Method Article

عزل الخلايا التائية القائمة على التعويم وتنشيطها وتوسيعها من عينات خلايا الدم أحادية النواة المحيطية البشرية باستخدام الفقاعات الدقيقة

DOI:

10.3791/64573

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  , 
1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذه الدراسة هو إثبات جدوى الفصل القائم على التعويم لعزل وتنشيط وتوسيع الخلايا التائية البشرية الأولية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد عملية عزل الخلايا التائية من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) لإنشاء مزارع خارج الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية للبحث والاختبارات السريرية والعلاجات القائمة على الخلايا. في هذه الدراسة ، يتم تقديم بروتوكول بسيط وجديد لعزل وتنشيط وتوسيع الخلايا التائية من PBMCs خارج الجسم الحي . تستخدم هذه الدراسة تقنية فرز الخلايا المنشطة بالطفو الوظيفي (BACS) لعزل الخلايا التائية وتنشيطها. باختصار ، يتضمن البروتوكول الاختيار الإيجابي لخلايا CD3 + من PBMCs المشتقة من leukopak ، يليها تحفيز مشترك لمدة 48 ساعة مع فقاعات streptavidin الدقيقة (SAMBs) المترافقة مسبقا المضادة ل CD28 قبل النقل في 24 لوحة بئر. توفر الفقاعات الدقيقة الوظيفية فرصة فريدة لتنشيط الخلايا بشكل مزدهر ، مما يؤدي إلى أنماط ظاهرية تكاثرية تسمح بالتوسع بأقل قدر من الإرهاق. توفر هذه التقنية استنفادا أقل لأن الفقاعات الدقيقة المحفزة المشتركة تظل طافية وتعود إلى الجزء العلوي من وسط الاستزراع ، مما يقلل من مقدار الوقت الذي تتلامس فيه الخلايا المتوسعة مع عوامل التحفيز المشترك. تشير النتائج إلى أن الخلايا التائية المعزولة والمستزرعة تتلقى تحفيزا كافيا للتنشيط والتكاثر ولكن ليس إلى الحد الذي يؤدي إلى فرط النشاط ، مما يؤدي بعد ذلك إلى الإرهاق ، كما يتضح من وجود PD-1 المفرط.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم حاليا إجراء أكثر من 500 تجربة سريرية للعلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) في جميع أنحاء العالم ، وتتوفر أربعة منتجات للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR-T) في السوق1. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من احتياجات البحث والتصنيع في الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية والتي يجب معالجتها لتحسين الفعالية وقابلية التوسع والنجاح طويل الأجل لهذه العلاجات العلاجية المحتملة2،3،4،5. يبدأ البحث السريري والتصنيع بالتبني للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية بعزل الخل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عزل الخلايا التائية مع microbubbles باستخدام الاختيار الإيجابي

ملاحظة: يفصل هذا البروتوكول نهج الاختيار الإيجابي CD3 + على نطاق صغير باستخدام SAMBs.

  1. احتضان 3 × 108 PBMCs تم الحصول عليها تجاريا في 2.5 مل من عازلة الفصل مع الجسم المضاد المضاد ل CD3 (OKT3) بتركيز 25 نانوغرام من الجسم المضاد لكل 1 مليون خلية (25 نانوغرام / م). امزج بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  2. أضف فقاعات الستربتافيدين الدقيقة (SAMBs) بنسبة 0.5 (كمية SAMB):1 (كمية الخلية) وفقا لتركيز SAMB المبلغ عنه من قبل الشركة المصنعة.
  3. امزج باستخدام دوار تجاري من طرف إلى ط....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل الخلايا التائية من PBMCs المشتراة ومطلية للتنشيط كما هو موضح في البروتوكول. لم يتم تنشيط عينات التحكم السلبية (PBMCs المشتراة). تم تضمين عينات التحكم هذه لإثبات تأثير عملية تنشيط الفقاعات الدقيقة على العينات التجريبية مقارنة بضوابط الخلايا التائية التي لم تمسها ولم يتم تحفيزها ، مما يضمن أن علامات التنشيط التي لوحظت كانت نتيجة لعوامل التنشيط المضافة ولم تكن متأصلة في الخلايا التائية نفسها. وفقا للمخطط التجريبي في الشكل 2 ، تم زرع الخلايا عند 2 × 106 خلايا / مل في وسط الخلية التائية وكانت إما لم تمسها / .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح البروتوكول الموصوف بعزل الخلايا التائية من عينات PBMC وتنشيط الخلايا التائية العالقة في وسائط المزرعة ذات الفقاعات الدقيقة. تعتمد هذه الطريقة على الفقاعات الدقيقة الوظيفية التي يوفر طفوها المتأصل فرصة فريدة لإدخال إشارات التحفيز المشترك إلى الخلايا وتنشيطها أثناء تعليقها في وسط استزراع ، وبالتالي تقليل تعرض الخلايا المتوسعة للتحفيز لفترات طويلة ؛ يمكن أن يؤدي هذا التحفيز المفرط إلى زيادة التعبير عن علامات استنفاد الخلايا التائية وتقليل الفعالية العلاجية11. تنتج الخلايا التائية المحفزة المرتبط.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع المؤلفين ، في وقت التقديم ، هم موظفون في Akadeum Life Sciences ، التي تصنع وتبيع منتجات فصل الفقاعات الدقيقة.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolGibco21985-023CAS: 60-24-2
لوحات Biologix متعددة الآبار للثقافة 24 بئر لوحاتVWR & nbsp ؛76081-560
البيوتين المضاد للإنسان CD28 (28.2) الأجسام المضادةBiolegend302904
البيوتين المضاد للإنسان CD3 (OKT3) الأجسام المضادةBiolegend317320
DPBS ، بدون كالسيوم ، خال من المغنيسيومGibco14190-136
مكمل GlutaMAXThermofisher35050061
المؤتلف البشري IL2   ؛BioVision (vwr)10006-122
جسيمات العدسات الفيروسية rLV.EF1.zsGreen1-9تاكارا بيو0038VCT
LeukopakBioIVTHUMANLMX100-0001129
PBMCs البشرية العاديةBioIVTHUMANHLPB-0002562
البنسلين / الستربتومايسين 100X لزراعة الأنسجةVWR97063-708CAS: 8025-06-7
بوليبرين كاشف العدوى / التعديMillipore SigmaTR-1003-GCAS: 28728-55-4
مصل AB البشري المشتق من الحرارةبحث مبتكرISERABHI100 مل
RPMI 1640 متوسط ، مكمل GlutaMAX ، مجموعة HEPESGibco72400047
Streptavidin Microbubble Kit (بما في ذلك عازلة فصل Akadeum)Akadeum11110-000
المشتق من الحرارة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

T Cell IsolationMicrobubble ActivationPeripheral Blood MononuclearT Cell ExpansionBuoyancy Activated Cell SortingCD3 Positive SelectionAnti CD28 MicrobubblesFlow CytometryT Cell ExhaustionActivation Marker CD69

Related Articles