$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يتميز التطور بالتغيير الديناميكي للهياكل على مستويات العضيات والخلايا والأعضاء. إن قدرة التصوير بفاصل زمني على جمع معلومات رباعية الأبعاد من نفس الهيكل في حالته الفسيولوجية تجعله تقنية مثالية لدراسة العملية الديناميكية للتطور1،2،3،4،5،6. تتيح الكمية الهائلة من البيانات التي تم جمعها من خلال التصوير المباشر أيضا التحليل الكمي للتنمية. على الرغم من أن التصوير بفاصل زمني قد استخدم على نطاق واسع لزراعة الخلايا أحادية الطبقة ، إلا أن تصوير الأنسجة الحية أو ثلاثية الأبعاد يمثل تحديا أكبر بسبب الصعوبات التقنية ، مثل تشتت الضوء للأنسجة الحية ، وتطوير استراتيجية تركيب مناسبة وطريقة وضع العلامات ، والحفاظ على الحالة الفسيولوجية الطبيعية خلال فترة تصوير واسعة النطاق ، وإمكانية الوصول إلى مجهر مناسب ، الخ. تقيد هذه التحديات استخدام التصوير الحي في العديد من المختبرات. في مجموعة الطرق هذه ، أبلغت سبع أوراق عن طرق جديدة لإعداد العينات الحية ، ووضع العلامات ، والتلاعب بالليزر. كل هذه الطرق تسهل التصوير المباشر لعمليات النمو من زوايا مختلفة.
يعد التصوير المباشر للمناطق العميقة تحديا تقنيا بسبب التشتت القوي للأنسجة الحية. يمكن تقليل هذا التشتت عن طريق التعرض للأعضاء الداخلية من خلال التشريح ، وبالتالي تحسين الدقة المكانية للصور. في هذه المجموعة ، وصف Januschke و Loyer7 بروتوكولا لتشريح أدمغة يرقات ذبابة الفاكهة وطريقة تصاعد باستخدام جلطات الفيبرين. سمحت استراتيجية التركيب هذه بالتصوير بفاصل زمني باستخدام مجاهر مقلوبة لعينات متعددة على نفس الطبق لأنها تتطلب فقط إضافة الفيبرينوجين والثرومبين. قدم لي ولوه8 بروتوكولا لتشريح مستخرج الهوائيات والدماغ من شرانق الذباب وحالة ثقافة خارج الجسم الحي حافظت على التطور الطبيعي للدائرة الشمية لمدة 24 ساعة. مكن نظامهم من تصور الاستهداف المحوري والتغصني في تجميع دائرة حاسة الشم من حالتها الفسيولوجية. نظام الإزالة هذا مناسب للمجهر ثنائي الفوتون والمجهر الضوئي الشبكي مع التصوير البصري التكيفي ، مما يسمح بالتصوير المستمر على المدى الطويل والتصوير السريع بدقة زمانية مكانية عالية في فترة زمنية قصيرة. طور Schramm et al.9 إجراء جراحيا طفيف التوغل لإزالة الجلد وغضروف الجمجمة الرخو لسمك الزرد من خلال التقشير الدقيق. سمح لهم ذلك بمراقبة بعض الأحداث الرئيسية في مراحل النمو اللاحقة ، بما في ذلك التمايز العصبي ، والنضج ، واللدونة ، و Ca2+ العابر لمدة تصل إلى 30 يوما بعد الإخصاب. كما سمح لهم بإجراء تصوير مباشر بعد تصبغ جلود يرقات الزرد. بالإضافة إلى التشريح ، يعد التركيب المناسب للعينات أمرا بالغ الأهمية أيضا للتصوير الحي. قدم Ratke et al.10 إطارا تجريبيا للتصوير الحي المتزامن لأجنة الذباب المتعددة باستخدام الفحص المجهري للصفائح الضوئية. زاد هذا البروتوكول من الإنتاجية الإجمالية وهو مثالي للدراسة المقارنة.
بالإضافة إلى تحضير العينة ، تسهل طرق وضع العلامات الجديدة تصور هياكل معينة في الأنسجة الحية. أبلغ Terzi et al.11 عن مستشعر حيوي خاص ب H2O2 مشفر وراثيا ، roGFP2-Orp1 ، لتصوير مستويات H2O2 داخل الخلايا من الخلايا العصبية المزروعة واليرقات الكاملة أثناء التطور. كانت إحدى الميزات المهمة لهذا المستشعر الحيوي H2O2 المشفر وراثيا هي تحسين الدقة الزمنية والمكانية للكشف عن H2O2 . وصفت دراسة أخرى من Mutlu et al.12 الفحص المجهري المحفز لتشتت رامان (SRS) ، وهي طريقة تصوير كيميائي خالية من الملصقات للكشف السريع والكمي عن الدهون في الخلايا الحية بدقة تحت الخلية. يتم فقد كل من H2O2 والدهون بسهولة أثناء تثبيت العينة. لم يتحايل تطوير طرق وضع العلامات أو التصوير في الأنسجة الحية على هذا التحدي فحسب ، بل احتفظ أيضا بالمعلومات المكانية والزمانية لهذه الهياكل في العمليات البيولوجية.
أخيرا ، يمكن أيضا استخدام الضوء لاستئصال الخلية. أظهر Boutillon et al.13 طريقة لاستئصال الأحجام العميقة والمحددة مكانيا في أسماك الزرد باستخدام مجهر ثنائي الفوتون. بالمقارنة مع استئصال الخلايا القائم على الليزر فوق البنفسجي ، أدى الليزر ثنائي الفوتون إلى تحسين الدقة المحورية وتغلغل الأنسجة. قدم هذا البروتوكول استراتيجية اضطراب لدراسة تفاعل الخلية والخلية أثناء التطور.
سمح لنا تقدم التقنيات المجهرية بفهم العديد من العمليات التنموية في أربعة أبعاد. ستساعد البروتوكولات في هذه المجموعة المزيد من العلماء على التغلب على الحاجز التقني للتصوير الحي في الأنظمة البيولوجية المختلفة. نتوقع تطوير المزيد من الأساليب التي تسهل التصوير الحي في المستقبل.