أحد الدوافع الرئيسية للأنماط الظاهرية للخلايا في حقيقيات النوى هو التعبير الجيني. يعد التحكم في التعبير الجيني أمرا ضروريا ويعتمد على بروتينات وحمض النووي الريبي المتعدد ، من النسخ إلى عمليات الترجمة1. يمكن أن تؤدي التعديلات على طول هذه الخطوات إلى العديد من الأمراض المختلفة. تشكل معالجة الحمض النووي الريبي والربط مجموعة مهمة من التفاعلات المسؤولة عن توليد جزيئات الحمض النووي الريبي الناضجة2،3،4،5. يزيل الربط الإنترونات وينضم إلى exons لتوليد جزيء RNA ناضج قادر على أداء الأنشطة الوظيفية والهيكلية. تؤثر كفاءات ومعدلات الربط بشكل كبير على الأنماط الظاهرية التي لوحظت في ظل ظروف مختلفة6.
يتم إجراء الربط بواسطة آلية جزيئية معقدة تسمى spliceosome ، والتي تتكون من خمسة snRNAs وأكثر من 100 بروتين5،7. بالإضافة إلى مكونات البروتين الأساسية ، تحتوي spliceosomes على بروتينات عابرة المفعول ، والتي قد تؤثر بشكل مباشر على تنظيم هذه العملية8،9. تنعكس أهمية الربط في مجموعة واسعة من الأمراض التي تسببها التغيرات في هذه العملية ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية والأمراض العصبية العضلية وعدة أنواع من السرطان3،10،11. يمكن أن تؤثر دراسة ديناميكيات الربط وتجميع الربط بشكل كبير على فهم بيولوجيا هذه الاضطرابات.
يبدأ تجميع Spliceosome بارتباط U1 snRNP بمنطقة معينة من pre-mRNA الذي تم نسخه مؤخرا ، موقع لصق 5 بوصات5،8. إن الاقتران والتعرف الفعال على مواقع لصق 5 بوصات بواسطة U1 snRNA لا يحدد مواقع لصق التي يجب استخدامها فحسب ، بل يتحكم أيضا في ما قبل الحمض النووي الريبي الذي سيتم تقطيعه أولا ، أو بشكل أكثر كفاءة6،12،13. يمكن أن يؤدي استخدام مواقع لصق مختلفة إلى إنشاء أشكال إسوية بديلة متعددة من الحمض النووي الريبي الناضج من نفس الجين. يعد التضفير البديل مصدرا رئيسيا للتنوع البروتيني ، مما يسمح بتوليد الحمض النووي الريبي والبروتينات المطلوبة أثناء التطور أو في خلايا وأنسجة مختلفة14،15. يمكن أن تولد نصوص الحمض النووي الريبي البديلة أشكالا إسوية للبروتين مقطوعة أو غير وظيفية ، والتي قد تسبب أمراضا10،16. لذلك ، فإن مكونات البروتين لمركب U1 snRNP لها دور تنظيمي مهم في التضفير1. Galectin-1 و Galectin-3 (Gal1 و Gal3) هي مكونات من U1 snRNP17،18. يقترح Voss et al.19 طريقة تجزئة المستخلصات النووية للحصول على مجمعات مخصبة ب Gal3-U1 snRNP قادرة على إنقاذ نشاط الربط في الخلايا المستنفدة من U1. يساهم هذا التحليل في فهم آلية ارتباط Gal3 بالجسيمات المتشبعة ، ويمكن استخدام مناهج مماثلة لاستكشاف البروتينات التنظيمية المحتملة الأخرى.
يعد ربط U1 snRNP بمواقع لصق 5 بوصات وسيطا مهما لدقة الربط20. تعتبر الطفرات في مواقع لصق 5 بوصات حرجة وتسبب فقدان اقتران U1 snRNP ، مما يؤدي إلى عيوب الربط2. التليف الكيسي ، على سبيل المثال ، ناتج عن موقع لصق متحور 5 بوصات في جين CFTR21. يصف Wong et al.22 طريقة للتعويض عن طفرات موقع لصق 5 بوصات مع طفرات تكميلية في U1 snRNAs. يعزز هذا النهج بنجاح إدراج exon ، وتوليد RNAs ناضجة ويؤدي إلى الإنقاذ من عيوب الربط. بالإضافة إلى تقديم علاج محتمل قائم على الحمض النووي الريبي لهذه الأمراض ، يمكن أن يكون هذا النهج مفيدا لتحليل التسلسلات التنظيمية الفردية في ما قبل الرنا المرسال23.
تم أيضا استكشاف دقة ارتباط U1 snRNA لمواقع لصق في نظام نموذج الخميرة بواسطة van der Feltz24. تم استخدام الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae على نطاق واسع لاستكشاف حركية الربط وتجميع الجسيمات25. يتم الحفاظ على حركية الربط وتكوين الربط بشكل جيد في حقيقيات النوى ، وقد تم استخدام الخميرة على نطاق واسع لمراقبة تكوين المجمعات الوسيطة أثناء التجميع26. يعتمد اختبار مراسل ACT1-CUP1 على التعبير عن زوج من الجينات: ACT1 ، الذي يحتوي على إنترون واحد مع تسلسلات موقع لصق مثالية ، و CUP1 ، الذي يعبر عن مخلب نحاسي ، يحمي الخلية من الضرر الناجم عن هذا الأيون المعدني. يتم التعبير عن CUP1 فقط إذا تم تقسيم ACT1 بشكل صحيح ، وبالتالي إنشاء نظام المراسل27. يمكن مراقبة نمو الخلايا في ظل ظروف ذات تركيزات مختلفة من النحاس لمعالجة كفاءة الربط لتسلسلات الإنترون المختلفة أو باستخدام بروتينات تنظيمية مختلفة. يقدم van der Feltz24 طريقة لتحليل تأثيرات البروتين التنظيمي للربط باستخدام نظام المراسل هذا ومقايسات الجدوى النحاسية. يمكن استخدام نهج مماثل لتصميم الاختلافات في تسلسل الإنترون مع بروتينات مختلفة لمعالجة نجاح التضفير في الخمائر.
بالإضافة إلى ارتباط snRNP ، يعد ارتباط البروتينات أمرا ضروريا أثناء تجميع spliceosome1. يعتمد التحكم في نشاط الجسيم الوريدي بشكل مباشر على تركيبته البروتينية والتفاعلات التي تحدث أثناء تكوينه. الخصائص الهيكلية والوظيفية لمكونات البروتين مهمة لتنشيط المركب5،7. يستخدم Carvalho et al.28 نهجا يعتمد على طريقة Grafix ، والتي تعتمد على التشابك غير القابل للانعكاس في تحليل تدرج الجلسرين. يتناول هذا التحليل تكوين البروتينات والتفاعلات العابرة التي تحدث أثناء التجميع ، والتي يمكن أن تكون حاسمة لتجميع المركب النشط ونجاح الربط. يمكن أن يكون تحليل المجمعات الجزيئية الديناميكية الأخرى باستخدام هذا النهج مفيدا للغاية ويوفر رؤى حول تنظيم البروتين وتفاعلاته.
تتأثر كيمياء وسرعة الربط أيضا بالارتباط الديناميكي لمكونات الربط المختلفة8. في الآونة الأخيرة ، كشف استخدام مثبطات الربط الجزيئات الصغيرة أنه يمكن إيقاف خطوات محددة في المختبر بسبب انخفاض سرعة تفاعلات الربط29،30. يقدم Basei et al.31 طريقة لتحليل التضفير البديل على تأثير عامل تنظيم الربط ، Nek4. يتم تناول انتشار الأشكال الإسوية للنسخ التي تؤدي إلى أنماط ظاهرية مؤيدة أو مضادة للأورام في خلايا HEK293 باستخدام جين صغير. يمكن أن يؤدي سوء تنظيم الربط أو الاستخدامات المختلفة لمواقع لصق إلى توليد نسخة بديلة ، مما يتسبب في أنواع مختلفة من السرطان16. يمكن أن يؤدي استخدام معدلات الربط أو مثبطات الربط أثناء العلاج إلى تحديد خيارات موقع اللصق ، وبالتالي تحديد الأشكال الإسوية البديلة المتولدة ، سواء كانت مؤيدة أو مضادة للأورام. يستخدم باكليتاكسيل وسيسبلاتين حاليا كعوامل علاج كيميائي. باستخدام الجين المصغر E1A ، تتم معالجة آثار هذه الأدوية في التضفير البديل. يعد تحليل التضفير البديل باستخدام الجينات الصغيرة استراتيجية مهمة لمراقبة تأثيرات البروتينات العابرة المفعول وتغييرات التضفير عند العلاج واستخدام أدوية معينة.
في هذا الخط ، تم الإبلاغ عن العديد من microRNAs الداخلية (miRNAs) على أنها مرتبطة بالأنماط الظاهرية الورمية32،33. يمكن أن يرتبط التحكم في تخليق الحمض النووي الريبي الإنتروني وتنظيمه وتكوين الأحياء بالتحكم في تفاعلات الربط. يمكن أن تعدل miRNAs استقرار وانتشار mRNAs في الخلايا ، مما يؤثر على استقرار الحمض النووي الريبي ومعدل الترجمة34 . يصف جاتي دا سيلفا وكولتري35 نظاما مراسلا لتقييم التكوين الحيوي للحمض النووي الريبي الإنتروني ونضجه ، والذي يمكن ربطه مباشرة بالتغيرات في الأنماط الظاهرية الخلوية وتحديد الخصائص المؤيدة أو المضادة للورم. من خلال تعديل البروتين التنظيمي للتضفير HuR ، يسمح النظام بتحليل التكوين الحيوي والنشاط الوظيفي ل miRNA المسرطم الداخلي.
سيكون تحليل التضفير المسبق للحمض النووي الريبي ونضج الحمض النووي الريبي المختلف في خلايا معينة أمرا ضروريا لفهم وتفسير المعلومات الجينومية. يتم الحفاظ على الخميرة والثدييات ، ويمكن للبحث الأساسي تحسين استخدام الطرق المختلفة المطبقة على العلاجات والطب الحيوي. على الرغم من الكمية الكبيرة من البيانات الجينومية المتاحة حاليا ، إلا أن التعبير عن هذه المعلومات في الأنماط الظاهرية قد يكون خاصا بالخلية ويعتمد على معالجة الحمض النووي الريبي والربط. سيكون فهم التنظيم المعقد لهذه العملية ضروريا للبحث المستقبلي.