظة: يمكن تحديد نوع مكتبة بيانات RNA-seq من خلال معرفة نوع مجموعة أدوات إعداد المكتبة المستخدمة. إذا كانت هوية مجموعة إعداد المكتبة غير معروفة ، فيمكن استخدام حزمة معلوماتية حيوية للتحكم في RNA-seq تسمى RSeQC36 لتحديد تقطع السبل ببيانات RNA-seq.
  2. تحليل التعبير التفاضلي
    ملاحظة: تتضمن حزمة CIRIquant prep_CIRIquant و prepDE.py و CIRI_DE_replicate ؛ لذلك ، ليست هناك حاجة إلى تنزيلات إضافية لهذه الأدوات الثلاث.
    1. قم بإعداد ملف نصي (.lst) مع قائمة بيانات تحتوي على ما يلي:
      العمود الأول: معرفات بيانات RNA-seq المستخدمة في الخطوة 2.1.3
      العمود 2: المسار إلى ملفات GTF الناتجة عن CIRIquant
      العمود 3: تجميع بيانات RNA-seq ، سواء كانت مجموعة تحكم أو معالجة.
    2. على سبيل المثال، يرجى الرجوع إلى الجدول 1 أدناه.
      ملاحظة: ليس من الضروري وضع الرؤوس لأنها للإشارة فقط.
    3. على جهاز Linux ، قم بتشغيل prep_CIRIquant باستخدام الملف النصي (.lst) الذي تم إعداده في الخطوة 2.2.1 كمدخل. سيؤدي التشغيل إلى إنشاء قائمة بالملفات: library_info.csv و circRNA_info.csv و circRNA_bsj.csv و circRNA_ratio.csv.
    4. قم بإعداد ملف نصي ثان يحتوي على قائمة بالبيانات التي تحتوي على معرفات RNA-seq والمسار إلى إخراج StringTie الخاص بكل منها. يجب أن يكون تخطيط الملف مشابها للملف النصي في الخطوة 2.2.1 بدون عمود التجميع.
    5. قم بتشغيل prepDE.py باستخدام الملف النصي الذي تم إعداده في الخطوة 2.2.4 كإدخال لإنشاء ملفات مصفوفة عدد الجينات.
    6. قم بتنفيذ CIRI_DE_replicate باستخدام ملفات library_info.csv و circRNA_bsj.csv من الخطوة 2.2.3 وملف gene_count_matrix.csv من الخطوة 2.2.5 كمدخلات لإخراج ملف circRNA_de.tsv النهائي.
  3. تصفية DE circRNAs
    1. استخدم R (في محطة الكمبيوتر أو RStudio) أو أي برنامج جدول بيانات (على سبيل المثال ، Microsoft Excel) لفتح ملف circRNA_de.tsv الذي تم إنشاؤه من الخطوة 2.2.6 لتصفية وتحديد عدد circRNAs المعبر عنها تفاضليا (DE).
    2. قم بتصفية DE circRNAs وفقا لمعايير LogFC > |2| و FDR < 0.05.
    3. قم بإنشاء ملف باسم DE_circRNAs.txt لتخزين معلومات DE circRNAs.

3. توصيف وشرح DE circRNAs المتوقعة

  1. حالة التعليق التوضيحي ل DE circRNAs
    1. قم بتحميل الملف المسمى DE_circRNAs.txt في RStudio ، والذي يتكون من قائمة DE circRNAs التي تمت تصفيتها من الخطوة 2.3.3. قم بتضمين معلومات أخرى مثل المواضع الجينومية (Chr ، Start ، End) ، اتجاهات الشريط (+ أو -) ، اسم الجين ، ونوع circRNA. قبل المتابعة ، قم بتحويل إحداثيات البدء الجينومي circRNA من CIRIquant إلى 0 عن طريق طرح 1 زوج أساسي.
      ملاحظة: يمكن الحصول على المعلومات الأخرى المذكورة أعلاه من ملفات GTF التي تم إخراجها بواسطة CIRIquant (الملف التكميلي 1).
    2. حدد حالة التعليق التوضيحي ل DE circRNAs المتوقعة عن طريق تنزيل مكتبة تحتوي على المواضع الجينومية لقاعدة بيانات circRNA (على سبيل المثال ، circBase) المودعة circRNAs.
      ملاحظة: تأكد من أن نسخة الجينوم المستخدمة للتنبؤ ب circRNAs مطابقة لمكتبة قاعدة بيانات circRNA قبل إجراء المقارنة. يتوفر ملف بيانات circBase المستخدم هنا مجانا في مجلد محرك الأقراص المتوفر في Github (https://github.com/bicciatolab/Circr) 37.
    3. بمجرد إعداد كل من الملفات من الخطوة 3.1.1 والخطوة 3.1.2 ، قم بتشغيل البرنامج النصي R الوارد في الملف التكميلي 1. يتم الاستعلام عن مواقع الكروموسومات ل DE circRNAs إلى المكتبة قبل تعيين الحالة مشروحة أو غير مشروحة.
  2. توصيف DE circRNAs
    1. استخدم R وبرامج جداول البيانات الأخرى لتلخيص عدد circRNAs وفقا لأنواع circRNA (أي exon و intron و intergenic و antisense) وعدد الجينات التي تمتد عبر circRNAs (1 أو >1) (الملف التكميلي 1).ملاحظة: يمكن ل CIRIquant اكتشاف أربعة أنواع فقط من circRNAs (إكسون ، إنترون ، بين الجينات ، ومضاد للحساسية). لا يمكن اكتشاف Exon-intron circRNAs ، المعروف أيضا باسم ElciRNAs ، بواسطة CIRIquant.

4. التنبؤ بتفاعل circRNA-miRNA باستخدام Circr

ملاحظة: يمكن العثور على دليل أكثر تفصيلا حول كيفية تثبيت واستخدام Circr لتحليل تفاعل circRNA-miRNA على: https://github.com/bicciatolab/Circr 37.

  1. إعداد الملفات
    1. قم بفك ضغط واستخراج محتويات ملف Circr.zip بعد تنزيله من صفحة Circr GitHub باستخدام البرامج ذات الصلة مثل "WinRar" أو "7-zip" في دليل جديد حيث سيتم إجراء التحليل.
    2. قم بتثبيت التطبيقات البرمجية الأساسية (miRanda و RNAhybrid و Pybedtools و samtools) قبل إجراء تحليل circRNA-miRNA.
    3. يتم توفير الجينومات المرجعية وملفات التعليقات التوضيحية للعديد من الكائنات الحية ذات الأهمية ، وملف إحداثيات rRNA ، وملف تفاعل miRNA الذي تم التحقق من صحته ، وملفات circBase circRNA بواسطة مؤلف Circr في صفحة Github (https://github.com/bicciatolab/Circr) 37. عند النقر فوق ملفات الدعم في مجلد محرك الأقراص ، حدد المجلد الخاص بالكائن محل الاهتمام ومجلد miRNA والملف النصي circBase وقم بتنزيله.
    4. بعد تنزيل الملفات الضرورية في الخطوة 4.1.3 ، قم بإنشاء دليل جديد باسم support_files في الدليل المذكور في الخطوة 4.1.1. بعد ذلك ، قم بفك ضغط المحتوى واستخراجه في دليل support_files .
    5. فهرس ملف الجينوم المرجعي للكائن محل الاهتمام باستخدام الأمر samtools faidx (الملف التكميلي 1).
    6. قم بإعداد ملف إدخال يتكون من إحداثيات DE circRNAs ذات الأهمية في ملف BED محدد بعلامات جدولة ، كما هو موضح في الجدول 2.
      ملاحظة: نظرا لأن circRNAs التي تنبأ بها CIRIquant لا تستند إلى 0 ، فمن الضروري ناقص 1 نقطة أساس عند إحداثيات البداية (كما هو مذكور في الخطوة 3.1.1) قبل تحويلها إلى تنسيق BED. الرؤوس الموضحة في الجدول 2 هي للإشارة فقط وليست مطلوبة في ملفات BED.
    7. في هذه المرحلة ، تأكد من أن بنية شجرة المجلد المتوقعة لتحليل Circr كما في الشكل 2.
  2. الجري Circr.py
    1. قم بتنفيذ Circr.py باستخدام Python 3 ، وكوسيطات ، حدد ملف إدخال circRNA ، وجينوم FASTA للكائن الحي محل الاهتمام ، وإصدار الجينوم للكائن المحدد ، وعدد مؤشرات الترابط ، واسم ملف الإخراج في سطر الأوامر.
    2. إذا لم يتم توفير الكائن محل الاهتمام في مجلد محرك الأقراص المدرج في الخطوة 4.1.3 أو إذا كان المستخدم يفضل أن يكون لديه مجموعة مخصصة من الملفات لتشغيل التحليل ، فيجب تضمين أوامر إضافية تحدد موقع هذه الملفات عند تنفيذ Circr.py.
    3. بعد اكتمال تحليل Circr ، يقوم البرنامج بإخراج ملف تفاعل circRNA-miRNA بتنسيق csv.
    4. قم بتصفية نتائج تفاعل circRNA-miRNA وفقا للتفضيل الخاص بالمستخدم. بالنسبة لهذه الدراسة ، يتم تصفية التنبؤات باستخدام Rstudio وفقا للمعايير أدناه:
      -الكشف عنها من قبل جميع أدوات البرمجيات الثلاثة
      - موقعان ملزمان أو أكثر تم الإبلاغ عنهما من قبل كل من Targetcan و miRanda
      -تم تحديدها في الأعمدة "AGO" أو "تم التحقق من صحتها"
      -تصفية أي تفاعلات منطقة البذور
    5. اكتب circRNAs التي تمرر الشروط التي تمت تصفيتها من الخطوة 4.2.3 إلى ملف نصي جديد باسم circRNA_miRNA.txt. يمكن أن تزيد هذه التصفية من ثقة التفاعلات المتوقعة.

5. بناء شبكة ceRNA

ملاحظة: يمكن العثور على دليل مفصل حول كيفية استخدام Cytoscape على: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ و https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction

  1. التنزيل والتحضير
    1. قم بتنزيل أحدث إصدار من Cytoscape38 من: https://cytoscape.org/download.html.
    2. قم بتنفيذ معالج المثبت الذي تم تنزيله في الخطوة 5.1.1 وحدد موقع الملف لبرنامج Cytoscape.
    3. قم بإعداد ملف محدد بعلامات جدولة يحتوي على circRNAs ذات الأهمية و miRNA المستهدفة. يتكون العمود الأول من اسم circRNA. يحدد العمود الثاني نوع الحمض النووي الريبي من العمود الأول ؛ العمود الثالث هو miRNA المستهدف ؛ ويحدد العمود الرابع نوع الحمض النووي الريبي من العمود الثالث. يظهر مثال على الملف في الجدول 3.
  2. بناء خريطة شبكة ceRNA
    1. افتح برنامج Cytoscape المثبت في الخطوة 5.1.2.
    2. في Cytoscape، انتقل إلى ملف > استيراد شبكة > من ملف. حدد الملف الذي تم إعداده في الخطوة 5.1.3.
    3. في علامة التبويب الجديدة ، حدد العمود الأول والثاني ك "عقدة المصدر" و "سمة عقدة المصدر" بينما حدد العمود الثالث والرابع ك "العقدة الهدف" و "سمة العقدة الهدف" على التوالي. انقر فوق "موافق" وستظهر الشبكة في الجانب الأيمن العلوي من Cytoscape.
    4. لتغيير النمط المرئي للشبكة ، اضغط على زر النمط على الجانب الأيسر من Cytoscape.
    5. اضغط على السهم الموجود على الجانب الأيسر من لون التعبئة. اختر الكتابة للعمود والتعيين المنفصل لنوع التعيين . ثم حدد اللون المطلوب لكل نوع من أنواع الحمض النووي الريبي.
    6. بعد تغيير اللون ، قم بتغيير شكل العقد بالانتقال إلى الشكل واتباع الخطوة 5.2.5.

6. تحليل الإثراء الوظيفي

  1. تحليل أنطولوجيا الجينات (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) للجين الأبوي ل circRNAs
    1. تأكد من clusterProfiler 39,40 والمؤسسة. Hs.eg.db تم تركيب 41 حزمة في Rstudio. المؤسسة. حزمة Hs.eg.db41 هي حزمة تعليقات توضيحية على مستوى الجينوم للبشر فقط. إذا كان الكائن الحي محل الاهتمام هو نوع آخر ، فارجع إلى: https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb
    2. استيراد معلومات DE_circRNA من الخطوة 2.3.1 إلى مساحة عمل Rstudio.
    3. استخدم الجين الأبوي ل circRNAs المتوفرة في هذا الملف لتحليل التخصيب في الخطوات القادمة. ومع ذلك ، إذا رغب المستخدم في تحويل رمز الجين إلى تنسيقات أخرى ، مثل معرف Entrez ، فاستخدم وظيفة مثل "bitr".
    4. باستخدام معرف الجين كمدخل، قم بتشغيل تحليل التخصيب GO باستخدام الدالة enrichGO داخل حزمة clusterProfiler39,40 باستخدام المعلمات الافتراضية.
    5. باستخدام معرف الجين كمدخل ، قم بتشغيل تحليل التخصيب KEGG باستخدام وظيفة enrichKEGG داخل حزمة clusterProfiler39,40 باستخدام المعلمات الافتراضية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تعديل البروتوكول المدرج في القسم السابق وتكوينه ليناسب نظام التشغيل Linux. السبب الرئيسي هو أن معظم مكتبات الوحدات والحزم المشاركة في تحليل circRNAs يمكن أن تعمل فقط على نظام Linux الأساسي. في هذا التحليل ، تم تنزيل مجموعات بيانات مكتبة RNA-seq المستنفدة للريبوسوم (rRNA) المحضرة من خلايا البلاعم البشرية المصابة بفيروس الأنفلونزا A من قاعدة بيانات GEO42 واستخدمت لتوليد النتائج التمثيلية.

التنبؤ بالحمض النووي الريبي السيرك والقياس الكمي
في هذا التحل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتوضيح فائدة هذا البروتوكول ، تم استخدام RNA-seq من خلايا البلاعم البشرية المصابة بفيروس الأنفلونزا A كمثال. تم التحقيق في عمل CircRNAs كإسفنج miRNA محتمل في تفاعلات المضيف والممرض والتخصيب الوظيفي GO و KEGG داخل المضيف. على الرغم من وجود مجموعة متنوعة من أدوات circRNA المتاحة عبر الإنترنت ، إلا أن كل منها عبارة عن حزمة قائمة بذاتها لا تتفاعل مع بعضها البعض. هنا ، قمنا بتجميع عدد قليل من الأدوات المطلوبة للتنبؤ ب circRNA وقياسه ، والإثراء الوظيفي ل circRNA ، والتنبؤ بتفاعل circRNA-miRNA ، وبناء شبكة ceRNA. هذا البروتوكول...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلف أن يشكر تان كي إن والدكتور كاميرون براكين على مراجعتهما النقدية لهذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل بمنح من برنامج منح البحوث الأساسية (FRGS / 1/2020 / SKK0 / UM / 02/15) ومنحة جامعة مالايا للأبحاث عالية التأثير (UM. () الوثيقة C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أدوات السريرGitHubhttps://github.com/arq5x/bedtools2/بالإشارة إلى القسم 4.1.2. مطلوب ل Circr.
BWABurrows-Wheeler Alignerhttp://bio-bwa.sourceforge.net/بالإشارة إلى القسم 2.1.1 و 2.1.2. مطلوب لتشغيل CIRIquant ، وفهرسة الجينوم
CircrGitHubhttps://github.com/bicciatolab/Circrالإشارة إلى القسم 4. استخدم للتنبؤ بمواقع ربط miRNA
CIRIquantGitHubhttps://github.com/bioinfo-biols/CIRIquantبالإشارة إلى القسم 2.1.3. للتنبؤ ب circRNAs
ClusterprofilerGitHubhttps://github.com/YuLab-SMU/clusterProfilerالإشارة إلى القسم 7. لوحدة المعالجة المركزية للتخصيب الوظيفي GO و KEGG
Intel& nbsp ؛ Intel(R) Xeon(R) وحدة المعالجة المركزية E5-2620 V2 @ 2.10 جيجاهرتز    النوى: وحدة المعالجة المركزية 6 النواة الذاكرة: 65 جيجابايت بطاقة الرسومات: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000)  المواصفات المستخدمة لتشغيل هذا البروتوكول بأكمله.
CytoscapeCytoscapehttps://cytoscape.org/download.htmlبالإشارة إلى القسم 5.2. مطلوب لرسم شبكة ceRNA
FastQCBabraham Bioinformaticshttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/بالإشارة إلى القسم 1.2.1. فحص الجودة على ملفات Fastq
HISAT2http://daehwankimlab.github.io/hisat2/بالإشارة إلى القسم 2.1.1 و 2.1.2. مطلوب لتشغيل CIRIquant ، وفهرسة الجينوم
LinuxUbuntu 20.04.5 LTS (الحفرة البؤرية)https://releases.ubuntu.com/focal/مطلوب لتشغيل البروتوكول بأكمله. قد تظل إصدارات Ubuntu الأخرى صالحة لتنفيذ البروتوكول.
miRandahttp://www.microrna.org/microrna/getDownloads.doبالإشارة إلى القسم 4.1.2. مطلوب ل Circr
Pybedtoolspybedtools 0.8.2https://pypi.org/project/pybedtools/مطلوب للتلاعب الجيني بملف BED
PythonPython 2.7 و 3.6 أو aboverhttps://www.python.org/downloads/لتشغيل وحدات المكتبة الضرورية
Rشبكة أرشيفR الشاملة https://cran.r-project.org/لمعالجة إطارات البيانات
RNAhybridBiBiServhttps://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybridبالإشارة إلى القسم 4.1.2. مطلوب ل Circr
RStudioRStudiohttps://www.rstudio.com/مساحة عمل لتشغيل R
samtools SAMtoolshttp://www.htslib.org/بالإشارة إلى القسم 2.1.2. مطلوب لتشغيل CIRIquant
StringTieجامعة جونز هوبكنز: مركز البيولوجيا الحاسوبيةhttp://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtmlالإشارة إلى القسم 2.1.2. مطلوب لتشغيل CIRIquant
TargetScanGitHubhttps://github.com/nsoranzo/targetscanالإشارة إلى القسم 4.1.2. مطلوب ل Circr

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raman, K., Bhat, A. G., Chandra, N. A systems perspective of host-pathogen interactions: predicting disease outcome in tuberculosis. Molecular BioSystems. 6 (3), 516-530 (2010).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Yang, E., Li, M. M. H. All About the RNA: Interferon-stimulated genes that interfere with viral RNA processes. Frontiers in Immunology. 11, 605024(2020).
  4. Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: A complex web of host defenses. Annual Review of Immunology. 32 (1), 513-545 (2014).
  5. Shirahama, S., Miki, A., Kaburaki, T., Akimitsu, N. Long non-coding RNAs involved in pathogenic infection. Frontiers in Genetics. 11, 454(2020).
  6. Chandan, K., Gupta, M., Sarwat, M. Role of host and pathogen-derived microRNAs in immune regulation during infectious and inflammatory diseases. Frontiers in Immunology. 10, 3081(2019).
  7. Chen, X., et al. Circular RNAs in immune responses and immune diseases. Theranostics. 9 (2), 588-607 (2019).
  8. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  9. Ashwal-Fluss, R., et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 56 (1), 55-66 (2014).
  10. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  11. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  12. Robic, A., Demars, J., Kuhn, C. In-depth analysis reveals production of circular RNAs from non-coding sequences. Cells. 9 (8), 1806(2020).
  13. Eger, N., Schoppe, L., Schuster, S., Laufs, U., Boeckel, J. N. Circular RNA splicing. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1087, 41-52 (2018).
  14. Barrett, S. P., Wang, P. L., Salzman, J. Circular RNA biogenesis can proceed through an exon-containing lariat precursor. eLife. 4, 07540(2015).
  15. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  16. Misir, S., Wu, N., Yang, B. B. Specific expression and functions of circular RNAs. Cell Death and Differentiation. 29 (3), 481-491 (2022).
  17. Bai, S., et al. Construct a circRNA/miRNA/mRNA regulatory network to explore potential pathogenesis and therapy options of clear cell renal cell carcinoma. Scientific Reports. 10 (1), 13659(2020).
  18. Sakshi, S., Jayasuriya, R., Ganesan, K., Xu, B., Ramkumar, K. M. Role of circRNA-miRNA-mRNA interaction network in diabetes and its associated complications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 1291-1302 (2021).
  19. Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
  20. Lu, M. Circular RNA: functions, applications, and prospects. ExRNA. 2 (1), 15(2020).
  21. Liu, K. S., Pan, F., Mao, X. D., Liu, C., Chen, Y. J. Biological functions of circular RNAs and their roles in occurrence of reproduction and gynecological diseases. American Journal of Translational Research. 11 (1), 1-15 (2019).
  22. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  23. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  24. Weigelt, C. M., et al. An insulin-sensitive circular RNA that regulates lifespan in Drosophila. Molecular Cell. 79 (2), 268-279 (2020).
  25. Guo, Y., et al. Identification and characterization of circular RNAs in the A549 cells following Influenza A virus infection. Veterinary Microbiology. 267, 109390(2022).
  26. Qu, Z., et al. A novel intronic circular RNA antagonizes influenza virus by absorbing a microRNA that degrades CREBBP and accelerating IFN-β production. mBio. 12 (4), 0101721(2021).
  27. Kawarada, Y., et al. TGF-β induces p53/Smads complex formation in the PAI-1 promoter to activate transcription. Scientific Reports. 6 (1), 35483(2016).
  28. Yu, T., et al. Circular RNA GATAD2A promotes H1N1 replication through inhibiting autophagy. Veterinary Microbiology. 231, 238-245 (2019).
  29. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  30. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  31. Zhang, J., Chen, S., Yang, J., Zhao, F. Accurate quantification of circular RNAs identifies extensive circular isoform switching events. Nature Communications. 11 (1), 90(2020).
  32. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  33. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nature Biotechnology. 37 (8), 907-915 (2019).
  34. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature Biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  35. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  36. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
  37. Dori, M., Caroli, J., Forcato, M. Circr, a computational tool to identify miRNA:circRNA associations. Frontiers in Bioinformatics. 2, 852834(2022).
  38. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  39. Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. The Innovation. 2 (3), 100141(2021).
  40. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS: A Journal of Integrative Biology. 16 (5), 284-287 (2012).
  41. Carlson, M. org.Hs.eg.db: Genome wide annotation for human. 2022. R package version 3.15.0. , Available from: https://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html (2022).
  42. Barrett, T., et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Research. 41, 991-995 (2012).
  43. Gao, Y., Zhang, J., Zhao, F. Circular RNA identification based on multiple seed matching. Briefings in Bioinformatics. 19 (5), 803-810 (2018).
  44. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  45. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  46. Wang, K., et al. MapSplice: Accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), 178(2010).
  47. Song, X., et al. Circular RNA profile in gliomas revealed by identification tool UROBORUS. Nucleic Acids Research. 44 (9), 87(2016).
  48. Hansen, T. B. Improved circRNA identification by combining prediction algorithms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 20(2018).
  49. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  50. Ma, X. K., et al. CIRCexplorer3: A CLEAR pipeline for direct comparison of circular and linear RNA expression. Genomics Proteomics Bioinformatics. 17 (5), 511-521 (2019).
  51. Gaffo, E., Buratin, A., Dal Molin, A., Bortoluzzi, S. Sensitive, reliable and robust circRNA detection from RNA-seq with CirComPara2. Briefings in Bioinformatics. 23 (1), (2022).
  52. Glažar, P., Papavasileiou, P., Rajewsky, N. circBase: a database for circular RNAs. RNA. 20 (11), New York, N.Y. 1666-1670 (2014).
  53. Tan, S., et al. Circular RNA F-circEA-2a derived from EML4-ALK fusion gene promotes cell migration and invasion in non-small cell lung cancer. Molecular Cancer. 17 (1), 138(2018).
  54. Guarnerio, J., et al. Oncogenic role of Fusion-circRNAs Derived from cancer-associated chromosomal translocations. Cell. 165 (2), 289-302 (2016).
  55. McGeary, S. E., et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 366 (6472), (2019).
  56. Enright, A. J., et al. MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biology. 5 (1), 1(2003).
  57. Rehmsmeier, M., Steffen, P., Hochsmann, M., Giegerich, R. Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. RNA. 10 (10), 1507-1517 (2004).
  58. Zhang, D., et al. AllEnricher: a comprehensive gene set function enrichment tool for both model and non-model species. BMC Bioinformatics. 21 (1), 106(2020).
  59. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

KEGG

مقالات ذات صلة