Method Article

تقييم العملية وحركية تعبير ديستيلاز الكيتين المؤتلف في بكتريا قولونية رشيد خلايا PlysS باستخدام تقنية إحصائية

DOI:

10.3791/64590

⸱

March 10th, 2023

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في البروتوكول الحالي ، تم تطبيق تقنية إحصائية ، التصميم المركب المركزي (CCD) ، لتحسين ظروف العملية للتعبير عن ديأسيتيل الكيتين البكتيري المؤتلف (BaCDA) في بكتريا قولونية رشيد خلايا PLysS. أدى توظيف CCD إلى زيادة ~ 2.39 ضعفا في التعبير عن ونشاط BaCDA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة ، اكتسب الطريق الأكثر خضرة لإزالة الأسيتيل من الكيتين إلى الشيتوزان باستخدام إنزيم الكيتين ديسيتيلاز أهمية. يحتوي الشيتوزان المحول إنزيميا مع خصائص المحاكاة على مجموعة واسعة من التطبيقات ، لا سيما في مجال الطب الحيوي. تم الإبلاغ عن العديد من ديستيلاز الكيتين المؤتلف من مصادر بيئية مختلفة ، ولكن لا توجد دراسات حول تحسين العملية لإنتاج هذه الديستيلاز المؤتلف في الكيتين. استخدمت الدراسة الحالية التصميم المركب المركزي لمنهجية سطح الاستجابة لتعظيم إنتاج ديأسيتلاز الكيتين البكتيري المؤتلف (BaCDA) في بكتريا قولونية رشيد pLysS. كانت ظروف العملية المثلى هي تركيز الجلوكوز بنسبة 0.061٪ ، وتركيز اللاكتوز 1٪ ، ودرجة حرارة الحضانة 22 درجة مئوية ، وسرعة التقليب عند 128 دورة في الدقيقة ، و 30 ساعة من التخمير. في الظروف المثلى ، بدأ التعبير الناتج عن تحريض اللاكتوز بعد 16 ساعة من التخمير. تم تسجيل الحد الأقصى للتعبير والكتلة الحيوية ونشاط BaCDA بعد 14 ساعة من الاستقراء. في الحالة المثلى ، تمت زيادة نشاط BaCDA للتعبير عن BaCDA ~ 2.39 ضعفا. أدى تحسين العملية إلى تقليل دورة التخمير الإجمالية بمقدار 22 ساعة ووقت التعبير بمقدار 10 ساعات بعد الحث. هذه هي الدراسة الأولى التي تبلغ عن تحسين عملية تعبير ديستيلاز الكيتين المؤتلف باستخدام تصميم مركب مركزي والتنميط الحركي. يمكن أن يؤدي تكييف ظروف النمو المثلى هذه إلى إنتاج فعال من حيث التكلفة وعلى نطاق واسع لديستيلاز مونيران الأقل استكشافا ، والشروع في طريق أكثر اخضرارا لإنتاج الشيتوزان من الدرجة الطبية الحيوية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكيتين ، وهو β هيكلي ، 1-4 بوليمر طبيعي مرتبط بالجليكوسيد ، هو ثاني أكثر عديد السكاريد وفرة في الطبيعة بعد السليلوز. على الرغم من هذه الحقيقة ، فإن الكيتين له تطبيقات صناعية محدودة بسبب عدم قابليته للذوبان1. تتم معالجة عنق الزجاجة هذا عن طريق إخضاع الكيتين لإزالة الأسيتيل N، مما يضفي شحنة موجبة ويزيد من قابلية ذوبان البوليمر الناتج، الشيتوزان1. يمكن تعديل الكيتين إلى شيتوزان من خلال طريقين مختلفين: كيميائي وإنزيمي. يتطلب التطبيق الطبي الحيوي للشيتوزان نزع الأسيتيل الخاضع للرقابة والمعرفة ، والذي يقتصر على الطرق الكيميائية2،3. يمكن معالجة هذا القيد باستخدام deacetylases الكيتين (CDAs) ، وهو نهج إنزيمي أخضر لعملية إزالة الأسيتيل4،5.

ينتمي ديأسيتيلاز الكيتين إلى عائلة إستيراز الكربوهيدرات 4 (CE-4) ، المحددة في قاعدة بيانات الإنزيمات النشطة للكربوهيدرات (CAZY). تشترك إنزيمات عائلة CE-4 في مجال تماثل NodB أو عديد السكاريد deacetylase كمنطقة محفوظة. يتم استخدام التصميم المركب المركزي (CCD) ، وهو أداة إحصائية ، لتحسين العديد من الإنزيمات المعدلة للكيتين من النوع البري6،7،8،9. ومع ذلك ، فإن الخطوات النهائية في استخدام الكائنات البرية تصبح مملة ، ومن هنا جاء التحول نحو الإنزيمات المؤتلفة10،11،12،13،14،15،16،17. في السنوات الأخيرة ، اكتسب CDA المؤتلف الملحي من المصادر البحرية أهمية نظرا لسهولة تطبيقه الصناعي وإنتاج الشيتوزان من الدرجة الطبيةالحيوية 18،19.

إنتاج الإنزيم المؤتلف في بكتريا قولونية له قيود على العملية ، وهناك حاجة إلى تحسين الوسائط لأن تعبيره في الإشريكية القولونية يختلف اعتمادا على الجين والبلازميد المستخدم20. وبالتالي ، يصبح فحص العملية المناسبة ومعلمات المغذيات أمرا مهما. يتطلب عامل واحد في كل مرة (OFAT) ، وهي طريقة التحسين الشائعة الاستخدام ، موارد هائلة ووقتا لإجراء تجارب خطوة بخطوة. تعاني هذه الطريقة من نقص المعلومات الإحصائية فيما يتعلق بالتفاعل بين المعلمات20،21،22،23. لذلك ، تم اعتماد CCD لمنهجية سطح الاستجابة (RSM) لدراسة إنتاجية تعبير الكيتين ديستيلاز البكتيرية المحبة للملح (BaCDA) ونشاط BaCDA في بكتريا قولونية رشيد pLysS. كانت المعلمات التي تم أخذها في الاعتبار لتحسين التعبير في بكتريا قولونية هي المضيف هي تركيز اللاكتوز وتركيز الجلوكوز ودرجة حرارة الحضانة ومعدل التحريك ووقت الحضانة. في معظم دراسات التعبير عن الإشريكية القولونية ، تم استخدام وسائط لوريا بيرتاني (LB) مع الأيزوبروبيل β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) كمحفز. تطلبت هذه الإضافة من IPTG مراقبة منتظمة للنمو24. تفتح هذه الوساطات المتكررة أثناء عملية التخمير أيضا طرقا للتلوث. ومن ثم ، تحولت المجموعات البحثية إلى مرق رائع (TB) مع اللاكتوز كمحفز. ويعالج إدراج اللاكتوز في وسائط الإعلام بدلا من IPTG هذا القلق؛ تستهلك الإشريكية القولونية هذا اللاكتوز وتنتج ألو اللاكتوز كمنتج ثانوي ، مما يؤدي إلى حالة الحث التلقائي. تشتمل هذه الوسائط المحفزة الذاتية على الجلسرين ، الذي أظهر غلة محسنة من البروتين المؤتلف25.  تم تحسين هذا التعبير المفرط عن البروتينات المؤتلفة في وسائط السل بشكل أكبر من خلال تحسين معلمات العملية. في هذه الدراسة ، تم تطبيق تصميم مركب مركزي لتحسين التعبير غير المتجانس ل BaCDA الملحي في بكتريا قولونية رشيد خلايا PLysS. كانت معلمات العملية المختارة هي درجة حرارة الحضانة ومعدل التقليب ووقت الحضانة ، وكانت معلمات المغذيات التي تم تقييمها هي تركيز الجلوكوز واللاكتوز. تم تقييم تعبير BaCDA الملحي مع الحالة المثلى المتوقعة والتحقق من صحتها باستخدام SDS-PAGE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التعبير عن وسائل الإعلام وحالة الثقافة

  1. قم بتحويل ناقل pET-22b الذي يحتوي على جين BaCDA إلى بكتريا قولونية Rosetta pLysS الخلايا المختصة باستخدام طريقة الصدمة الحرارية ، كما هو موضح في15.
    ملاحظة: يجب توخي الحذر أثناء العمل مع الكائنات الحية الدقيقة. يجب تنفيذ جميع الأعمال الميكروبيولوجية داخل غطاء خزانة السلامة الحيوية لتجنب التلوث.
  2. إجراء دراسة التعبير الأولية في وسائط السل التي تحتوي على 0.05٪ (وزن حجم حجمي) جلوكوز و0.2٪ (وزن حجمي) لاكتوز عند 16 درجة مئوية و180 دورة في الدقيقة. تنمو 6.792 × 107 بكتريا قولونية رشيد خلايا PLysS في 100 مل من الوسائط التي تحتوي على البلازميد المستنسخ BaCDA حتى تصل إلى المرحلة الثابتة. في ظروف النمو المذكورة ، تصل بكتريا قولونية Rosetta pLysS إلى كثافة بصرية 600 (OD600) من 10.85 ± 0.21.
    ملاحظة: تكوين وسائط السل (٪ وزن حجم الحجم): التربتون، 1.2؛ مستخلص الخميرة ، 2.4 ؛ الجلسرين ، 0.6 ؛ و 1x تيرابايت ملح (17 ملي مولار KH2PO4 و 74 ملي كلفن2HPO4) 17.

2. التحسين والتصميم التجريبي

  1. تصميم التجارب وملاءمة نموذج كثيرة الحدود من الدرجة الثانية في التصميم المركب المركزي باستخدام برنامج الأدوات الإحصائية. كان البرمجيات الإحصائية المستخدمة في هذه الدراسة هي MINITAB 17.0 (نسخة تجريبية).
    1. للقيام بذلك ، افتح البرنامج وانقر على الأزرار التالية: Stat > DoE > Response Surface > إنشاء سطح استجابة > تصميم الاستجابة > مركب مركزي. يظهر الإخراج كمربع حوار.
  2. قم بتغذية المعلمات الخمسة ، درجة حرارة الحضانة ، ومعدل التحريك ، ووقت الحضانة ، وتركيز الجلوكوز ، وتركيز اللاكتوز ، على خمسة مستويات (-2 ، -1 ، 0 ، +1 ، +2) في مربع الحوار.
    1. للقيام بذلك ، أدخل المعلمات مع المستويات في مربع الحوار ، وأدخل تفاصيل جميع المعلمات ، واضغط على موافق. يؤدي هذا إلى إنشاء مصفوفة التصميم التجريبية مع ستة تكرارات في النقطة المركزية ، مما يتطلب 32 تشغيلا تجريبيا. يقوم البرنامج بإنشاء جدول يحتوي على المعلمات ومستوياتها بمصطلحات مشفرة وغير مشفرة ، وتستخدم في تحسين العملية باستخدام CCD (الجدول 1).
  3. قم بإجراء 32 تجربة مع الظروف التي تم إنشاؤها بواسطة البرامج. قم بتغذية النتائج التجريبية في مصفوفة التصميم التجريبي (التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج) التي تحتوي على مستويات ومعلمات من حيث الوحدات المشفرة وغير المشفرة (الجدول 2).
  4. تحليل مصفوفة التصميم التجريبي (الجدول 2) باستخدام البرنامج. للقيام بذلك ، افتح البرنامج وقم بتغذية الاستجابة في ورقة البيانات. حدد عمود الاستجابة > الإحصائيات > سطح استجابة DoE > > تحليل تصميم سطح الاستجابة > موافق. يتم تحليل المخرجات من أجل الدلالة الإحصائية ، ويتم تنبؤ النموذج بواسطة البرنامج.

الجدول 1: المعلمات ومستوياتها في المصطلحات المشفرة وغير المشفرة المستخدمة في التصميم التجريبي لتقدير التعبير عن ديسيتيلاز الكيتين المؤتلف في بكتريا قولونية رشيد خلايا pLysS. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: مصفوفة التصميم التجريبي مع نشاط BaCDA التجريبي والمتوقع (التعبير) عن ديسيتيلاز الكيتين المؤتلف في بكتريا قولونية رشيد خلايا pLysS. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

3. التحقق من صحة النموذج

  1. تحقق من صحة النموذج المصمم باستخدام أداة تحسين الاستجابة المتوفرة في البرنامج.
  2. كرر التخمير في الظروف المثلى التي تنبأ بها البرنامج وقارن القيمة التجريبية بالقيمة المتوقعة من قبل البرنامج.
    1. للقيام بذلك، افتح البرنامج وحدد عمود الاستجابة > Stat > DoE > Response Surface > Response Optimizer > Maxim > OK. الإخراج هو ظروف العملية المثلى والقيم التي تنبأ بها البرنامج. كرر التخمير في الظروف المثلى المتوقعة وقارن القيم.

4. الأساليب التحليلية

  1. التعبير والكتلة الحيوية وقياس البروتين
    1. قم بإجراء التخمير في 32 حالة قدمها البرنامج في مصفوفة التصميم التجريبي (الجدول 2). احصل على الحبيبات بعد كل تشغيل عن طريق الطرد المركزي للثقافة عند 5,405 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بوزن حبيبات الخلية لتحديد عائد الكتلة الحيوية.
      ملاحظة: يجب أن تتم جميع عمليات المناولة الميكروبية في ظروف معقمة (أي داخل خزانات السلامة الحيوية).
    2. ليزيل بيليه الخلية للحصول على البروتين المحيطي عن طريق الصوتنة. أضف 5 مل من المخزن المؤقت للتحلل (50 ملي مولار Tris-HCl ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار إيميدازول) إلى كل جرام من بيليه الخلية وتعطيل عن طريق صوتنة لمدة 10 دورات بنبض 10 ثوان على و 10 ثوان عند 60٪ سعة. اجمع المحللة عن طريق الطرد المركزي عند 5,405 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. حدد تركيز البروتين عن طريق اختبار برادفورد26.
      ملاحظة: لتجنب تمسخ البروتين ، يجب أن يتم الصوتنة في ظل الظروف الباردة. ضع العينات على الجليد أثناء إجراء الصوتنة.
    3. قم بتحليل تعبير BaCDA باستخدام SDS-PAGE متبوعا ببرنامج ImageJ. قم بتحميل 10 ميكرولتر من محللة الخلايا القابلة للذوبان (بروتين المحيط بلازمي) على هلام ثنائي الأكريلاميد بنسبة 12٪ وقم بتشغيله تحت 1x tris-glycine-SDS (TGS) المخزن المؤقت بتيار 100 فولت لمدة ساعتين. بعد اكتمال التشغيل ، قم بتلطيخ الجل باللون الأزرق Coomassie وقم بإزالته لإزالة الخلفية27.
    4. التقط صورة باستخدام وحدة توثيق الجل. حدد تعبير BaCDA عن طريق مقارنة شدة النطاق في شكل قيم البكسل باستخدام برنامج ImageJ. ضع في اعتبارك التشغيل التجريبي مع أقل نشاط BaCDA والكتلة الحيوية كبكسل مرجعي 28.
      1. للقيام بذلك ، افتح البرنامج وافتح ملف الصورة ، ثم حدد كل حارة باستخدام المربع المستطيل. انتقل إلى تحليل وقم بتعيين كل حارة على أنها 100٪، ثم حدد النطاق المعبر عنه بشكل مفرط في كل حارة باستخدام المربع المستطيل. انتقل إلى تحليل وتحديد شدة النطاق ، وكرر العملية في كل حارة ، وقم بتصدير النتيجة كملف .xls. ضع في اعتبارك شدة النطاق للتشغيل التجريبي مع أقل نشاط BaCDA ككثافة مرجعية وقم بتحليل التعبير عن كل حارة.
  2. مقايسة نشاط الإنزيم
    1. تحديد نشاط BaCDA باستخدام مجموعة فحص الأسيتات15 ، باستخدام الإيثيلين جلايكول كيتين (1 مجم / مل ؛ EGC) كركيزة29.
    2. اسمح ل 20 ميكرولتر من BaCDA بالتفاعل مع 40 ميكرولتر من الركيزة في وجود 40 ميكرولتر من 50 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7) المخزن المؤقت لمدة ساعة واحدة عند 30 درجة مئوية عن طريق التحريك عند 800 دورة في الدقيقة.
    3. بعد ساعة واحدة ، قم بالطرد المركزي للمتفاعل 100 ميكرولتر من خلال عمود 3 كيلو دالتون عند 2،111 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المحتجزين الذي يتكون من BaCDA واجمع المرشح الذي يحتوي على الأسيتات المنبعث أثناء التفاعل. استخدم المرشح لمقايسة الأسيتات لتحديد نشاط BaCDA.
      ملاحظة: يتم تعريف وحدة واحدة من الإنزيم على أنها النشاط الذي يطلق 1 ميكرومتر من الأسيتات من الركيزة لكل ميكرولتر من الإنزيم في الدقيقة. تم إجراء مقايسة نشاط الإنزيم في ثلاث نسخ ، وتم حساب نشاط الإنزيم المعني وفقا لذلك.
  3. حركية التخمير لتحريض اللاكتوز
    1. تحقق من ملف تعريف النشاط لتحديد نقطة تحريض اللاكتوز ونقطة بدء التعبير. يتم توصيف النشاط عن طريق تقدير الكتلة الحيوية ونشاط BaCDA مع ظروف التخمير المثلى.
    2. حدد تركيز الجلوكوز في الوسائط باستخدام مجموعة تقدير الجلوكوز. ارسم ملف تعريف النشاط باستخدام الكتلة الحيوية وتركيز الجلوكوز ونشاط BaCDA مقابل وقت التخمير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحسين عملية التعبير عن إنزيم الكيتين ديسيتيلاز المؤتلف المحيط بلازمي في الإشريكية القولونية باستخدام التصميم المركب المركزي (CCD)
أعطى بناء pET22b-Ba CDA ، عندما ينمو في ظروف غير محسنة ، إنتاجا قصوى من الكتلة الحيوية ونشاط BaCDA يبلغ 22.26 ± 0.98 جم / لتر و 84.67 ± 0.56 وحدة / لتر ، على التوالي15. في الدراسة الحالية ، تم اعتماد نهج إحصائي CCD للعثور على ظروف العملية المثلى للتعبير عن إنزيم المؤتلف الشامي كيتين ديسيتيلاز في بكتريا قولونية رشيد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكيتين منزوع الأسيتيل ، الشيتوزان ، له العديد من التطبيقات ، خاصة في المجال الطبيالحيوي 30. ومع ذلك ، فإن قابلية استنساخ الشيتوزان فيما يتعلق بدرجة الأستلة (DA) ونمط الأستلة (PA) هي مصدر قلق كبير بالإضافة إلى المخاوف البيئية الأخرى. وهكذا تم استغلال الطريق الأكثر اخضرارا ، باستخدام الإنزيمات. يمكن استخدام مجموعة CDAs لإنشاء الشيتوزان بنمط فريد من إزالة الأسيتيل ، مما يزيد من تطبيقاتها الطبيةالحيوية 4،5. في عملنا السابق ، تم التعبير عن جين...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا أكاديمية مانيبال للتعليم العالي (MAHE) على صندوق MAHE UNSW ، ويود المؤلفون أن يشكروا مجلس البحوث العلمية والصناعية - مجموعة تنمية الموارد البشرية (CSIR-MHRD) ، حكومة الهند على زمالة بحثية عليا ، رسالة الجائزة رقم 09/1165 (0007) 2K19 EMR-I بتاريخ 31.3.2019.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< قوية > مجموعات < / قوية >
مجموعة فحص الأسيتاتMegazyme ، أيرلنداK-ACETAKتم تعديل البروتوكول وتحسينه بشكل طفيف لإجراء الاختبار في 96 لوحة بئر
مجموعة تقدير الجلوكوزAgappe التشخيص المحدودة ، الهند12018013تعديل البروتوكول وتحسينه بشكل طفيف لإجراء الفحص في 96 لوحة
بئر<قوي > مواد كيميائية < / قوي >
حمض الخليكمرحبا وسائل الإعلام ، الهندAS001تستخدم لإعداد SDS-PAGE تلطيخ وحل إزالة التثبيت
أكريلاميدهاي ميديا ، الهندMB068تستخدم لتحضير جل SDS-PAGE
pursulphate الأمونيومHi-media ، الهندMB003تستخدم لتحضير جل SDS-PAGE
Bis-acrylamideHi-media، الهندMB005تستخدم لتحضير جل SDS-PAGE
Coomassie briliiant الأزرق G-250Hi-media ، الهندMB092تستخدم لتحضير محلول تلطيخ وإزالة التثبيت SDS-PAGE
Coomassie briliiant blue R-250Hi-media ، الهندMB153تستخدم لتحضير اختبار باردفورد
الإيثيلين جلايكول شيتوزانسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةE1502يستخدم لتحضير الإيثيلين جلايكول كيتين وكيتين جلايكول الإيثيلين كركيزة للتفاعل الأنزيمي
D-glucoseHi-media ، الهندMB037يستخدم كمكون وسائط.
إيميدازولهاي ميديا ، الهندGRM1864تستخدم في محلول التحلل
اللاكتوزهاي ميديا ، الهندGRM017تستخدم كمكون وسائط.
الميثانولفينار ، الهند30930LC250يستخدم لتحضير محلول تلطيخ وإزالة التثبيت SDS-PAGE
كلوريد الصوديوم (NaCl)Hi-media ، الهندMB023تستخدم في محلول التحلل
حمض الفوسفوريكهاي ميديا ، الهندMB157تستخدم لتحضير مقايسة باردفورد
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)Hi-media ، الهندGRM6218تستخدم لتحضير جل SDS-PAGE
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائيHi-media ، الهندMB024يستخدم لتحضير السل sald للوسائط والمخزن المؤقت للتفاعل الأنزيمي.
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة اللامائيHi-media ، الهندGRM3964يستخدم لتحضير السل sald للوسائط والمخزن المؤقت للتفاعل الأنزيمي.
تتراميثيلإيثيلين ديامين (TEMED)هاي ميديا ، الهندMB026تستخدم لتحضير جل SDS-PAGE
Tris baseHi-media ، الهندMB029تستخدم لتحضير جل SDS-PAGE
TryptoneHi-media ، الهندRM7707تستخدم كمكون للوسائط.
مستخلص الخميرةمرحبا وسائل الإعلام ، الهندRM027تستخدم كمكون للوسائط.
Equipment
AlphaImager وحدة توثيق هلام HPProteinSimple، الولايات المتحدة الأمريكية92-13823-00تستخدم لالتقاط صور SDS-PAGE
خلاط منضدةEppendorf، ألمانيا 9.776 660تستخدم للاحتفاظ بالتفاعل الأنزيمي مع محول 2 مل
Bioincubator shakerTrishul ، الهند13410622تستخدم لاحتضان الثقافة البكتيرية بدرجة حرارة مختلفة ومقياس
الطيف الضوئي الحيويEppendorf ، ألمانيا & nbsp ؛6135000009تستخدم لأخذ جميع القراءات الطيفية
تبريد أجهزة الطرد المركزيEppendorf ، ألمانيا   ؛5805000017تستخدم لزراعة الطرد المركزي والتحلل وجميع بروتوكولات الطرد المركزي الأخرى
Labnet International للحمام الجاف، الولايات المتحدة الأمريكيةS81522039تستخدم لتغيير طبيعة عينة البروتين ل SDS-PAGE
MicropipettesEppendorf ، ألمانيا & nbsp ؛3123000900تستخدم من خلال بروتوكول قياسات الحجم
أدوات شاكر الروكTrishul ، الهند11770719تستخدم لهز جل SDS-PAGE لتلوين وإزالة وحدة
SDS-PAGEBio-Rad ، الولايات المتحدة الأمريكية1658001FCتستخدم لصب وتشغيل جل SDS-PAGE
Ultra sonicatorSonics & Materials، Inc. ، USAVCX 130تستخدم لتحلل الخلية البكتيرية عن طريق الصوتنة
فوق الصوتية ميزانالوزن Sartorius ، ألمانياBSA124 Sتستخدم لقياس الوزن في جميع أنحاء البروتوكول
<قوي>الأجهزة < / قوي> أجهزة
الطرد المركزي Nanosep مع غشاء أوميغا (3 كيلو دالتون) علومالحياة PALL ، الولايات المتحدة الأمريكيةOD003C33تستخدم لفصل الإنزيم بعد الركيزة treatment
SoftwaresVersionتم تطويره في
MINITAB17.0  (نسخة تجريبية)  تستخدم جامعة ولاية بنسلفانيالتصميم النموذج التجريبي وتحليل البيانات
ImageJ1.53oالمعاهد الوطنية للصحة (NIH)المستخدمة لتحليل مستوى التعبير باستخدام SDS-PAGE image
Plasmid
pET22b (+) DNA & [مدش] ؛ نوفاجينميرك- ميليبور ، الولايات المتحدة الأمريكية69744مخزنة في & ناقص ؛ 20 درجة ؛ C
Cells
E. قولونية رشيد pLysS &[مدش] ؛ NovagenMerck- Millipore ، الولايات المتحدة الأمريكية70956صيانتها في Luria & ndash ؛ مرق بيرتاني (LB) يحتوي على 25٪ جلسرين عند & ناقص ؛ 80 درجة ؛ ج
تم RPM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yadav, M., et al. Seafood waste: a source for preparation of commercially employable chitin/chitosan materials. Bioresources and Bioprocessing. 6 (1), 1-20 (2019).
  2. Anil, S. Potential medical applications of chitooligosaccharides. Polymers. 14 (17), 3558(2022).
  3. Amiri, H., et al. Chitin and chitosan derived from crustacean waste valorization streams can support food systems and the UN Sustainable Development Goals. Nature Food. 3 (10), 822-828 (2022).
  4. Wattjes, J., et al. Patterns matter part 1: Chitosan polymers with non-random patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104583(2020).
  5. Cord-Landwehr, S., et al. Patterns matter part 2: Chitosan oligomers with defined patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104577(2020).
  6. He, Y., Xu, J., Wang, S., Zhou, G., Liu, J. Optimization of medium components for production of chitin deacetylase by Bacillus amyloliquefaciens Z7, using response surface methodology. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 28 (2), 242-247 (2014).
  7. Pareek, N., Vivekanand, V., Saroj, S., Sharma, A. K., Singh, R. P. Purification and characterization of chitin deacetylase from Penicillium oxalicum SAE M-51. Carbohydrate Polymers. 87 (2), 1091-1097 (2012).
  8. Yonis, R. W., Luti, K. J. K., Aziz, G. M. Statistical optimization of chitin bioconversion to produce an effective chitosan in solid state fermentation by Asperigellus flavus. Iraqi Journal of Agricultural Sciences. 50 (3), 916-927 (2019).
  9. Deeba, F., Shakir, H. A., Irfan, M., Khan, M., Qazi, J. I. Utilization of agro-industrial waste for chitinase production by locally isolated bacillus subtilis using response surface methodology. Pakistan Journal of Zoology. 54 (2), 551-560 (2022).
  10. Pandey, A., Tripathi, A. H., Tripathi, P. H. Production, purification, and application of the microbial enzymes. Industrial Applications of Microbial Enzymes. , CRC Press. 19-39 (2022).
  11. Bhat, P., et al. Expression of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli pLysS: Sustainable production, purification and characterisation. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 1008-1013 (2019).
  12. Hamer, S. N., et al. Enzymatic production of defined chitosan oligomers with a specific pattern of acetylation using a combination of chitin oligosaccharide deacetylases. Scientific Reports. 5, 8716(2015).
  13. Kadokura, K., et al. Production of a recombinant chitin oligosaccharide deacetylase from Vibrio parahaemolyticus in the culture medium of Escherichia coli cells. Biotechnology Letters. 29 (8), 1209-1215 (2007).
  14. Liu, J., et al. Identification and characterization of a chitin deacetylase from a metagenomic library of deep-sea sediments of the Arctic Ocean. Gene. 590 (1), 79-84 (2016).
  15. Pawaskar, G. M., Raval, K., Rohit, P., Shenoy, R. P., Raval, R. Cloning, expression, purification and characterization of chitin deacetylase extremozyme from halophilic Bacillus aryabhattai B8W22. Biotech. 11 (12), 515(2021).
  16. Raval, R., Simsa, R., Raval, K. Expression studies of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli Rosetta cells. International Journal of Biological Macromolecules. 104, 1692-1696 (2017).
  17. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).
  18. Yang, G., et al. Enzymatic modification of native chitin and chitin oligosaccharides by an alkaline chitin deacetylase from Microbacterium esteraromaticum MCDA02. International Journal of Biological Macromolecules. 203, 671-678 (2022).
  19. Amer, O. A., et al. Exploring new marine bacterial species, Alcaligenes faecalis Alca F2018 valued for bioconversion of shrimp chitin to chitosan for concomitant biotechnological applications. International Journal of Biological Macromolecules. 196, 35-45 (2022).
  20. Packiam, K. A. R., Ramanan, R. N., Ooi, C. W., Krishnaswamy, L., Tey, B. T. Stepwise optimization of recombinant protein production in Escherichia coli utilizing computational and experimental approaches. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (8), 3253-3266 (2020).
  21. Jayakumar, D., Sachith, S. K., Nathan, V. K., Rishad, K. S. M. Statistical optimization of thermostable alkaline protease from Bacillus cereus KM 05 using response surface methodology. Biotechnology Letters. 43 (10), 2053-2065 (2021).
  22. Balakrishnan, R., Mohan, N., Sivaprakasam, S. Application of design of experiments in bioprocessing: process analysis, optimization, and reliability. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 289-319 (2022).
  23. Papaneophytou, C. P., Kontopidis, G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in Escherichia coli: A general review. Protein Expression and Purification. 94, 22-32 (2014).
  24. Tang, S. R., Somasundaram, B., Lua, L. H. L. Protein expression optimization strategies in E. coli: a tailored approach in strain selection and parallelizing expression conditions. Methods in Molecular Biology. 2406, 93-111 (2022).
  25. Nag, N., Khan, H., Tripathi, T. Strategies to improve the expression and solubility of recombinant proteins in E. coli. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , Academic Press. 1-12 (2022).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  27. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of staining sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels with coomassie brilliant blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  28. Etemadzadeh, M. H., Arashkia, A., Roohvand, F., Norouzian, D., Azadmanesh, K. Isolation, cloning, and expression of E. coli BirA gene for biotinylation applications. Advanced Biomedical Research. 4, 149(2015).
  29. Yin, L., Wang, Q., Sun, J., Mao, X. Expression and molecular modification of chitin deacetylase from Streptomyces bacillaris. Molecules. 28 (1), 113(2023).
  30. Hamedi, H., Moradi, S., Hudson, S. M., Tonelli, A. E., King, M. W. Chitosan based bioadhesives for biomedical applications: A review. Carbohydrate Polymers. 282, 119100(2022).
  31. Falak, S., Sajed, M., Rashid, N. Strategies to enhance soluble production of heterologous proteins in Escherichia coli. Biologia. 77 (3), 893-905 (2022).
  32. Shahzadi, I., et al. Scale-up fermentation of Escherichia coli for the production of recombinant endoglucanase from Clostridium thermocellum. Scientific Reports. 11 (1), 7145(2021).
  33. Ganjave, S. D., Dodia, H., Sunder, A. V., Madhu, S., Wangikar, P. P. High cell density cultivation of E. coli in shake flasks for the production of recombinant proteins. Biotechnology Reports. 33, 00694(2022).
  34. Wurm, D. J., et al. The E. coli pET expression system revisited-mechanistic correlation between glucose and lactose uptake. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (20), 8721-8729 (2016).
  35. Gennari, A., et al. Recombinant production in Escherichia coli of a β-galactosidase fused to a cellulose-binding domain using low-cost inducers in fed-batch cultivation. Process Biochemistry. 124, 290-298 (2023).
  36. Mostovenko, E., Deelder, A. M., Palmblad, M. Protein expression dynamics during Escherichia coli glucose-lactose diauxie. BMC Microbiology. 11, 126(2011).
  37. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-32 (2014).
  38. Studier, F. W. Stable cultures and auto-induction for inducible protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-22 (2014).
  39. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  40. Selvaraj, S., Natarajan, K., Nowak, A., Murty, V. R. Mathematical modeling and simulation of newly isolated bacillus cereus M1GT for tannase production through semi-solid state fermentation with agriculture residue triphala. South African Journal of Chemical Engineering. 35 (1), 89-97 (2021).
  41. Ghahremanifard, P., Rezaeinezhad, N., Rigi, G., Ramezani, F., Ahmadian, G. Designing a novel signal sequence for efficient secretion of Candida antarctica lipase B in E. coli: The molecular dynamic simulation, codon optimization and statistical analysis approach. International Journal of Biological Macromolecules. 119, 291-305 (2018).
  42. Vuillemin, M., Malbert, Y., Laguerre, S., Remaud-Siméon, M., Moulis, C. Optimizing the production of an α-(1→2) branching sucrase in Escherichia coli using statistical design. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (12), 5173-5184 (2014).
  43. Sattari, F., Rigi, G., Ghaedmohammadi, S. The first report on molecular cloning, functional expression, purification, and statistical optimization of Escherichia coli-derived recombinant Ficin from Iranian fig tree (Ficus carica cv.Sabz). International Journal of Biological Macromolecules. 165, 2126-2135 (2020).
  44. Hajihassan, Z., Biroonro, N. Enhanced expression of recombinant activin A in Escherichia coli by optimization of induction parameters. Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran. 29 (2), 105-111 (2018).
  45. Rigi, G., Mohammadi, S. G., Arjomand, M. R., Ahmadian, G., Noghabi, K. A. Optimization of extracellular truncated staphylococcal protein A expression in Escherichia coli BL21 (DE3). Biotechnology and Applied Biochemistry. 61 (2), 217-225 (2014).
  46. Faust, G., Stand, A., Weuster-Botz, D. IPTG can replace lactose in auto-induction media to enhance protein expression in batch-cultured Escherichia coli. Engineering in Life Sciences. 15 (8), 824-829 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chitin DeacetylaseRecombinant ExpressionE Coli RosettaChitosan ProductionProcess OptimizationCentral Composite DesignResponse Surface MethodologyEnzyme KineticsLactose InductionFermentation Process
Video Coming Soon

Related Articles