يصف البروتوكول الحالي التصوير بالموجات فوق الصوتية عالي التردد لتصور الغدة الدرقية للفأر بالكامل ومراقبة نمو سرطان الغدة الدرقية الكشمي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير بالموجات فوق الصوتية عالية الدقة لتحليل أورام ATC التقويمية في نموذج فأر مهندس وراثيا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يرتبط سرطان الغدة الدرقية الكشمي (ATC) بسوء التشخيص وقصر متوسط وقت البقاء على قيد الحياة ، ولكن لا يوجد علاج فعال يحسن النتائج بشكل كبير. قد تساعد نماذج الفئران المعدلة وراثيا التي تحاكي تطور ATC الباحثين على دراسة علاجات هذا المرض. تهجين ثلاثة أنماط وراثية مختلفة من الفئران ، TPO-cre / ERT2 ؛ برافCA / بالوزن ؛ تم تطوير نموذج ATC المعدل وراثيا Trp53 Δex2-10 /Δex2-10. تم تحفيز نموذج الفئران ATC عن طريق الحقن داخل الصفاق من عقار تاموكسيفين مع الإفراط في التعبير عن BrafV600E وحذف Trp53 ، وتم إنشاء الأورام في غضون شهر 1 تقريبا. تم تطبيق الموجات فوق الصوتية عالية الدقة للتحقيق في بدء الورم وتطوره ، وتم الحصول على منحنى النمو الديناميكي عن طريق قياس أحجام الورم. بالمقارنة مع التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي المحوسب ، فإن الموجات فوق الصوتية لها مزايا في مراقبة نموذج الفئران ATC ، مثل كونها غير جراحية ومحمولة وفي الوقت الفعلي وبدون التعرض للإشعاع. الموجات فوق الصوتية عالية الدقة مناسبة للقياسات الديناميكية والمتعددة. ومع ذلك ، يتطلب الفحص بالموجات فوق الصوتية للغدة الدرقية في الفئران المعرفة والخبرة التشريحية ذات الصلة. توفر هذه المقالة إجراء مفصلا لاستخدام الموجات فوق الصوتية عالية الدقة لمسح الأورام في نموذج ATC المعدل وراثيا. وفي الوقت نفسه ، يتم سرد تعديل المعلمة بالموجات فوق الصوتية ، ومهارات المسح بالموجات فوق الصوتية ، والتخدير واستعادة الحيوانات ، وغيرها من العناصر التي تحتاج إلى عناية أثناء العملية.
المقدمة
على الرغم من أن سرطان الغدة الدرقية الكشمي (ATC) يمثل أقل من 2٪ من سرطانات الغدة الدرقية ، إلا أنه يسبب أكثر من 50٪ من الوفيات المرتبطة بسرطان الغدة الدرقية سنويا. متوسط وقت البقاء على قيد الحياة بعد التشخيص مع ATC هو حوالي 6 أشهر فقط ، ولا توجد علاجات متاحة تحسن بشكل كبير البقاء على قيد الحياة 1,2.
وقد أعاقت ندرة ATC البحث الذي يدرس كيف يبدأ المرض ويتقدم بقوة. أصبحت نماذج الفئران المعدلة وراثيا التي تحاكي المرض متاحة مؤخرا ، والتي توفر نظرة ثاقبة للمرض واستجاباته للعلاجات الممكنة3،4،5. تتطلب مثل هذه الدراسات تصويرا دقيقا للورم للقياسات والمراقبة ، والتي يتم إجراؤها عادة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي المحوسب أو التصوير بالموجات فوق الصوتية عالي الدقة 6,7. وقد استخدم التصوير بالموجات فوق الصوتية على نطاق واسع في أعضاء الفأر. لها مزايا على التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي المحوسب حيث يمكن إجراؤها في الوقت الفعلي ولا تعرض الموضوع للإشعاع ، والمعدات اللازمة صغيرة بما يكفي لتكون محمولة 8,9. ومع ذلك ، فإن الدراسات حول المراقبة المستمرة لنمو ATC باستخدام الموجات فوق الصوتية نادرة. لذلك ، يستكشف هذا العمل فائدة الموجات فوق الصوتية في هذا السياق.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول لاستخدام الموجات فوق الصوتية عالية الدقة لمسح الأورام ومراقبتها وقياسها بدقة في نموذج الماوس من ATC.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت الدراسة الحالية بموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة سيتشوان. TPO-cre / ERT2 ؛ برافCA / بالوزن ؛ Trp53 Δex2-10/ Δex2-10 الفئران المعدلة وراثيا10 تم استخدامها في هذه الدراسة (انظر جدول المواد). يمكن تعديل خطوات البروتوكول لأنواع الحيوانات المختلفة إذا لزم الأمر. تم استخدام اثني عشر فأرا ، بما في ذلك ست إناث وستة ذكور ، بمتوسط عمر 93 يوما ، هنا.
1. التحضير التجريبي
- قم بتشغيل نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) وإنشاء مجلد جديد لالتقاط الصور وجمع البيانات. حدد مسبار الخط 40 ميجاهرتز وانقر على نمط الأنسجة السطحية لتنشيط محول الأنسجة السطحي. استخدم "الوضع B" لتصوير الغدة الدرقية (الشكل 1 أ).
ملاحظة: الوضع B هو وضع التصوير بالموجات فوق الصوتية الأساسي. يعتمد ظهور صور الموجات فوق الصوتية على التفاعلات الجسدية للصوت مع الأنسجة في الجسم. يتم إنتاج صور الوضع B كصور رمادية11,12. - احتفظ بالفئران في أقفاص محددة مع حرية الوصول إلى الطعام والماء. ضع القفص على جهاز تسخين إضافي (انظر جدول المواد) لضمان التنظيم الحراري.
- تأكد من وجود إيزوفلوران كاف في المرذاذ و O2 في الخزان. إذا كانت الإمدادات غير كافية ، استبدل الخزانات بأخرى جديدة.
- قم بتنظيف منصة تصوير الحيوانات بمحلول ملحي معقم وقم بتشغيل زر التسخين. تحقق من أن درجة الحرارة هي 38-40 درجة مئوية قبل وضع الحيوان على المنصة (الشكل 1C).
2. إعداد الحيوان للتصوير
- قم بتشغيل مبخر الأيزوفلوران. نقل الماوس من القفص إلى صندوق التخدير.
- تخدير الحيوان باستخدام خليط من 1٪ -2٪ من الأيزوفلوران من المرذاذ والأكسجين المتدفق بسرعة 0.8 لتر / دقيقة.
- ضع كريم مزيل الشعر من الصدر إلى الرقبة ، وانتظر 30 ثانية ، ثم امسح الكريم والفراء تماما. شطف جيدا المنطقة والفراء المحيطة بها مع المياه المالحة المعقمة الدافئة.
- ضع الحيوان المخدر على المنصة الساخنة. قم بتغطية الخطم بمخروط أنف متصل بمخرج التخدير (الشكل 2 أ ، ب).
ملاحظة: يجب تخدير الماوس بالكامل في غضون 1-2 دقيقة. إذا كان الحيوان لا يزال نشطا ، فقم بإجراء تحريض إيزوفلوران مطول حتى لا يظهر الحيوان منعكس انسحاب الدواسة. تأكد من أن الحيوان يتنفس بثبات. - أثناء التصوير ، راقب معدل ضربات قلب الماوس من خلال المنصة الساخنة.
ملاحظة: تم تجهيز نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية بجهاز مراقبة معدل ضربات القلب. - استخدم شريطا لاصقا لتثبيت أطراف الماوس على المنصة الساخنة ، مع وجود الحيوان في وضع ضعيف. تأكد من وضع مخروط الأنف بثبات مع تدفق غاز مخدر ثابت (1.5 لتر / دقيقة).
- حماية العينين عن طريق تطبيق مرهم العيون.
3. تصوير الورم
- اضبط نظام التصوير لتحسين الدقة. قم بإعداد المعلمات التالية: كسب ثنائي الأبعاد ، 25-30 ديسيبل ؛ عمق الصورة ، 10 مم ؛ عدد مناطق التركيز، 3؛ ومركز ، 3-6 ملم.
ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية، استخدم مسبار 40 ميغاهيرتز. تم تحديد الوضع B للحصول على البيانات. - ضع جل الموجات فوق الصوتية بحرية (انظر جدول المواد) على منطقة الجلد العاري.
- أمسك المسبار وضعه على اتصال مع هلام الموجات فوق الصوتية على الصدر ، ثم امسح من الصدر باتجاه الرقبة لتحديد موقع الغدة الدرقية (الشكل 2C).
ملاحظة: اضغط برفق أثناء المسح ؛ الضغط المفرط على رقبة الحيوان قد يسبب اللهاث أو انقطاع النفس. تم تطوير هذا البروتوكول بناء على المسح الضوئي المحمول ، ولكن يمكن أيضا إجراء المسح الميكانيكي باستخدام آلة لتوجيه المسبار ، مثل منصة تصوير الحيوانات التي تتحرك على طول المحورين x و y. - لأعلى ولأسفل لتحديد حدود الورم وتقييم حجمه وشكله.
ملاحظة: عادة ما تظهر الغدة الدرقية السليمة كبنية متجانسة ناقصة الصدى أمام القصبة الهوائية. تتسبب الأورام الكشمية في ظهور الغدة الدرقية بشكل أكبر بكثير ، والذي يمكن التعرف عليه بسهولة عن طريق مسح الرقبة (الشكل 3). - تحديد أورام ATC من القصبة الهوائية وعضلات الشريط اعتمادا على الموقع التشريحي وصدى الموجات فوق الصوتية.
ملاحظة: تقع عضلات الحزام أمام الغدة الدرقية والقصبة الهوائية ، وكذلك خلف الغدة الدرقية. يظهر صدى الموجات فوق الصوتية لعضلات الحزام أعلى من صدى ATC ، بينما يوجد توهين خلف القصبة الهوائية13.- بناء على انطباع الورم الكلي ، قم بتأكيد قسم الصورة بأكبر قطر للورم من اليسار إلى اليمين. اضغط على زر التجميد ، وقم بقياس أقطار الورم الأمامية الخلفية واليسرى إلى اليمنى باستخدام الفرجار بالموجات فوق الصوتية.
ملاحظة: يجب قياس القطر الأمامي الخلفي بشكل عمودي على قطر الورم من اليسار إلى اليمين (الشكل 4). تم حساب حجم الورم في ATC بضرب القطر الأمامي الخلفي في قطر الورم من اليسار إلى اليمين14. نظرا لأن حجم الأورام على الجانبين الأيسر والأيمن كان غير متسق ، فقد تم حساب كل جانب من الأورام بشكل منفصل. تم الحصول على الحجم الكلي للأورام عن طريق إضافة الأورام الثنائية. تم تسجيل الأحجام لمراقبة منحنى نمو ATC.
- بناء على انطباع الورم الكلي ، قم بتأكيد قسم الصورة بأكبر قطر للورم من اليسار إلى اليمين. اضغط على زر التجميد ، وقم بقياس أقطار الورم الأمامية الخلفية واليسرى إلى اليمنى باستخدام الفرجار بالموجات فوق الصوتية.
- احفظ التسجيل كحلقة سينمائية ، مما يسهل مراجعة الصور المحددة.
4. استعادة الحيوان
- بعد المسح ، امسح هلام الموجات فوق الصوتية وأزل الشريط المقيد من أطراف الحيوان.
- ضع الماوس على جهاز التسخين التكميلي (الخطوة 1.2). ضع الحيوان على جانبه (الشكل 2 د).
- بعد أن يتعافى الماوس (~ 5 دقائق) ، انقله مرة أخرى إلى القفص.
- قم بتنظيف نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية والمسبار والمنصة باستخدام قطعة قماش ناعمة وكحول الأيزوبروبيل أو مناديل الجلوتارالدهيد.
- قم بإيقاف تشغيل نظام التصوير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كان متوسط حجم ATC الأيمن في بداية الدراسة 4.867 مم 2 ، وكان متوسط حجم ATC الأيسر 5.189 مم2. في القياس الرابع ، نما متوسط حجم ATC الأيمن إلى 11.844 مم 2 ، بينما نما حجم الورم في الفص الأيسر إلى 9.280 مم2. زاد إجمالي حجم ATC من 10.057 مم 2 إلى 15.843 مم2. في المرحلة اللاحقة من الدراسة ، نما ATC بسرعة. من حيث الفأر المسمى "P92" (الجدول 1) ، نما حجم الورم في القياس الرابع إلى ما يقرب من أربع مرات أكبر من الحجم في القياس الأولي. يوضح
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يستخدم هذا البروتوكول التصوير بالموجات فوق الصوتية عالي الدقة لتحليل أورام ATC التقويمية في نموذج فأر معدل وراثيا. النموذج المعدل وراثيا ، مع النمط الجيني ل TPO-cre / ERT2 ؛ برافCA / بالوزن ؛ تم تطوير Trp53 Δex2-10/ Δex2-10 في مختبرنا. الحيوانات تفرط في التعبير عن BrafV600E وتفتقر إلى Trp53 ؛ حقن الحيوانات داخل الصفاق مع عقار تاموكسيفين يؤدي إلى نمو الورم بعد حوالي 1 شهر10. تنمو الأورام بسرعة وتصل إلى حجم قابل للقياس في غضون 50 يوما. تم استخدام هذ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
شكر وتقدير
لم يتلق هذا البحث أي منحة محددة من وكالات التمويل العامة أو التجارية أو غير الربحية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الشريط اللاصق | الفائز | ||
| نظام التخدير | RWDlifescience | ||
| Brafflox / wt< / sup>< em> الفئران | التعاون مع معهد علوم الحياة ، eBond Pharmaceutical Technology Ltd ، تشنغدو ، الصين | ||
| غرفة لتحريض التخدير | RWDlifescience | ||
| مسحات قطنية | الفائز | ||
| كريم مزيل الشعر | Veet | ||
| بطانية تسخين كهربائية | Petbee | ||
| Isoflurane مبخر | RWDlifescience | ||
| قفازات طبية | الفائز | ||
| المناشف الورقية | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre / ERT2 الفئران | التعاون مع معهد علوم الحياة ، eBond Pharmaceutical Technology Ltd ، تشنغدو ، الصين | ||
| Trp53flox / wt < / sup>< / em>m | تعاون مع معهد علوم الحياة ، eBond Pharmaceutical Technology Ltd ، تشنغدو ، الصين | ||
| هلام الموجات فوق الصوتية | Keppler | KL-250 | |
| آلة الموجات فوق الصوتية | VisualSonics | Vevo 3100 |
المراجع
- Maniakas, A., et al. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Molinaro, E., et al. Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies. Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma. Journal of Visualized Experiments. (175), e62527(2021).
- Wang, Y., et al. Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma. Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).
- Mohammed, A., et al. Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies. Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).
- Wege, A. K., et al. High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).
- Greco, A., et al. Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731(2017).
- Renault, G., et al. High-resolution ultrasound imaging of the mouse. Journal of Radiologie. 87, 1937-1945 (2006).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Garassini, M. Basic principles of ultrasonic diagnosis. GEN. 39 (4), 283-289 (1985).
- Aldrich, J. E. Basic physics of ultrasound imaging. Critical Care Medicine. 35, 131-137 (2007).
- Mancini, M., et al. Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice. Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).
- Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
