Method Article

انتشار الفيروس والقياس اللوني القائم على الخلايا

DOI:

10.3791/64578

⸱

April 7th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول انتشار فيروس زيكا (ZIKV) في خلايا الكلى القردة الخضراء فيرو الأفريقية والقياس الكمي لفيروس زيكا باستخدام طرق الكشف المناعي اللوني القائمة على الخلايا في شكل 24 بئرا و 96 بئرا (إنتاجية عالية).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس زيكا (ZIKV) هو فيروس ينقله البعوض ينتمي إلى جنس Flavivirus. ارتبطت عدوى فيروس زيكا بتشوهات خلقية في الدماغ وربما متلازمة غيلان باريه لدى البالغين. ومن المهم إجراء البحوث المتعلقة بفيروس زيكا لفهم آليات المرض لتيسير تطوير اللقاح والعلاج. طريقة قياس كمية الفيروسات حاسمة وأساسية في مجال علم الفيروسات. مقايسة تشكيل التركيز (FFA) هي مقايسة كمية للفيروس تكتشف المستضد الفيروسي بالأجسام المضادة وتحدد بؤر العدوى للخلايا باستخدام تقنية التلوين المناعي للبيروكسيداز. تصف الدراسة الحالية بروتوكول انتشار الفيروس والقياس الكمي باستخدام كل من تنسيقات 24 بئرا و 96 بئرا (إنتاجية عالية). بالمقارنة مع دراسات أخرى مماثلة ، وصف هذا البروتوكول كذلك تحسين حجم البؤر ، والذي يمكن أن يكون بمثابة دليل لتوسيع استخدام هذا الفحص للفيروسات الأخرى. أولا ، يتم إجراء انتشار ZIKV في خلايا Vero لمدة 3 أيام. يتم حصاد طافية الاستزراع التي تحتوي على ZIKV وقياسها باستخدام FFA. باختصار ، يتم تلقيح ثقافة الفيروس على خلايا Vero وتحضينها لمدة 2-3 أيام. ثم يتم تحديد تكوين البؤر بعد عمليات تلطيخ محسنة ، بما في ذلك تثبيت الخلايا ، والنفاذية ، والحجب ، وربط الأجسام المضادة ، والحضانة مع ركيزة البيروكسيديز. يتم تصور بؤر الفيروس الملطخة باستخدام مجهر ستيريو (العد اليدوي بتنسيق 24 بئرا) أو محلل البرامج (العد الآلي بتنسيق 96 بئرا). يوفر FFA نتائج قابلة للتكرار وسريعة نسبيا (3-4 أيام) وهو مناسب للاستخدام مع فيروسات مختلفة ، بما في ذلك الفيروسات غير المكونة للبلاك. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول مفيد لدراسة عدوى ZIKV ويمكن استخدامه للكشف عن الفيروسات الأخرى المهمة سريريا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عدوى فيروس زيكا (ZIKV) هي مرض فيروسي ناشئ ينقله البعوض. كانت أول عزلة ل ZIKV في أوغندا في عام 1947 1,2 ؛ ظل مهملا من عام 1947 إلى عام 2007 ، حيث أن الأعراض السريرية هي الأكثر شيوعا بدون أعراض وتتميز بمرض حموي ذاتي الحد. في عام 2007 ، بدأ وباء زيكا في جزر ياب 3,4 ، تلاه أوبئة أكبر في مناطق المحيط الهادئ (بولينيزيا الفرنسية وجزيرة إيستر وجزر كوك وكاليدونيا الجديدة) من 2013 إلى 2014 5،6،7،8 ، حيث تم الإبلاغ عن المضاعفات العصبية الشديدة متلازمة غيلان باريه (GBS) في البالغين لأول مرة9. خلال عامي 2015 و 2016 ، اجتاح أول وباء ZIKV واسع الانتشار الأمريكتين بعد ظهور النمط الجيني الآسيوي ل ZIKV في البرازيل في وقت مبكر من عام 201310. خلال هذه الفاشية ، تم الإبلاغ عن 440,000 إلى 1.3 مليون حالة من صغر الرأس ، واضطرابات عصبية أخرى ، في الأطفال حديثي الولادة11. لا يوجد حاليا علاج أو علاج محدد لعدوى فيروس زيكا. وبالتالي، هناك حاجة طبية ملحة للقاحات فيروس زيكا القادرة على الوقاية من العدوى، لا سيما أثناء الحمل.

القياس الكمي للفيروس هو عملية لتحديد عدد الفيروسات الموجودة في العينة. يلعب دورا مهما في البحث ، وتشمل المختبرات الأكاديمية العديد من المجالات ، مثل الطب وعلوم الحياة. هذه العملية مهمة أيضا في القطاعات التجارية ، مثل إنتاج اللقاحات الفيروسية أو البروتينات المؤتلفة أو المستضدات الفيروسية أو العوامل المضادة للفيروسات. يمكن استخدام العديد من الطرق أو المقايسات لقياس كمية الفيروس12. يعتمد اختيار الطرق أو المقايسات عادة على خصائص الفيروس ومستوى الدقة المطلوب وطبيعة التجربة أو البحث. بشكل عام ، يمكن تقسيم طرق قياس الفيروسات إلى فئتين: المقايسات الجزيئية التي تكشف عن وجود الحمض النووي الفيروسي (DNA أو RNA) والمقايسات التي تقيس عدوى الفيروس في المختبر12. يعد تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR ، للحمض النووي) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR ، للحمض النووي الريبي)13 والقطيرات الرقمية PCR14 أمثلة على التقنيات الجزيئية الشائعة المستخدمة لتحديد كمية الحمض النووي الفيروسي في عينة معينة15. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه التقنيات الجزيئية شديدة الحساسية التمييز بين الفيروسات القابلة للحياة وغير القابلة للحياة15. لذلك ، لا يمكن إكمال البحث الذي يتطلب معلومات عن السمات البيولوجية ، مثل عدوى الفيروس على الخلايا ، باستخدام التقنيات الجزيئية المذكورة أعلاه ؛ هناك حاجة إلى فحوصات يمكنها قياس وتحديد وجود فيروسات قابلة للحياة. تشمل المقايسات التي تقيس عدوى الفيروس مقايسة تكوين البلاك (PFA) ، والجرعة المعدية لزراعة الأنسجة بنسبة 50٪ (TCID50) ، ومقايسة تركيز الفلورسنت ، والمجهر الإلكتروني الانتقالي (TEM) 12.

يعد PFA ، الذي طوره Renato Dulbecco في عام 1952 ، أحد أكثر الطرق شيوعا لمعايرة الفيروس ، بما في ذلك ZIKV16. يتم استخدامه لتحديد التركيزات الفيروسية مباشرة للفيروسات المعزولة المعدية. تعتمد الطريقة على قدرة الفيروس المحلل على إنتاج تأثيرات اعتلال خلوي (CPEs ؛ مناطق موت الخلايا أو اللويحات ، وهي منطقة عدوى محاطة بخلايا غير مصابة) في طبقة أحادية الخلية الملقحة بعد العدوى الفيروسية. ومع ذلك ، هناك العديد من العيوب للفحص التي تؤثر على فائدتها. تستغرق عملية الفحص وقتا طويلا (تستغرق حوالي 7-10 أيام ، اعتمادا على الفيروسات) ، وتعتمد على CPE ، وعرضة للأخطاء. في هذه الدراسة ، أبلغنا عن تقنية قياس الألوان المناعية ، مقايسة تشكيل التركيز (FFA) ، للكشف عن ZIKV وقياسه في تنسيقات صفيحة 24 بئرا و 96 بئرا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. انتشار الفيروس

  1. إعداد الخلية
    1. تنمو خلايا Vero في دورق زراعة خلايا 75 سم2 يحتوي على 12 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 2 مللي متر L-glutamine (انظر جدول المواد). احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    2. مراقبة الخلايا تحت المجهر. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -90٪ ، تصبح جاهزة للاستخدام (الشكل 1 أ).
      ملاحظة: تتضاعف خلايا Vero كل 24 ساعة17 تقريبا. يجب أن تستغرق التخفيفات من 1:10 من 3 إلى 4 أيام للوصول إلى التقاء 80٪ -90٪ في قارورة 75 سم2 . مراقبة الخلايا يوميا أو كل يوم.
  2. إصابة الخلية أحادية الطبقة
    1. قم بإزالة وسط النمو من دورق زراعة الخلايا باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. اشطف القارورة ب 3 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (dPBS) 2x باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل.
      ملاحظة: يجب تحضير دورق يحتوي على 10٪ هيبوكلوريت الصوديوم لتطهير أي نفايات سائلة معدية مهملة من القوارير / الألواح.
    2. أضف 2 مل من DMEM الخالي من المصل (DMEM مكمل ب 2 mM L-glutamine بدون FBS) و 20 ميكرولتر من لقاح ZIKV في دورق زراعة الخلايا. احتضان القارورة مع هزاز لطيف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح بامتصاص الفيروس.
      ملاحظة: ستكون معايرة مخزون ZIKV الأولي مفيدة لتحديد حجم إضافة لقاح ZIKV (الخطوة 2).
      تنبيه: يصنف فيروس زيكا على أنه أحد مسببات الأمراض من المستوى 2 للسلامة الأحيائية (BSL-2). ويجب أن تجرى جميع الإجراءات المتعلقة بالمواد المحتوية على فيروس زيكا في خزانة معتمدة للسلامة الأحيائية وأن تتبع جميع إجراءات التشغيل المعيارية المختبرية بمعدات الحماية الشخصية المناسبة.
  3. إضافة وسيط التراكب
    1. بعد الحضانة لمدة 1 ساعة ، قم بإزالة لقاح الفيروس المخفف والتخلص منه باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل. شطف قارورة ثقافة الخلية مع 3 مل من dPBS 2x.
    2. أضف 12 مل من وسائط الصيانة (DMEM مكمل ب 2٪ FBS و 2 mM L-glutamine و 100 U / mL من البنسلين والستربتومايسين) في دورق زراعة الخلايا للحفاظ على الخلايا المصابة.
    3. احتضان خلايا فيرو المصابة لمدة 3 أيام في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: راقب يوميا CPE لخلايا Vero المصابة تحت المجهر.
  4. حصاد طاف زراعة الخلايا المحتوي على ZIKV
    1. في اليوم 3 بعد الإصابة ، يمكن ملاحظة تقريب الخلايا وانفصالها (CPE) (الشكل 1B-D). حصاد طاف زراعة الخلايا الذي يحتوي على ZIKV في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل.
    2. استخدم مرشح حقنة بولي إيثر سلفون 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) لتصفية طاف زراعة الخلايا. القسمة 500 ميكرولتر من طاف زراعة الخلايا المفلترة في أنابيب غطاء لولبي 2.0 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
      ملاحظة: يمكن تخزين ZIKV المحصود في -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
      تنبيه: يجب اتخاذ احتياطات إضافية إذا تم استخدام إبرة حقنة ، لأن الإبرة يمكن أن تثقب الجلد. ويلزم وضع إجراءات تشغيلية موحدة للمختبرات.

2. القياس الكمي للفيروس

  1. إعداد الخلية
    1. خلايا فيرو البذور في لوحات مخصصة (صفيحة 24 بئر: 0.5 مل / بئر ، 7.5 × 104 خلايا / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 0.1 مل / بئر ، 1.5 × 104 خلايا / بئر) واحتضان اللوحة طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: هناك خمس نقاط زمنية مختلفة يجب اختبارها (صفيحة 24 بئرا: 48 ساعة ، 60 ساعة ، 72 ساعة ، 84 ساعة ، و 96 ساعة بعد الإصابة ؛ لوحة 96 بئرا: 24 ساعة ، 36 ساعة ، 48 ساعة ، 60 ساعة ، و 72 ساعة بعد الإصابة) ؛ لذلك ، قم بإعداد لوحة واحدة لكل نقطة زمنية.
    2. بعد حضانة 24 ساعة وبمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -90٪ (الشكل 1E) ، تكون اللوحة جاهزة للعدوى. تابع تحضير مخزون الفيروس المخفف (الخطوة 2.2) قبل إصابة الخلية أحادية الطبقة.
  2. تخفيف الفيروس
    1. بالنسبة لألواح 24 و 96 بئرا ، قم بإعداد ستة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 1.5 مل لكل لوحة لإجراء تخفيف عشرة أضعاف (10-1 حتى 10-5) ، بما في ذلك التحكم السلبي. لإعداد التجربة للوحة 24 بئرا ، أضف 450 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل إلى جميع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الستة. لإعداد التجربة للوحة 96 بئرا ، أضف 135 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل إلى ستة أنابيب.
      ملاحظة: قم بتسمية كل أنبوب بوضوح للإشارة إلى تخفيف محتوياته قبل إجراء التخفيف التسلسلي بعشرة أضعاف.
    2. لإجراء التخفيف التسلسلي ، لإعداد تجربة لوحة 24 بئرا ، أضف 50 ميكرولتر من مخزون ZIKV الذي تم حصاده من الخطوة 1 إلى الأنبوب 10-1 الذي يحتوي على 450 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل. لإعداد تجربة لوحة 96 بئرا ، أضف 15 ميكرولتر من مخزون ZIKV إلى الأنبوب 10-1 الذي يحتوي على 135 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل.
    3. دوامة كل أنبوب لخلط الفيروس والمتوسطة. هذا هو التخفيف الأول عشرة أضعاف.
      ملاحظة: يلزم الخلط الصحيح للفيروس ووسط الثقافة في كل أنبوب تخفيف لضمان التخفيف التسلسلي الدقيق.
    4. لإعداد تجربة لوحة 24 بئرا ، استخدم طرف ماصة جديد لإعادة تعليق الأنبوب 10-1 ونقل 50 ميكرولتر من ZIKV المخفف إلى أنبوب 10-2 كتخفيف ثان عشرة أضعاف. لإعداد تجربة لوحة 96 بئرا ، استخدم طرف ماصة جديد لإعادة تعليق الأنبوب 10-1 ونقل 15 ميكرولتر من ZIKV المخفف إلى الأنبوب 10-2 كتخفيف ثان عشرة أضعاف.
    5. كرر الخطوة 2.2.4 أربع مرات حتى الأنبوب الخامس (باستثناء التحكم السلبي).
      ملاحظة: استخدم طرف ماصة جديدا بعد كل خطوة سحب لتجنب التلوث المتبادل.
  3. إصابة الخلية أحادية الطبقة
    1. قم بإزالة الوسط المكيف والتخلص منه من كل بئر (لوحة 24 بئر: 0.5 مل / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 0.1 مل / بئر).
    2. اشطف كل بئر باستخدام dPBS 2x (لوحة 24 بئرا: 300 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 60 ميكرولتر / بئر).
    3. من خلال العمل من أعلى إلى أدنى تخفيف ، أضف كل لقاح فيروس مخفف بشكل متسلسل إلى البئر (لوحة 24 بئرا: 200 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 40 ميكرولتر / بئر).
      ملاحظة: سيتم إجراء إصابة كل تخفيف في الآبار المكررة. الحفاظ على بئرين غير مصابين كعنصر تحكم سلبي. قم بتسمية اللوحة والآبار بوضوح لتجنب الالتباس. قم بتغيير أطراف الماصة بعد كل خطوة سحب لمنع التلوث المتبادل.
    4. احتضن اللوحة بتأرجح لطيف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح بامتصاص الفيروس.
  4. إضافة وسط زراعة الخلايا المتراكبة
    1. بعد 1 ساعة من الحضانة ، قم بإزالة معلق الفيروس وتجاهله من أدنى تركيز إلى أعلى.
    2. اغسل الخلايا المصابة باستخدام dPBS 2x (لوحة 24 بئرا: 300 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 60 ميكرولتر / بئر).
    3. قم بتراكب البئر مع DMEM (مكمل ب 2٪ FBS ، 2 mM L-glutamine ، و 100 U / mL من البنسلين - الستربتومايسين) و 1.5٪ كربوكسي ميثيل السليلوز منخفض اللزوجة (CMC ؛ انظر جدول المواد) (لوحة 24 بئرا: 1 مل / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 0.2 مل / بئر).
    4. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: لا تزعج اللوحة خلال فترة الحضانة هذه.
    5. أخرج الصفيحة من حاضنة زراعة الخلايا للتلطيخ في نقاط زمنية مختلفة (صفيحة 24 بئرا: 48 ساعة ، 60 ساعة ، 72 ساعة ، 84 ساعة ، و 96 ساعة بعد الإصابة ؛ لوحة 96 بئرا: 24 ساعة ، 36 ساعة ، 48 ساعة ، 60 ساعة ، و 72 ساعة بعد الإصابة).

3. تلطيخ

  1. تثبيت الخلية
    1. بعد ساعات الحضانة المحددة (صفيحة 24 بئرا: 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة و 84 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة ؛ لوحة 96 بئرا: 24 ساعة ، 36 ساعة ، 48 ساعة ، 60 ساعة ، و 72 ساعة بعد الإصابة) ، قم بإزالة وتجاهل وسط التراكب وغسل الخلايا 3x مع 1x PBS. بالنسبة للوحة 96 بئرا ، قم بإزالة وتجاهل وسيط التراكب واغسل الخلايا 3x ب 60 ميكرولتر / بئر من 1x PBS باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    2. أضف 4٪ بارافورمالدهايد لإصلاح الخلايا (لوحة 24 بئرا: 300 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 60 ميكرولتر / بئر). احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      تنبيه: بارافورمالدهيد هو فورمالديهايد صلب مبلمر. إنه مسحوق بلوري أبيض صلب قابل للاشتعال يطلق غاز الفورمالديهايد عند مزجه بالماء أو تسخينه. يجب إجراء جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام بارافورمالدهايد في غطاء دخان كيميائي معتمد أو حاويات مستنفدة معتمدة وفقا لإجراءات التشغيل الموحدة المختبرية الخاصة بالمواد الكيميائية المحتوية على الفورمالديهايد.
    3. بعد 20 دقيقة ، تخلص من بارافورمالدهيد واغسل الخلايا 3x باستخدام 1x PBS. قم بإجراء عمليات النفاذية والحجب وحضانة الأجسام المضادة باتباع الخطوات 3.2-3.5.
      ملاحظة: عند التخلص من 4٪ بارافورمالدهيد ، اتبع إجراءات التخلص من النفايات في الجامعة أو المعهد.
  2. نفاذية الخلية
    1. أضف 1٪ أوكتيل فينوكسي بولي (إيثيلينوكسي) إيثانول (انظر جدول المواد) لنفاذية الخلايا (لوحة 24 بئرا: 200 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 40 ميكرولتر / بئر). احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. بعد 15 دقيقة ، تخلص من أوكتيل فينوكسي بولي (إيثيلينوكسي) إيثانول واغسل الخلايا 3x باستخدام 1x PBS.
  3. حظر
    1. أضف 3٪ حليب خالي الدسم لتقليل الارتباط غير النوعي في العينة (لوحة 24 بئرا: 500 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 100 ميكرولتر / بئر). احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    2. بعد 2 ساعة ، تخلص من الحليب الخالي من الدسم 3٪ واغسل الخلايا 3x باستخدام 1x PBS.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف. بعد إضافة 3٪ حليب خالي الدسم ، يمكن تخزين الألواح في 4 درجات مئوية حتى 2 أيام قبل إدخال الأجسام المضادة الأولية.
  4. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. أضف جسما مضادا أحادي النسيلة مضادا للفيروس المصفر ، 4G2 (استنساخ D1-4G2-4-15 ؛ الجسم المضاد الأساسي ، انظر جدول المواد) المخفف في حليب خالي الدسم بنسبة 1٪ (نسبة 1: 1000) (صفيحة 24 بئرا: 200 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئرا: 40 ميكرولتر / بئر). احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. بعد 1 ساعة ، قم بإزالة المحلول الذي يحتوي على الجسم المضاد وحيد النسيلة وغسل الخلايا 3x مع 1x PBS.
  5. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
    1. أضف الجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للفأر للماعز المترافق مع بيروكسيديز الفجل (HRP) (انظر جدول المواد) المخفف في حليب خالي الدسم بنسبة 1٪ (نسبة 1: 1000) (لوحة 24 بئر: 200 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 40 ميكرولتر / بئر). احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. بعد 1 ساعة ، قم بإزالة المحلول الذي يحتوي على الجسم المضاد الثانوي واغسل الخلايا 3x باستخدام 1x PBS.
  6. حضانة الركيزة
    1. أضف 3،3'diaminobenzidine (DAB) ركيزة بيروكسيديز (انظر جدول المواد) واحتضن اللوحة لمدة 30 دقيقة في الظلام (لوحة 24 بئرا: 200 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 40 ميكرولتر / بئر). بعد 30 دقيقة ، أوقف التفاعل عن طريق غسل الآبار بالماء.
    2. جفف الألواح في الهواء طوال الليل وانتقل إلى تعداد البؤر بعد أن تجف الألواح تماما.

4. تحديد عيار الفيروس

  1. عملية عد البؤر اليدوية (تنسيق 24 بئرا)
    1. يمكن تصور البؤر تحت مجهر ستيريو. حدد التخفيف الذي ينتج 50-200 بؤرة.
    2. عد البؤر لكل نسخة مكررة من التخفيف المحدد. احسب متوسط عدد البؤر لكل من التخفيفات المحددة.
    3. احسب وحدة تشكيل البؤر لكل مل (FFU / mL) لكل عينة بالصيغة أدناه: FFU / mL = متوسط عدد البؤر التي تم حسابها / (تمت إضافة التخفيف × حجم الفيروس المخفف).
  2. عملية عد البؤر الآلية (تنسيق 96 بئرا)
    1. امسح لوحة 96 بئرا ضوئيا على محلل برامج تجارية.
      1. انقر نقرا مزدوجا فوق البرنامج (انظر جدول المواد) لفتحه.
      2. انقر فوق تبديل الأجنحة وتأكد من تبديل الجناح إلى أي جناح قابل للتطبيق (الشكل التكميلي 1 أ). انقر فوق موافق.
      3. ابدأ الفحص بالنقر فوق مسح ضوئي > مسح كامل للوحة (الشكل التكميلي 1B).
      4. انقر فوق لوحة القيادة للتأكد من أن تنسيق الالتقاط هو تنسيق 96 بئرا (الشكل التكميلي 2 أ).
      5. حدد وضع التوسيط ك "تم التحقق من مستخدم المحاذاة المسبقة التلقائية" (الشكل التكميلي 2 ب).
      6. انقر فوق إخراج لتحميل اللوحة.
        ملاحظة: افتح غطاء اللوحة وضعه لأعلى مع وجود الصف A في الأعلى (الشكل التكميلي 3A).
      7. أدخل اسم اللوحة وانقر على موافق. انقر فوق تحميل لتحميل اللوحة.
      8. انقر فوق ابدأ لبدء الفحص. بعد ذلك ، قم بمعايرة مواضع A1 و A12 و H1 باستخدام الأزرار "أعلى ، أسفل ، يسار ، يمين" وانقر فوق تأكيد (الشكل التكميلي 3 ب).
        ملاحظة: سيبدأ البرنامج في مسح كل بئر.
      9. بمجرد اكتمال المسح ، ستظهر صورة نظرة عامة. انقر فوق إغلاق.
      10. اخرج من الفحص بالنقر فوق رجوع إلى لوحة التبديل.
    2. عد لوحة 96 بئرا باستخدام البرنامج.
      1. انقر على العد > العد الذكي.
      2. في البرنامج ، سيظهر "الخطوة 1 من 5: حدد اللوحات المراد حسابها". انقر فوق لوحة (لوحة) التحميل. ضع علامة في المجلد بأكمله وانقر فوق تحديد لاستيراد اللوحة الممسوحة ضوئيا (الشكل التكميلي 4 أ).
      3. في البرنامج ، سيظهر "الخطوة 2 من 5: تحديد معلمات العد". انقر فوق ضبط المعلمات ، وسيتم عرض المعلمات (عملية منتشرة ؛ صغير / عادي / كبير / أكبر / أكبر +1 ؛ فصل موضعي ؛ منطقة محسوبة ؛ توازن الخلفية ؛ إزالة الألياف ؛ بوابة).
        ملاحظة: ابدأ ببئر واحدة ، وتحقق ذهابا وإيابا للعثور على أفضل الإعدادات لجميع الآبار.
      4. بمجرد الانتهاء ، انقر فوق التالي (الشكل التكميلي 4 ب).
      5. في البرنامج ، سيظهر "الخطوة 3 من 5: تحديد / إلغاء تحديد الآبار". بمجرد اكتمال اختيار البئر المراد عدها ، انقر فوق التالي المضي قدما.
        ملاحظة: ستظهر الآبار المختارة المراد عدها بحرف "C" في الزاوية اليمنى العليا من كل بئر (الشكل التكميلي 5A).
      6. في البرنامج ، سيظهر "الخطوة 4 من 5: إعدادات الإخراج". انقر فوق عرض / تعديل إعدادات الإخراج للتحقق مما إذا كانت الإعدادات (مثل تنسيق الصورة) مناسبة. انقر فوق حفظ والخروج من > التالي (الشكل التكميلي 5B).
      7. في البرنامج ، سيظهر "الخطوة 5 من 5: بدء العد التلقائي". انقر فوق بدء العد التلقائي (الشكل التكميلي 6 أ).
      8. بمجرد الانتهاء ، انقر فوق الخروج من العد التلقائي.
  3. إجراء مراقبة الجودة (QC) في محلل البرامج التجارية.
    1. في صفحة لوحة التبديل ، انقر فوق مراقبة الجودة > إضافة لوحة (لوحة). حدد المجلد بأكمله لاستيراد اللوحة المحسوبة ، انقر فوق تحديد > بدء مراقبة الجودة (الشكل التكميلي 6 ب).
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق كل بئر لتدقيق المواقع. انقر فوق عد لإزالة أي نقاط. سيبدأ البرنامج في العد.
      ملاحظة: تأكد من تحديد "البقع: إزالة". يمكن الإشارة إلى إكمال العد من خلال عدد البؤر المحسوبة ، على سبيل المثال "30" (الشكل التكميلي 7 أ).
    3. بمجرد انتهاء العد (المشار إليه بعدد البؤر المحسوبة ، على سبيل المثال "30") ، انقر فوق "نعم" لإزالة البقع (الشكل التكميلي 7B). انقر بزر الماوس الأيسر ثلاث مرات على الفور المراد إزالته. انقر بزر الماوس الأيمن للإنهاء ، ثم انقر فوق نعم.
    4. انقر فوق لوحة الإنهاء وانتقل إلى نظرة عامة على المشروع بمجرد اكتمال مراقبة الجودة.
  4. قم بإجراء التصوير باستخدام محلل البرامج.
    1. تحقق من صورة اللوحة الممسوحة ضوئيا والمحسوبة ومراقبة الجودة (الشكل 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن قياس ZIKV كميا باستخدام FFA ، كما هو موضح بشكل تخطيطي في الشكل 3. بالنسبة للوحة 24 بئرا ، تم تثبيت خلايا Vero المصابة عند 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة و 84 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة. أظهرت النتائج أن الخلايا بقيت سليمة (لم يلاحظ أي انفصال خلوي) بعد 96 ساعة (4 أيام) بعد الإصابة (الشكل 4 والشكل التكميلي 8A-E). لوحظ ظهور بؤر الفيروس لأول مرة في 48 ساعة (2 أيام) بعد الإصابة (الشكل 4A-F). ومع ذلك ، ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من المقايسات لتحديد عيار الفيروس. لدى PFA بروتوكول كمي مشابه للفيروس مثل FFA ، حيث يتم تخفيف لقاح الفيروس للسماح بتمييز اللويحات أو البؤر الفردية. بعد تلطيخ ، تشير كل لوحة أو بؤر إلى جسيم معدي واحد في اللقاح19. PFA ملطخ باللون البنفسجي البلوري لتصور تكوين البلاك الناجم عن تحلل الخلايا أو الموت. وبالتالي ، فإن PFA يستغرق وقتا أطول ، لأنه يتطلب وقتا أطول للفيروس ليسبب CPEs ، ويقتصر فقط على الفيروسات التي تحفز تحلل الخلايا أو الموت. استخدمت العديد من المختبرات بنجاح FFAs لتحديد عيار الفير...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلقى هذا البحث دعما من وزارة التعليم العالي الماليزية في إطار برنامج المنح البحثية طويلة الأجل (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN / F1 / 01/2018) وتمويل برنامج مركز التميز للمؤسسات العليا (HICoE) (MO002-2019). الشكل 3 في هذه الدراسة الذي يوضح سير عمل التلوين لمقايسة تشكيل البؤر مقتبس من "DAB Immunohistochemistry" بواسطة BioRender.com (2022). تم الاسترجاع من https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 وميكرو ؛ م مرشح حقنة بولي إيثر سلفونسارتوريوسS6534-FMOSK
1.5 مل أنبوب الطرد المركزيالدقيق عش615601
10 مل ماصة مصلية معقمةLabserv14955156
1x Dulbecco ' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (dPBS)Gibco14190-136
2.0 مل أنبوب غطاء لولبي   ؛AxygenSCT-200-SS-C-S
24 بئر لوحةCorning3526
25 مل ماصات مصلية معقمةLabserv14955157
3,3'ديامينوبنزيدين (DAB) بيروكسيداز الركيزةالحرارية العلمية34065
37 درجة ؛ حاضنة C مع 5٪ CO2< / sub>SanyoMCO-18AIC
5 مل ماصة مصلية معقمةLabserv14955155
50 مل أنبوب الطرد المركزيFalconLAB352070
75 سم 2< / sup> قارورة زراعة الأنسجة   ؛Corning430725U
96 بئر صفيحةفالكون353072
جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفيروسات ، 4G2 (استنساخ D1-4G2-4-15)MilliporeSigmaMAB10216
20x محلول ملحي مخزن من الفوسفات المعقم (PBS)N / AN / A22.8 جم من 8 ملي مولار Na 2< / sub>HPO4< / sub> ، 4.0 جم من 1.5 ملي مولار KH2< / sub>PO4< / sub> ، 160 جم من 0.14 M كلوريد الصوديوم ، 4.0 جم من 2.7 ملي مولار KCl ، 1 لتر من خزانة السلامة البيولوجية MilliQ H2< / sub>O
، الفئة الثانيةHoltenHB2448
CTL S6 Universal ELISpot / FluoroSpot AnalyzerImmunoSpot ، Cellular Technology Limited (CTL)CTL-S6UNV12محلل البرامج التجارية
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-017
Fetal Bee مصل (FBS)BovogenSFBS
الماعز المضاد للفأر IgG الجسم المضاد الثانوي مقترن مع بيروكسيداز الفجل (HRP)MilliporeSigma12-349
مقياس الدمLaboroptik المحدودةNeubauer تحسين
IGEPAL CA-630 المنظفاتسيجما ألدريتشI8896أوكتيلفينوكسي بولي (إيثيلين أوكسي) إيثانول إيجبال & nbsp ؛
مجهر مقلوبZEISSTELAVAL 31
مختبر الروكFINEPCRCR300
L-GlutamineGibco25030-081
كربوكسي ميثيل السليلوز منخفض اللزوجة (CMC)Sigma-AldrichC5678
ماصة دقيقة متعددة القنوات (10-100 & micro; L)Eppendorf3125000036
ماصة دقيقة متعددة القنوات (30 - 300 & micro; L)Eppendorf3125000052
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
ماصات أحادية القناة (10-100 & micro; L)Eppendorf3123000047
ماصات أحادية القناة (100 - 1000 وميكرو؛ L)Eppendorf3123000063
ماصات أحادية القناة (20 - 200 & micro; L)Eppendorf3123000055
حليب خالي الدسمSunlac قليل الدسمN / Aتحضير 3٪ حليب خالي الدسم في 1x PBS لمنع مرحلة تلطيخ
هيبوكلوريت الصوديومCloroxN / Aلتطهير أي نفايات سائلة معدية مهملة من القوارير / الألواح
مجهر مجسمنيكونSMZ1000
حقنة يمكن التخلص منها ، قفل لور ، 10 مل مع 21 جم إبرةتيروموSS10L21G
Vero خلايا الكلى الأخضر الأفريقي -88020401 ECACCتم استلامه من متعاون. ومع ذلك ، يجب أن تكون خلايا Vero التي تم الحصول عليها من موردين آخرين قادرة على استخدامها مع بعض التحسين.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
  3. Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
  4. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
  5. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  6. Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
  7. Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929(2014).
  8. Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720(2014).
  10. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  11. Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015).
  12. Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
  13. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  14. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  15. Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
  18. Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
  19. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
  20. Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183(2022).
  21. Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314(2021).
  22. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  23. Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  24. Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  25. Kang, W., Shin, E. -C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960(2012).
  26. Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632(2019).
  27. Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
  28. Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880(2018).
  29. Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
  30. Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544(2021).
  31. Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika VirusVirus QuantificationFocus Forming AssayVero CellsColorimetric QuantificationPeroxidase ImmunostainingSerial DilutionCell FixationAntibody DetectionHigh Throughput Assay

Related Articles