إعادة تشكيل العمارة الخلوية ووظيفة الأنسجة الظهارية البشرية على رقاقة عضو مفتوحة

Summary

يصف هذا البروتوكول القدرات وطرائق الاستزراع الأساسية لرقاقة الجهاز المفتوح من أجل الإنشاء الناجح ونضج مزارع الأعضاء على الرقاقة كاملة السماكة للأنسجة الأولية (الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والأمعاء) ، مما يوفر الفرصة للتحقيق في الجوانب الوظيفية المختلفة للواجهة الظهارية / الوسيطة والأوعية الدموية البشرية في المختبر.

Abstract

تصطف جميع الأعضاء البشرية تقريبا مع الأنسجة الظهارية ، التي تضم طبقة واحدة أو عدة طبقات من الخلايا المتصلة بإحكام منظمة في هياكل ثلاثية الأبعاد (3D). واحدة من الوظائف الرئيسية للظهارة هي تشكيل الحواجز التي تحمي الأنسجة السفلية ضد الإهانات الفيزيائية والكيميائية والعوامل المعدية. بالإضافة إلى ذلك ، تتوسط الظهارة في نقل العناصر الغذائية والهرمونات وجزيئات الإشارات الأخرى ، وغالبا ما تخلق تدرجات كيميائية حيوية توجه وضع الخلايا وتقسيمها داخل العضو. نظرا لدورها المركزي في تحديد بنية الأعضاء ووظيفتها ، تعد الظهارة أهدافا علاجية مهمة للعديد من الأمراض البشرية التي لا يتم التقاطها دائما بواسطة النماذج الحيوانية. إلى جانب الاختلافات الواضحة بين الأنواع ، فإن إجراء دراسات بحثية حول وظيفة الحاجز وخصائص نقل الظهارة في الحيوانات يتفاقم بسبب صعوبة الوصول إلى هذه الأنسجة في نظام حي. في حين أن ثقافات الخلايا البشرية ثنائية الأبعاد (2D) مفيدة للإجابة على الأسئلة العلمية الأساسية ، إلا أنها غالبا ما تسفر عن تنبؤات ضعيفة في الجسم الحي . للتغلب على هذه القيود ، في العقد الماضي ، ظهر عدد كبير من منصات المحاكاة الحيوية المهندسة بدقة ، والمعروفة باسم الأعضاء على رقاقة ، كبديل واعد للاختبارات التقليدية في المختبر والحيوانات. هنا ، نصف رقاقة الجهاز المفتوحة (أو رقاقة مفتوحة العلوي) ، وهي منصة مصممة لنمذجة الأنسجة الظهارية الخاصة بالأعضاء ، بما في ذلك الجلد والرئتين والأمعاء. توفر هذه الشريحة فرصا جديدة لإعادة تشكيل البنية متعددة الخلايا ووظيفة الأنسجة الظهارية ، بما في ذلك القدرة على إعادة إنشاء مكون انسجة 3D من خلال دمج الخلايا الليفية الخاصة بالأنسجة والخلايا البطانية داخل نظام نشط ميكانيكيا. توفر هذه الشريحة المفتوحة أداة غير مسبوقة لدراسة التفاعلات الظهارية / الوسيطة والأوعية الدموية على مستويات متعددة من الدقة ، من الخلايا المفردة إلى تركيبات الأنسجة متعددة الطبقات ، مما يسمح بالتشريح الجزيئي للحديث المتبادل بين الخلايا للأعضاء الظهارية في الصحة والمرض.

Introduction

تاريخيا ، اعتمد العلماء على الاختبارات قبل السريرية على الحيوانات لاكتشاف الأدوية ، ولكن تم التشكيك في عدد متزايد من هذه الطرق بسبب ضعف الارتباط بالنتيجة البشرية¹. إن تنفيذ مبادئ "3Rs" لاستبدال التجارب على الحيوانات وتقليلها وصقلها يحث العلماء على إيجاد طرق بديلة جديدة في المختبر لدعم تقييم مخاطر الأدوية والسموم الكيميائية قبل السريرية². ومع ذلك ، فإن العديد من النماذج المختبرية التي تم تطويرها حتى الآن تفتقر إلى البنية البيولوجية والتعقيد الخلوي والبيئة الميكانيكية اللازمة لتلخيص الطبيعة الديناميكية للأعضاء الحية البشرية ^3,4.

عادة ما تستخدم الأنظمة قبل السريرية التقليدية في المختبر زراعات أحادية 2D للخلايا البشرية المزروعة على سطح بلاستيكي صلب. توفر هذه الأساليب أداة لإجراء دراسات ميكانيكية بسيطة وتمكن من الفحص السريع للأدوية المرشحة. نظرا لتكلفتها المنخفضة نسبيا وقوتها العالية ، غالبا ما يتم إقران نماذج 2D بأنظمة أوتوماتيكية عالية الإنتاجية وتستخدم لتحديد سريع للأدوية المرشحة المحتملة خلال المرحلة المبكرة من عملية تطوير الأدوية ^5,6. ومع ذلك ، فإن نماذج 2D هذه لا توفر نهجا متعديا لنمذجة الاستجابات على مستوى الأنسجة أو على مستوى الأعضاء أو النظامية للمرشحين العلاجيين ، وهو أمر ضروري للتنبؤات الدقيقة بسلامة الأدوية وفعاليتها خلال المرحلة قبل السريرية من تطورها. لا تلخص مزارع الخلايا المسطحة البيئة المكروية للأنسجة الأصلية ، بما في ذلك التفاعل المعقد متعدد الخلايا ، والخصائص الميكانيكية الحيوية ، والبنية ثلاثية الأبعاد (3D) للأنسجة البشرية⁷. غالبا لا تكتسب الخلايا التي تنمو على سطح مستو نمطا ظاهريا ناضجا؛ ومن ثم لا يمكنها الاستجابة للمثيرات الدوائية كما تفعل في الأنسجة الأصلية. على سبيل المثال ، تظهر الخلايا الظهارية السنخية البشرية الأولية التي تنمو في المختبر نمطا ظاهريا حرشفيا وتفقد علامات النمط الظاهري الرئيسية ، بما في ذلك البروتينات الخافضة للتوتر السطحي C و B (SP-C و SP-B)⁸. بالإضافة إلى التمايز غير الكافي ، غالبا ما تصبح الخلايا الأولية غير حساسة للضغوط البيولوجية في المختبر ، حيث تصبح بعض المسارات الكيميائية الحيوية المرتبطة بالتهاب الأنسجة غير وظيفية⁹. يبدو أن هذا الفقدان لوظيفة الخلية يرتبط في المقام الأول باستخدام ركائز صلبة بالإضافة إلى نقص العوامل القابلة للذوبان التي تطلقها بشكل طبيعي الخلايا اللحمية الخاصة بالأنسجة مثل الخلايا الليفية الرئوية وخلايا العضلات الملساء^10,11.

إن فهم أن الافتقار إلى التعقيد الكيميائي الفيزيائي والبيولوجي يحد من السلوك الفسيولوجي للخلايا في المختبر قد عزز تطوير نماذج متعددة الخلايا أكثر تطورا ، والتي أثبتت أنها تلتقط بشكل أفضل تعقيد الأنسجة البشرية خارج الجسم^12,13. منذ إنشاء أول نماذج الثقافة المشتركة في أوائل سبعينيات القرن العشرين¹⁴ ، أدى إدخال الهلاميات المائية الاصطناعية والطبيعية إلى تحسين القدرة على تقليد البيئات الدقيقة للأنسجة الأصلية بشكل كبير وأصبح أداة لا تقدر بثمن لدفع التمايز الخلوي ، وتوجيه التنظيم الذاتي للخلايا إلى هياكل تشبه الأنسجة ، واستعادة وظائف الأنسجة الأصلية^15,16. على سبيل المثال ، عندما تزرع في سقالة 3D المناسبة ، يمكن للخلايا البشرية أن ترتب ذاتيا في هياكل وظيفية مثل الكرويات أو المواد العضوية ، معبرة عن علامات الخلايا الجذعية ، وتكون قادرة على التجديد الذاتي¹⁷. في المقابل ، فإن الخلايا البشرية (بما في ذلك الخلايا الجذعية) ، عندما تنمو على ركائز 2D التقليدية ، تتقدم في العمر بسرعة وتخضع للشيخوخة بعد بضع مقاطع¹⁸. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن "تخصيص" الهلاميات المائية لتتناسب مع خصائص الأنسجة المحددة مثل المسامية وحجم المسام وسمك الألياف ومرونة اللزوجة والتضاريس والصلابة أو هندستها بشكل أكبر مع المكونات الخلوية المشتقة من الأنسجة و / أو الجزيئات النشطة بيولوجيا التي تمكن من محاكاة الظروف الفسيولوجية أو المرضية^19,20. على الرغم من إمكاناتها الهائلة لاختبار الأدوية ، فإن النماذج القائمة على الهيدروجيل 3D المستخدمة في الأبحاث الصيدلانية لا تلخص بشكل كامل البنية الخلوية المعقدة للأنسجة في الجسم الحي وتفتقر إلى محفزات الدورة الدموية والميكانيكية المهمة الموجودة عادة في جسم الإنسان ، بما في ذلك الضغط الهيدروستاتيكي والتمدد الدوري وقص السوائل²¹.

ظهرت الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة (MPSs) مثل الأعضاء على الرقائق (OOCs) مؤخرا كأدوات قادرة على التقاط الاستجابات الفسيولوجية المعقدة في المختبر^22,23. غالبا ما تستخدم هذه النماذج استخدام منصات الموائع الدقيقة ، والتي تمكن من نمذجة البيئة المكروية الديناميكية للأعضاء الحية.

لقد جمعنا بين مبادئ الهندسة الحيوية للأنسجة 3D وعلم الأحياء الميكانيكي لإنشاء نموذج رقاقة مفتوح للأنسجة الظهارية البشرية المعقدة. سمح لنا ذلك بتلخيص البيئة المكروية متعددة الخلايا والديناميكية للأنسجة الظهارية عن كثب. وهذا يشمل الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية الحيوية الخاصة بالأنسجة الموجودة بشكل طبيعي في الأعضاء الحية ولكن غالبا ما يتم إهمالها من قبل النماذج التقليدية في المختبر ²⁴. تشتمل الرقاقة المفتوحة على جزأتين: حجرة وعائية (الشكل 1 أ) وحجرة انسجة (الشكل 1 ب) مفصولة بغشاء مسامي ، مما يسمح بنشر العناصر الغذائية بين الغرفتين (الشكل 1 ج). تتعرض حجرة الأوعية الدموية لتدفق مستمر للسوائل لتلخيص إجهاد القص الفسيولوجي ، بينما يسمح التصميم القابل للتمدد للغرفة اللحمية بنمذجة الإجهاد الميكانيكي المرتبط بحركات التنفس أو التمعج المعوي. تحتوي المقصورة اللحمية على سقالة هيدروجيل 3D القابلة للضبط المصممة لدعم النمو الفسيولوجي للخلايا الليفية الخاصة بالأنسجة. إنه يمتلك غطاء قابلا للإزالة يسهل إنشاء واجهة هوائية سائلة ، وهي حالة تسمح بمحاكاة أكبر لفسيولوجيا الإنسان للأنسجة المخاطية بالإضافة إلى الوصول المباشر إلى الأنسجة لإدارة الأدوية مباشرة على الطبقة الظهارية. يلتقط الشكل التكميلي 1 بعض المكونات الرئيسية لتصميم الرقاقة المفتوحة بما في ذلك الأبعاد والمقصورات البيولوجية (الشكل التكميلي 1A-D) بالإضافة إلى الخطوات الفنية الرئيسية الموضحة في هذا البروتوكول (الشكل التكميلي 1E).

يتم تحقيق نضح الرقاقة المفتوحة باستخدام مضخة تمعجية قابلة للبرمجة (الشكل 1 د). يسمح إعداد المضخة التمعجية بإدخال 12 شريحة مفتوحة في وقت واحد. يمكن لمعظم الحاضنات استيعاب إعدادين مما يتيح ثقافة ما يصل إلى 24 شريحة لكل حاضنة. يتم تحقيق التمدد الميكانيكي باستخدام منظم ضغط فراغ قابل للبرمجة حسب الطلب (الشكل 1E). يتكون من منظم فراغ كهربائي هوائي يتم التحكم فيه إلكترونيا بواسطة محول رقمي إلى تناظري. بمعنى آخر ، يقوم منظم الفراغ الكهربائي الهوائي بإنشاء ملف تعريف فراغ جيبي بسعة وتردد يحددهما المستخدم. يتم إنشاء سلالة دورية تتراوح من 0٪ إلى 15٪ عن طريق تطبيق ضغط سلبي على قناة الفراغ للرقاقة المفتوحة بسعة تتراوح من 0 إلى -90 كيلو باسكال وتردد 0.2 هرتز. إنه نظام مصمم خصيصا يعادل وحدة إجهاد Flexcell المتاحة تجاريا والتي تم اعتمادها ووصفها سابقا في أوراق أخرى²⁵. لتقليد تشوه الأنسجة الميكانيكية المرتبط ، على سبيل المثال ، بحركة التنفس في الرئة أو التمعج في الأمعاء ، يطبق المشغل الهوائي موجات الفراغ / الإجهاد الجيبية التي يمكن تعديل حجمها وسعتها لتتناسب مع المستوى الفسيولوجي للإجهاد والتردد الذي تختبره الخلايا البشرية في أنسجتها الأصلية.

هنا ، نصف طريقة فعالة وقابلة للتكرار لهندسة وزراعة مكافئات الظهارة العضوية على نموذج أولي لمنصة رقاقة Open-Top. يسمح بتوليد نماذج أعضاء معقدة مثل الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والقولون مع دمج تدفق السوائل الوعائية والتمدد الميكانيكي. سنحدد الجوانب الفنية الرئيسية التي يجب مراعاتها أثناء تنفيذ مبادئ هندسة الأنسجة لتوليد نماذج ظهارية معقدة. سنناقش المزايا والقيود المحتملة للتصميم الحالي.

تم الإبلاغ عن نظرة عامة على الخطوات الرئيسية المستخدمة لتحقيق نضج الأنسجة والأعضاء ، بما في ذلك معلمات التدفق والتمدد ، في: الشكل 2 للجلد ، الشكل 3 للحويصلات الهوائية ، الشكل 4 لمجرى الهواء ، والشكل 5 للأمعاء. وترد في الجداول التكميلية معلومات إضافية عن تكوين الوسائط والكواشف المستخدمة في استزراع نماذج الأعضاء المختلفة (الجدول التكميلي 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد). الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 3 لمجرى الهواء ، والجدول التكميلي 4 للأمعاء).

Protocol

تم الحصول على القولون البشري من استئصال الأمعاء وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة السلامة البيولوجية المؤسسية لمستشفى سينسيناتي للأطفال (IBC 2017-2011).

1. تنشيط السطح

1. إعداد المخزن المؤقت للتنشيط
   1. ضع الكواشف العازلة للربط المتشابك والمذيبات تحت خزانة السلامة البيولوجية (BSC) واتركها تتوازن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام.
   2. أعد تكوين 5 مجم من الرابط المتشابك في 5 مل من المخزن المؤقت للمذيب باستخدام حاوية معقمة منيعة للضوء أو أنبوب مخروطي شفاف سعة 15 مل ملفوف بورق الألمنيوم لحماية محلول الرابط المتشابك من التعرض المباشر للضوء.
   3. دوامة الحل لمدة 1 دقيقة لإزالة جميع الكتل ، ثم ماصة 50 ميكرولتر من محلول crosslinker مباشرة في القناة السفلية للرقاقة و 150 ميكرولتر في الغرفة المفتوحة.
   4. قم بإزالة أي فائض من محلول التشابك من سطح الشريحة باستخدام شفاط. ثم ماصة إضافية 50 ميكرولتر من محلول التشابك مباشرة في القناة السفلية للرقاقة و 150 ميكرولتر في الغرفة المفتوحة لإزالة أي فقاعة هواء متبقية.
2. التنشيط باستخدام آلة التشابك للأشعة فوق البنفسجية
   1. قم بإزالة الغطاء برفق من الشريحة الموجودة أسفل BSC وقم بتخزينه في حاوية معقمة.
   2. انقل الرقائق التي تحتوي على محلول التشابك إلى طبق بتري ، وأغلق طبق بتري لتجنب التلوث ، وضع الطبق مع الرقائق تحت آلة التشابك للأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: قم بإزالة غطاء طبق بتري لزيادة التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
   3. اضبط آلة التشابك للأشعة فوق البنفسجية بطول موجي ذروة يبلغ 365 نانومتر بكثافة 100 μJ / cm² ، وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: بعد 20 دقيقة من العلاج بالأشعة فوق البنفسجية ، سيبدو محلول التشابك أغمق (بني).
   4. أعد الرقائق إلى أسفل BSC واستنشق محلول التشابك المؤكسد. بعد ذلك ، اشطف جميع الرقائق ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت للمذيبات واترك الرقائق تجف تحت BSC لمدة 5-10 دقائق لإكمال الوظيفة الكيميائية لسطح polydimethylsiloxane (PDMS).

2. إعداد ما يعادل سدى

1. تحضير 10x عازلة لإعادة الإعمار (100 مل)
   1. قم بإذابة 2.2 جم من بيكربونات الصوديوم في 75 مل من 0.067 M NaOH في ماء مقطر مزدوج.
   2. أضف 4.76 جم من HEPES وارفع الحجم إلى 100 مل باستخدام الماء المقطر المزدوج.
   3. قم بتصفية المحلول المعقم تحت BSC باستخدام مرشح معقم أعلى الزجاجة يمكن التخلص منه بغشاء 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: المحلول مستقر لمدة 6 أشهر تقريبا عند تخزينه عند 4 درجات مئوية.
2. تقدير حجم محلول ما قبل الهلام
   1. اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 150 ميكرولتر (الحجم الداخلي للغرفة المركزية المفتوحة) لتقدير كمية محلول ما قبل الهلام المطلوب للتجربة:
      الحجم المطلوب = (عدد الرقائق × 150) ميكرولتر
   2. تحضير محلول الكولاجين قبل الهلام على الجليد عن طريق خلط: حجم واحد من 10x EMEM يحتوي على الخلايا المفضلة ، 1 حجم من 10x العازلة لإعادة البناء (انظر الخطوة 2.1) ، 8 مجلدات من محلول الكولاجين I (10 ملغ / مل) و 1 ميكرولتر من محلول 1 N NaOH لكل ملغ من الكولاجين I.
      ملاحظة: يوصى بإعداد حجم إضافي + 15٪ لحساب الأخطاء التجريبية ؛ يوفر المثال الموضح في القسم 2.2 إجراء تفصيليا خطوة بخطوة لإعداد ما يكفي من محلول ما قبل الهلام ل 12 شريحة وحجم إضافي بنسبة 15٪.
3. تحضير محلول ما قبل الهلام لمكافئ السدى (ل 12 رقائق)
   1. جلب الحلول التالية تحت BSC على الجليد: 10x EMEM ؛ 10x المخزن المؤقت لإعادة الإعمار (انظر الخطوة 2.1) ؛ محلول الكولاجين I (10 ملغ / مل) ؛ ومحلول معقم 1 N NaOH.
   2. زراعة خلايا اللحمة المتوسطة الخاصة بالأنسجة حسب توجيهات مقدمي الخدمة حتى 80٪ -90٪ متقاربة ، ثم فصل الخلايا باستخدام التربسين أو طرق أخرى على النحو الموصى به من قبل مزود الخلية. اجمع الخلايا في حبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 24 درجة مئوية.
   3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 225 ميكرولتر من الثلج البارد 10x EMEM ، وأضف 225 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة البناء 10x المثلج البارد (انظر الخطوة 2.1). امزج المحلول عن طريق سحب الإصبع برفق لأعلى ولأسفل ، ثم أضف 1800 ميكرولتر من محلول الكولاجين المثلج I.
   4. ماصة صعودا وهبوطا 5-6 مرات ، وتجنب الفقاعات لخلط محلول ما قبل الجل أثناء الثلج.
4. دمج مكافئ السدى على الرقاقة (ل 12 شريحة)
   1. تحييد محلول ما قبل الجل مع 18 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم. امزج بلطف عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل 5-6 مرات ، ثم ماصة 150 ميكرولتر من الهيدروجيل المحمل بالخلايا في الغرفة المركزية للشريحة المفتوحة لتجنب الفقاعات.
      ملاحظة: إذا كان النقش الدقيق مطلوبا ، فيرجى الانتقال إلى الخطوة التالية (القسم 3).
   2. قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة ، بما في ذلك غطاء أنبوب طرد مركزي مملوء ب 2 مل من ddH 2 O المعقم في كل طبق بتري ، واحتضان طبق (أطباق) بتري في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂.
      ملاحظة: بعد 90 دقيقة ، سيتم بلمرة الهيدروجيل المحمل بالخلايا بالكامل.

3. النقش الدقيق السطحي (اختياري)

1. قم بإجراء النقش الدقيق السطحي للهيدروجيل اللحمي بعد سحب هيدروجيل الكولاجين المحايد (لا يزال في حالته السائلة) باستخدام طوابع مطبوعة 3D.
   ملاحظة: يمكن الحصول على الطوابع المطبوعة 3D في مختلف التصاميم القابلة للتخصيص ، كما هو موضح سابقا في مكان آخر²⁴.
2. ماصة 20 ميكرولتر من محلول الكولاجين المحايد I pre-gel على السطح المنقوش لختم معقم مطبوع 3D وأدخل الختم داخل (في الأعلى) من الغرفة المفتوحة بينما لا يزال هيدروجيل اللحمية في شكل سائل.
3. قم بإزالة أي بقايا من الهيدروجيل قد تنسكب من أعلى الحجرة المفتوحة باستخدام شفاط (أو ماصة). قم بتجميع جميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة وقم بتضمين غطاء أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء ب 2 مل من ddH₂O المعقم في كل طبق بتري.
4. احتضن جميع أطباق بتري عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ لمدة 90 دقيقة ، ثم أعد الرقائق تحت BSC وقم بإزالة الطوابع برفق باستخدام ملاقط دقيقة لتقليل مخاطر إتلاف الهيدروجيل.

4. طلاء السطح الظهاري والأوعية الدموية ببروتينات ECM الخاصة بالأنسجة

1. طلاء غرفة الموائع الدقيقة الوعائية ببروتينات مصفوفة خارج الخلية
   1. اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 20 ميكرولتر (حجم القناة الوعائية) لتقدير حجم محلول طلاء ECM الوعائي المطلوب للتجربة:
      الحجم المطلوب = (عدد الرقائق × 20) ميكرولتر
      ملاحظة: يوصى بإعداد حجم إضافي بنسبة 15٪ لحساب الأخطاء التجريبية.
   2. قم بإعداد محلول طلاء ECM الوعائي لجميع الرقائق (على سبيل المثال ، 300 ميكرولتر لكل 12 شريحة) باستخدام برنامج تلفزيوني بارد أو HBSS.
      ملاحظة: ارجع إلى جدول بروتوكول الأعضاء المحدد في قسم المواد التكميلية (الجدول التكميلي 1 للبشرة; الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 2 لمجرى الهواء ، والجدول التكميلي 4 للأمعاء) لتحديد الكواشف المحددة وتكوين ECM الموصى به.
   3. ماصة 20 ميكرولتر من محلول طلاء ECM الوعائي في القناة الوعائية لكل شريحة.
2. طلاء السطح القمي للمكافئ اللحمي ببروتينات مصفوفة خارج الخلية
   1. اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 50 ميكرولتر (حجم القناة الوعائية) لتقدير حجم محلول طلاء ECM الظهاري المطلوب للتجربة:
      الحجم المطلوب = (عدد الرقائق × 50) ميكرولتر
      ملاحظة: يوصى بإعداد حجم إضافي بنسبة 15٪ لحساب الأخطاء التجريبية.
   2. قم بإعداد ما يكفي من محلول طلاء ECM لجميع الرقائق (على سبيل المثال ، 750 ميكرولتر لكل 12 شريحة) في PBS أو HBSS الباردة الجليدية ونقل 50 ميكرولتر من محلول طلاء ECM الظهاري مباشرة فوق سطح الهيدروجيل.
      ملاحظة: ارجع إلى جدول بروتوكول الأعضاء المحدد في قسم المواد التكميلية (الجدول التكميلي 1 للبشرة; الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 2 لمجرى الهواء ، والجدول التكميلي 4 للأمعاء) لتحديد الكواشف المحددة وتكوين ECM الموصى به.
   3. قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة ، بما في ذلك غطاء أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء ب 2 مل من ddH 2 O المعقم في كلطبق بتري ، واحتضان أطباق بتري في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ لمدة ساعتين قبل الشروع في بذر الخلايا الظهارية.

5. بذر الخلايا الظهارية على المكافئ اللحمي

1. ثقافة الخلايا الظهارية
   1. زراعة الخلايا الظهارية الخاصة بالأنسجة حسب توجيهات مقدمي الخدمة حتى 80٪ -90٪ متقاربة.
   2. فصل الخلايا باستخدام إجراءات الإنزيم المحلل للبروتين على النحو الموصى به من قبل مزود الخلية.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، احصد الخلايا الظهارية عند ممر منخفض (P1-P2) خلال مرحلة النمو النشط عندما تصل إلى التقاء يتراوح بين 70٪ -90٪.
   3. بمجرد الانفصال ، قم بطرد الخلايا وجمعها على شكل حبيبات.
   4. أعد تعليق الخلايا الظهارية إلى كثافة الخلية / الشظية المناسبة كما هو موضح في جدول بروتوكول العضو المحدد.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام محلول الخلايا بكثافة 3 × 10 6 خلايا / مل للجلد ، 1 × 10 6 خلايا / مل للحويصلات الهوائية ، 6 × 10 6 خلايا / مل لمجرى الهواء و 8 × 10 ⁶ شظايا / مل للأمعاء.
2. بذر الخلايا الظهارية
   1. نقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC. نضح محلول الطلاء من قناة الأوعية الدموية ، وشطف قناة الموائع الدقيقة الوعائية ثلاث مرات باستخدام 50 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا البطانية الطازجة.
   2. نضح محلول الطلاء من سطح الهيدروجيل وشطف السطح اللحمي ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الظهارية الطازجة لإزالة أي محلول طلاء زائد.
   3. نضح الوسط الصاعد وبذر سطح الهيدروجيل ب 50 ميكرولتر من تعليق الخلية الظهارية باستخدام كثافة الخلية المناسبة ، كما هو موضح في الجداول التكميلية ، ثم انقل الرقائق مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة 2 ساعة (أو بين عشية وضحاها للقولون).
   4. اشطف سطح الهيدروجيل برفق باستخدام وسط زراعة الخلايا مرتين لإزالة الحطام الخلوي. أخيرا ، قم بتحديث الوسيط عن طريق التعقيم في حاويات محكمة الغلق قابلة للتعقيم ، وقم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية.

6. توصيل الرقائق بالتدفق

1. تحضير الأجزاء السائلة
   1. قطع 2 بوصة من أنابيب نقل المطاط الصناعي الحراري (TPE) المتوافقة حيويا (جدول المواد) لإعداد أنابيب الموائع الدقيقة القصيرة المطلوبة لتوصيل الرقائق بخزانات الوسائط.
   2. قطع 7.5 بوصة من أنابيب نقل TPE المتوافقة حيويا لإنتاج أنابيب الموائع الدقيقة الطويلة.
   3. قم بإعداد ما يكفي من الموصلات المعدنية 18 جم و 19 جم (جدول المواد).
      ملاحظة: يوصى بإعداد وتعقيم الأنابيب والموصلات الموضحة في الخطوتين 6.1.1 و 6.1.2 قبل يوم واحد على الأقل من توصيل الرقائق المفتوحة بالمضخات التمعجية.
   4. اثقب غطاء كل خزان متوسط بإبرة تحت الجلد مقاس 4 بوصات (جدول المواد).
2. تفريغ متوسط
   1. اسمح لوسط زراعة الخلية بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT).
   2. انقل حجم الوسط المطلوب إلى أنبوب ترشيح مخروطي.
   3. قم بتطبيق ضغط فراغ سلبي يبلغ -20 رطل لكل بوصة مربعة لإزالة الغاز من الوسط (الترشيح المدفوع بالفراغ).
      ملاحظة: في حالة عدم توفر فراغ ، يمكن ترك وسط زراعة الخلايا للتوازن في الحاضنة طوال الليل لتحقيق نتائج مماثلة.
3. قم بإعداد الشريحة المفتوحة لتدفق السوائل
   1. ضع الرقائق والأجزاء السائلة المعقمة أسفل BSC وقم بمحاذاة الغطاء (الجزء العلوي) من الشريحة المفتوحة لإغلاق النموذج الأولي للشريحة المفتوحة قبل بدء تدفق السوائل.
   2. ماصة 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا المنزوعة الغازات (انظر الجداول الخاصة بالأعضاء) في منفذ مدخل كل من القنوات العلوية والسفلية للرقاقة مع الانتباه لتجنب الفقاعات.
   3. ماصة 300 ميكرولتر من وسط الاستزراع في أنابيب الموائع الدقيقة القصيرة لتجهيز السطح الداخلي للأنابيب وتوصيل الأنبوب القصير بمداخل القنوات العلوية والسفلية للرقاقة.
4. قم بتوصيل وتجهيز أسطح الموائع الدقيقة
   1. ضع الخزانات المتوسطة في رف المزرعة ، وقم بتوصيل الإبرة تحت الجلد بالمدخل السفلي للرقائق ، وأخيرا ، استوعب جميع الرقائق في حامل (ناقلات) الإسكان داخل الحاضنة.
   2. قم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية ، ثم افحص جميع الموصلات للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وأنه لا يوجد تسرب مرئي لوسائط زراعة الخلايا.
   3. استخدم زر التطهير الموجود على المضخة واحتفظ به لمدة 15 ثانية تقريبا أو حتى تظهر قطرات وسط زراعة الخلايا في نهاية أنبوب التدفق الخارجي.
   4. استخدم نظام التحكم في المضخة لضبط معدل تدفق رقاقة العضو المناسب (الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 والشكل 5).

7. صيانة الرقائق

1. صيانة رقاقة الجهاز
   1. تحضير وسط زراعة الخلايا الطازجة للظهارة و / أو البطانة وتنفيذ خطوات التفريغ (كما هو موضح سابقا في الخطوة 6.2).
   2. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل (ناقلات) غلاف الرقاقة. نقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC وإزالة حجم الوسائط المتبقية في الخزانات.
   3. استبدل وسائط زراعة الخلايا في خزانات المدخل العلوية والسفلية ب 5 مل من وسائط زراعة الخلايا الطازجة وضع حامل (ناقلات) غلاف الرقائق مرة أخرى في الحاضنة. قم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية وأعد تشغيل التدفق.
      ملاحظة: يوصى باستخدام وظيفة التطهير لتحديث الوسط بسرعة إلى حجرة الأوعية الدموية وتقليل خطر حدوث فقاعات هواء.
   4. كرر الخطوات 7.1.1-7.1.3 كل يومين ، كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 والشكل 5.
2. إنشاء واجهة الهواء والسائل (ALI)
   1. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل (ناقلات) غلاف الرقاقة. نقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية ، وإزالة حجم الوسط الأيسر في الخزان العلوي.
   2. قم بسحب كل الوسط برفق من قناة الموائع الدقيقة العلوية وقم بتثبيت أنبوب الموائع الدقيقة القصير المتصل بالمداخل العلوية باستخدام مشابك الموثق لتقليل تبخر الوسائط وصيانة ALI.
   3. ضع الشريحة المفتوحة على حامل (حاملات) الإسكان مرة أخرى في الحاضنة وأعد توصيل الرقائق بالمضخة التمعجية.
      ملاحظة: يوصى باستخدام وظيفة التطهير لتحديث الوسط بسرعة إلى حجرة الأوعية الدموية وتقليل خطر حدوث فقاعات هواء.
   4. استئناف التدفق عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.
3. تمتد (اختياري)
   1. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا وقم بتوصيل منافذ تفريغ الرقائق بوحدة التفريغ باستخدام أنبوبين طويلين من الموائع الدقيقة لكل شريحة.
   2. استخدم وحدة التفريغ لضبط إعداد التمدد على الحالة الموصى بها لكل عضو كما هو محدد داخل جداول بروتوكول الجهاز: الجدول التكميلي 1 للبشرة. الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 2 لمجرى الهواء؛ والجدول التكميلي 4 للأمعاء.
   3. افحص توصيلات الأنبوب بصريا للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وعدم وجود قطرات مرئية من التنقيط المتوسط.
   4. استئناف التدفق عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.

8. بذر الخلايا البطانية في حجرة الأوعية الدموية

1. تحضير الخلايا والرقائق لبذر الخلايا الوعائية
   1. استزراع الخلايا البطانية الخاصة بالأنسجة حسب توجيهات مقدمي الخدمة حتى 80٪ -90٪ متقاربة. فصل الخلايا باستخدام إجراء إنزيم محلل للبروتين (على النحو الموصى به من قبل المزود) ، وأخيرا ، أعد تعليق الخلايا البطانية في محلول 3 × 10⁶ خلايا / مل.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، احصد الخلايا البطانية عند ممر منخفض (P2-P4) خلال مرحلة النمو النشط عندما تصل إلى التقاء يتراوح بين 70٪ -90٪.
   2. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا. انقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC ، وافصل الرقائق عن خزانات الوسائط وأي أنابيب متصلة ، ثم قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة.
   3. قم بتحديث وسط زراعة الخلايا في المقصورة الظهارية بوسط زراعة الخلايا الظهارية الطازجة. شطف قناة الأوعية الدموية مع زراعة خلايا البطانة الطازجة المتوسطة مرتين ، ثم استنشاق الوسط من حجرة الأوعية الدموية.
2. بذر الخلايا البطانية
   1. قم بزرع القناة السفلية (الوعائية) ب 25 ميكرولتر من تعليق الخلايا البطانية (3 × 10⁶ خلايا / مل) ، واقلب الرقائق رأسا على عقب للسماح للخلايا البطانية بالالتصاق بالسطح العلوي لغرفة الموائع الدقيقة.
      ملاحظة: أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل شريحة (600 ميكرولتر لكل 12 شريحة).
   2. ضع الرقائق في أطباق بتري. ضعها مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO_{2 ،} واترك الخلايا البطانية تلتصق لمدة 1 ساعة.
   3. بعد 1 ساعة ، انقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC. شطف قناة الأوعية الدموية مع وسط زراعة الخلايا البطانية مرتين لإزالة الحطام الخلوي.
   4. كرر الخطوات 8.2.1-8.2.2 لزرع القناة الوعائية مرة أخرى بالخلايا البطانية ووضع الرقائق بشكل مسطح لتسهيل التصاق الخلايا البطانية بالسطح السفلي للقناة الوعائية.
3. أعد توصيل الشريحة بالتدفق
   1. املأ خزان الوسط الوعائي بوسط زراعة الخلايا الوعائية المفرغة تحت BSC.
   2. ضع الرقائق مرة أخرى داخل حامل (حاملات) غلاف الرقائق وأعد توصيل الرقائق بالخزانات المتوسطة في أحد طرفيها بالمضخة التمعجية على الطرف الآخر.
      ملاحظة: يوصى باستخدام وظيفة التطهير لتحديث الوسط بسرعة إلى حجرة الأوعية الدموية وتقليل خطر حدوث فقاعات هواء.
   3. افحص بصريا وصلات الموائع الدقيقة للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وعدم وجود قطرات مرئية من التنقيط المتوسط. بعد ذلك ، استأنف تدفق السوائل عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.

9. مقايسات نقطة النهاية الشائعة

1. افصل الرقائق لفحوصات نقطة النهاية
   1. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل (ناقلات) غلاف الرقاقة. انقل حامل (حاملات) غلاف الرقائق من الحاضنة إلى BSC واضبط الرقائق مجانا.
   2. اغسل برفق الحجرة المركزية للرقاقة المفتوحة باستخدام وسط زراعة الخلايا الظهارية والقناة الوعائية باستخدام وسط زراعة البطانة مرتين لإزالة أي حطام خلوي.
   3. قم بإزالة غطاء الشريحة المفتوحة للوصول إلى المقصورة القمية للشريحة باستخدام الملقط.
2. تلطيخ مناعي للفحص المجهري الفلوري
   1. تابع تثبيت العينات التقليدية والنفاذية والحظر.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم تثبيت العينات في 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) لمدة 1 ساعة متبوعة بالشطف باستخدام PBS ، والنفاذية في 0.1٪ Triton X-100 لمدة 40 دقيقة والحجب في 1٪ من ألبومين مصل الأبقار لمدة 1 ساعة.
   2. احتضان الرقائق بالأجسام المضادة الأولية (جدول المواد) عند 4 درجات مئوية طوال الليل. ثم اغسل كل من المقصورات الظهارية والبطانية للرقائق ب 200 ميكرولتر من PBS مرتين. ثم ، تابع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية في PBS + 1٪ BSA بتخفيف 1: 100 (الجسم المضاد الأساسي) و 1: 200 (الجسم المضاد الثانوي).
3. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
   1. استخرج المكافئات اللحمية من الغرفة الرئيسية للرقاقة المفتوحة باستخدام ملاقط ، واجمعها في أنبوب سعة 1.5 مل مملوء بالفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ واحتضانها لمدة 24 ساعة على الأقل.
   2. انقل المكافئ اللحمي الثابت إلى معالج الأنسجة واتبع الخطوات التالية لتحقيق الجفاف الأمثل للعينة.
      1. اغمر الهيدروجيل في 70٪ إيثانول لمدة 90 دقيقة.
      2. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 70٪ واغمر الهيدروجيل في 80٪ إيثانول لمدة 90 دقيقة.
      3. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 80٪ واغمر الهيدروجيل في 95٪ إيثانول لمدة 90 دقيقة.
      4. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 95٪ واغمر الهيدروجيل في إيثانول 100٪ لمدة 90 دقيقة مرتين.
      5. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 100٪ واغمر الهيدروجيل في محلول من الزيلين لمدة 120 دقيقة مرتين.
      6. قم بإزالة محلول الزيلين وتسلل إلى مكافئات اللحمة المعالجة في شمع البارافين لمدة 120 دقيقة (~ 2 ساعة) مرتين.
   3. قم بتضمين مكافئات اللحمة المتسللة في كتل البارافين المقسمة.
   4. في هذه المرحلة ، يمكن تقسيم المكافئات اللحمية ككتل بارافين باستخدام ميكروتوم ومعالجتها وفقا للتقنيات النسيجية التقليدية²⁶.

Results

النقش الدقيق السطحي
يمكن استخدام التنميط الدقيق للمصفوفة خارج الخلية (ECM) لتكرار التكوين المكاني لواجهة القبو المعوي. يمكن تعديل تكوين رقاقة Open-Top لدمج الطوابع الدقيقة المصممة خصيصا لتقليد التضاريس الطبيعية لواجهة سدى ظهارة القولون (الشكل 6A ، B) والخبايا المعوية بمقياس ميكرومتر (الشكل 6C-E). يرجى ملاحظة أننا استخدمنا سطحا مستويا (غير منقوش) لنماذج الجلد ومجرى الهواء والحويصلات الهوائية. ...

Discussion

تمثل رقاقة Open-Top منصة تمكينية للتحقيق في التفاعل الخلوي المعقد الذي يحدث بين البطانة والسدى والظهارة في بيئة دقيقة خاضعة للرقابة ، في الوقت الفعلي. توفر هذه التقنية مزايا حاسمة على الثقافات العضوية والعضوية التقليدية ، مثل دمج الإشارات الفيزيائية والكيميائية الحيوية ذات الصلة بإعادة تكوين البيئة المكروية للأنسجة البشرية ، بما في ذلك القص السائل (التدفق) ، والتمدد الدوري ، وإعادة بناء تضاريس السطح الظهاري التي تتحقق عن طريق التنميط المجهري. تعمل الخلايا البشرية التي تنمو داخل هذه المنصة في تآزر لتلخيص الوظائف ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x EMEM	لونزا	12-684F	متوسطة. Stroma
18 مقياس إبرة	MicroGroup	316H18RW	أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ 316 ملحومة ، 18RW Full Hard   ؛
19 إبرة قياس	MicroGroup	316H19RW	أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ 316 ملحومة ، 19RW كامل الصلب
2-توقف PharMed BPT & nbsp ؛	كول بالمر	أنبوب EW-95723-12	، 0.25 مم ، 12 / عبوة
70٪ إيثانول ومناديل مبللة ؛	-	-	للتعقيم السطحي
8-بروموأدينوزين 3 & prime ؛ 5 & prime ؛ - ملح الصوديوم أحادي الفوسفات الدوري (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	مكمل متوسط   ؛
أ-83-01	Tocris	2939
الأدينين	سيجما	A9795
المتقدم DMEM/F12		الهواء الظهارية
	تقنية خلية شريان الحياة	FC-0016
رقائق الألومنيوم   ؛	-	-	-
الخلايا السنخية	الخلايا البيولوجية	H6621
المضادة ABCA3   ؛	ABCAM	ab24751	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر [3C9]
مضاد أكوابورين5 أليكسا فلور 647   ؛	ABCAM	ab215225	الجسم المضاد أحادي النسيلة للأرانب [EPR3747]
مضاد أكوابورين5	ABCAM	ab92320	الجسم المضاد أحادي النسيلة للأرانب [EPR3747]
مضاد بيتا IV Tubulin	ABCAM	ab11315	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر [ONS.1A6]
مضاد CD31 (PECAM-1)	ABCAM	ab9498	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر [JC / 70A]
مكافحة CK5   ؛	ABCAM	ab75869	الأرانب أحادية النسيلة المؤتلفة [AY1E6]
مضاد للسيتوكيراتين 10   ؛	ThermoFisher	MA5-13705	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر (DE-K10)
مضاد للسيتوكيراتين 14   ؛	ABCAM	ab7800	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر
مكافحة E Cadherin	ABCAM	ab1416	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر
مكافحة Filaggrin	ThermoFisher	PA5-79267	الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب
مضاد لهاتف هي-56	تراس للتكنولوجيا الحيوية	TB-29AHT1-56	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر (IgG1)
مكافحة HTII-280	تراس للتكنولوجيا الحيوية	TB-27AHT2-280	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر (IgM)
مضاد للإنفولوكرين	ThermoFisher	MA5-11803	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر (SY5)
مضاد للأشكال الإسوية TA p63-α, -β, -& gamma;	Biolengend	618902	الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب
مكافحة Ki67	ABCAM	ab8191	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر [B126.1]
مكافحة LAMP3	ABCAM	ab111090	الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب
مضاد للنضج SP-B	سيفن هيل	WRAB-48604	الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب
مكافحة MUC5AC	ThermoFisher	PA5-34612	الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب
مضاد للميوسين-2	سانتا كروز بيوتكنولوجي	sc-7314	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر (IgG1)
مكافحة p63	Dako	GA662	بروتين الأجسام المضادة أحادية النسيلة p63 للفأر (Dako Omnis)  استنساخ DAK-p63
مكافحة PCNA	ThermoFisher	PA5-32541	الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب
مضاد بودوبلانين (AT-1 α)	ABCAM	ab128994	الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب
Anti-Pro + البروتين الخافض للتوتر السطحي الناضج B & nbsp ؛	ABCAM	ab40876	الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب
مضاد للتوتر السطحي C & nbsp ؛	سيفن هيل	WRAB-9337	الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب
مضاد للتوتريوغلوبين / SCGB1A1	Hycult Biotech	HM2178	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر [AY1E6]
مكافحة VE-cadherin	ABCAM	ab33168	الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب
مكافحة ZO-1	ThermoFisher	33-9100	الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر [1A12]
حمض الأسكوربيك	Sigma	A4544
ماصات شفاقت	كورنينج / فالكون	357558	2 مل ، بوليسترين ، ملفوفة بشكل فردي   ؛
نصائح الشفاطة	-	-	معقمة (معقمة تعقيمة)   ؛
B27	Thermo	17504044
Blocker BSA (10X) في حل PBS   ؛	ThermoFisher	37525	عامل المانع
كلوريد الكالسيوم	سيجما	C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Collagen I	Advanced Biomatrix	5133	10 مجم / مل (سدى)
الكولاجين I & nbsp ؛	Advanced BioMatrix	5005	3 مجم / مل (ECM للأوعية الدموية)
الكولاجين IV	سيجما	؛ C5533
الكولاجين الرابع	سيجما	C5533-5MG	الكولاجين من المشيمة البشرية ، مسحوق 5 مجم ، يعيد تكوينه إلى 1 مجم / مل & nbsp ؛
الخلايا الليفية القولونية	Cell Biologics	H6231
الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة القولونية	الخلية البيولوجية	H6203
أنابيب مخروطية	-	-	15 مل و 50 مل   ؛ البولي بروبيلين ، معقمة   ؛
Crosslinker (ER-1)	المحاكاة	10461	5 مجم بودرة
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571	مسبار الحمض النووي
الخلايا الليفية الجلدية	ATCC	PCS-201-010
الخلايا البطانية الجلدية للأوعية الدموية الدقيقة	ATCC	CRL-3243
ديكساميثازون	سيجما	D4902
DMEM	ThermoFisher	11054020
DMEM / F-12   ؛	GIBCO	11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX	GIBCO	10565-018	الوسط القاعدي ل ALI متوسط
الحمار المضاد للفأر IgG H& L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150105	الحمار المضاد للفأر المضاد الثانوي
الحمار المضاد للفأر IgG H& L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175472	الحمار المضاد للفأر المضاد الثانوي
الحمار المضاد للفأر IgG H& L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150107	الحمار المضاد للفأر المضاد الثانوي
الحمار المضاد للأرانب IgG H& L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150073	الحمار المضاد للفأر المضاد الثانوي
الحمار المضاد للأرانب IgG H& L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175470	الحمار المضاد للفأر المضاد الثانوي
الحمار المضاد للأرانب IgG H& L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150075	الحمار المضاد للفأر المضاد الثانوي
دولبيكو s PBS (DPBS-/-) (بدون Ca2+, Mg2+)	كورنينج	21-031-السيرة الذاتية	1x
عامل نمو البشرة (EGF) الإنسان, مؤتلف في بكتريا قولونية	PromoCell	C-60170	الملحق المتوسط
إف-12 هام s	Invitrogen	21700-108	لوحدة التحكم في إدارة الطبيعة للأوعية
الدموية FibriCol	Advanced BioMatrix	5133-20ML	محلول الكولاجين I (10 مجم / مل)
فيبرونيكتين	كورنينج	356008
فيبرونكتين ، إنسان ، طبيعي ،   ؛	كورنينج	47743-654	فيبرونكتين البلازما البشرية
ملاقط دقيقة الطرف	Aven	18056USA	ملاقط Technik Style 5B-SA الدقة من الفولاذ المقاوم
Glutamax	Invitrogen	21700-108
Glutamax	Invitrogen	35050061
الماعز المضادة للفأر IgG H& L (Alexa Fluor 594)	ABCAM	ab150080	الماعز المضاد المضاد للفأر الثانوي
الماعز المضادة للفأر IgG H& L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150115	الماعز المضاد المضاد للفأر الثانوي
الماعز المضادة للفأر IgG H& L (FITC)	ABCAM	ab6785	الماعز المضاد المضاد للفأر الثانوي
الماعز المضادة للفأر IgG1 Alexa Fluor 568	ThermoFisher	أ-21124	الماعز المضاد للفأر IgG1 الجسم المضاد الثانوي
الماعز المضاد للفأر IgM Alexa Fluor 488	ThermoFisher	أ-21042	الماعز المضاد للفأر IgM المضاد الثانوي
شفاط فراغ محمول باليد	كورنينج	4930	-
مصل HyClone FetalClone II المعطل بالحرارة (FCS)	GE Healthcare Life	Sciences SH30066.03
مقياس الدم	-	-	-
ملح الصوديوم الهيبارين من الغشاء المخاطي المعوي للخنازير	Sigma	H3149
HEPES	Thermo	15630080
الإنسان [Leu15] - Gastrin	Sigma	G9145
القولون البشري	التي تم الحصول عليها من الاستئصال		تم الحصول عليها من الاستئصال
السريري بروتين مؤتلف EGF البشري   ؛	Thermo	PHG0311L
عامل النمو الظهاري البشري	Thermo	PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (الولايات المتحدة)	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	SH30066.02مرحبا	معقم FBS  تعطيل الحرارة
هيدروكورتيزون 21-هيميسوكسينات ملح الصوديوم	سيجما	H4881
هيدروكورتيزون	PromoCell	C-64420	مكمل غذائي متوسط
دلو الثلج	-	-	-
Ismatec IPC-N	كول بالمر	EW-78000-41	مضخة التمعجية الرقمية منخفضة السرعة ؛ q24-Channel (1 لكل 12 رقاقة)
ITES	BioWhittaker	17-839Z
عامل نمو الخلايا الكيراتينية (KGF) ، المعروف أيضا باسم عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي 7 (FGF-7) ، إنسان ، مؤتلف في HEK	PromoCell	C-63821
الخلايا الكيراتينية	ATCC	PCS-200-010
Laminin   ؛	بيولامينا	CT521-0501
Laminin, 521 CTG (CT521)	Biolamina	CT521-0501	لامينين مؤتلف بشري 521
خلايا	الخلايا الليفية الليفية للرئة	H6013
تكنولوجيا خلايا شريان الحياة	للأرومات الليفية الرئة	FC-0049
الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الرئة	Lonza	CC-2527
خلايا العضلات الملساء الرئوية	شريان الحياة تكنولوجيا	خلايا شريان الحياة FC-0046
عداد يدوي   ؛	-	-	-
أنابيب نقل Masterflex (TPE)	كول بالمر	FV-96880-02	PharMed BPT ، 1/32 "معرف × 5/32" OD
متوسط 199 ، لا يوجد فينول أحمر	Thermo   ؛	11043023
أنبوب الطرد المركزي الدقيق	-	-	1.5 مل ، معقمة   ؛
مجهر (مع كاميرا)	-	-	للتصوير في المجال الساطع
N2	سيجما	17502001
N-acetyl سيستين	سيجما	A5099
Noggin (HEK293T وسط مكيف)	سيجما	N17001
مصل الماعز العادي	ThermoFisher	50062Z	حل الحظر
O-phosphosrylethanolamine	سيجما	P0503
بارافورمالدهيد (4٪ بالوزن / الحجم)   ؛	EMS	15710	عامل التثبيت
البنسلين ستربتومايسين	جيبكو	15140122
البنسلين ستربتومايسين   ؛	سيجما	P4333	10,000 وحدة / مل ؛ 10 مجم / مل   ؛
أطراف الماصة	-	-	P20 و P200 و P1000   ؛ ماصة معقمة منخفضة الالتصاق
	جيلسون	F167380	P20 و P200 و P1000   ؛
استبدال مصل PluriQ (أو بدلا من ذلك استبدال مصل KO)	AMSBIO (أو Thermo)	N / A (أو C1910828010) شرائح
زجاجية مطلية بالمجهر Poly-L-Lysine   ؛	سيجما	P0425	شرائح زجاجية
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Progesterone	Sigma	P8783
ProLong Gold	ThermoFisher	P36931	مضاد للبهتان مع DAPI
حمض الريتينويك	مثبط الصخور Sigma	R2625
(Y27632)	Tocris	TB1254-GMP / 10
R-spondin (وسط مكيف HEK293T)	Sigma	SCC111
SAGM SingleQuots	Lonza	CC-4124
SAGMTM متوسط نمو الخلايا الظهارية لمجرى الهواء الصغير BulletKitTM	Lonza	CC-4124	المكملات الغذائية المتوسطة
SB2001190	Tocris	1264/10
الماصات المصلية	-	-	2 مل ، 5 مل ، 10 مل ، و 25 مل سموم داخلية منخفضة ، معقمة   ؛
وسط نمو الخلايا الظهارية لمجرى الهواء الصغير (SAGM) Lonza		CC-4124
عازلة المذيبات (ER-2)	المحاكاة	10462	زجاجة 25 مل
Steriflip-HV	Millipore	SE1M003M00	أنبوب مخروطي ترشيح معقم
Sterilin 100 مم أطباق بتري مربعة	Thermo	103	معقمة ، 1 لكل 6 رقائق   ؛
قوارير T25	-	-	-
قوارير T75	-	-	-
ثلاثي يودوثيرونين	سيجما	T5516
تريتون X-100 (0.3٪ (حجم / حجم)	سيجما	T8787	عامل النفاذ
تريبان أزرق	سيجما	93595	0.4٪ حل
حل TrypEE	سيجما	12604013	حل فصل الخلية
TWEEN-20	سيجما	P2287	عامل النفاذ
فرن ضوء الأشعة فوق البنفسجية (ذروة التردد 365 نانومتر ، شدة 100 وميكرو ؛ J / cm< font class = "font6" >2< / sup>< / font >< class = "font5" >) < / font >	VWR	21474-598	UVP ، طويلة المدى للأشعة فوق البنفسجية ، 365 نانومتر 60 هرتز موديل CL-1000L
إعداد الفراغ   ؛	-	-	الحد الأدنى للضغط: -70 كيلو باسكال
عامل النمو البطاني الوعائي 165 (VEGF-165) الإنسان, مؤتلف في بكتريا قولونية	PromoCell	C-64420
VEGF-165	PromoCell	C-64420	مكمل غذائي متوسط
فون ويلبراند فاكتور مترافق FITC   ؛	ABCAM	ab8822	الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأغنام
حمام مائي (أو خرز)	-	-	ضبط على 37 درجة ؛ ج
Wnt3A (L-Wnt3A وسط مكيف)	ATCC	CRL-2647